Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
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Die Autoren danken Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Abteilung für Augenheilkunde) für die Bereitstellung von gereinigtem AAV-3. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health und dem National Cancer Institute unterstützt (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 an D.F.K.).

1. Beladung des Probenhalters für Flüssig-EM
<ol><li>Reinigen Sie die Siliziumnitrid (SiN)-Mikrochips, indem Sie jeden Chip in 150 ml Aceton für 2 min inkubieren, gefolgt von einer Inkubation in 150 ml Methanol für 2 min. Lassen Sie die Späne im laminaren Luftstrom trocknen.</li>
	<li>Plasmareinigung der getrockneten Späne mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen von 30 W, 15 mA für 45 s mit Argongas betrieben wird.</li>
	<li>Legen Sie einen Mikrochip mit trockener Basi...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

Es werden neue Möglichkeiten zur Optimierung der aktuellen Liquid-EM-Arbeitsabläufe durch den Einsatz neuer automatisierter Tools und Technologien aus dem Kryo-EM-Bereich eröffnet. Anwendungen mit der neuen Mikrochip-Sandwichtechnik sind im Vergleich zu anderen Methoden von Bedeutung, da sie eine hochauflösende bildgebende Analyse in flüssigem oder glasigem Eis ermöglichen. Einer der kritischsten Schritte im Protokoll ist die Herstellung von Proben mit der idealen Flüssigkeitsdicke, um exquisite Details auf Nanoeb...

Biomedizinische Forschung verbessert unser Verständnis von menschlicher Gesundheit und Krankheit durch die Entwicklung neuer Technologien. Hochauflösende Bildgebung verändert unseren Blick auf die Nanowelt - und ermöglicht es uns, Zellen und Moleküle in exquisiten Details zu untersuchen 1,2,3,4,5. Statische Informationen dynamischer Komponenten wie weicher Polymere, Proteinanordnungen oder menschlicher Viren zeigen nur eine begrenzte Momentaufnahme ihrer komplexen Erzählung. Um besser zu verstehen, wie molekulare Einheiten funktionieren, müssen ihre Struktur und Funktion gemeinsam untersucht werden.
Jüngste Fortschritte bei der Herstellung von Materialien wie atomar dünnem Graphen oder siliziumbasierten Mikrochips bieten neue Möglichkeiten für die Echtzeit-Strukturfunktionsanalyse mit Transmissionselektronenmikroskopen (TEMs). Diese Materialien können hermetisch abgeschlossene Kammern für die Live-EM-Bildgebung 6,7,8,9,10,11 erzeugen. Das neue Feld der Flüssig-EM, die Raumtemperatur korreliert mit Kryo-EM, bietet beispiellose Ansichten von harten oder weichen Materialien in Lösung, so dass Wissenschaftler gleichzeitig die Struktur und Dynamik ihrer Probe untersuchen können. Flüssig-EM-Anwendungen umfassen Echtzeitaufnahmen von therapeutischen Nanopartikeln, die mit Krebsstammzellen interagieren, sowie Veränderungen in den molekularen Feinheiten viraler Krankheitserreger12,13,14.
So wie methodische Fortschritte die Auflösungsrevolution im Kryo-EM-Bereich vorangetrieben haben, sind neue Techniken und Methoden erforderlich, um den Einsatz von Flüssig-EM als Hochdurchsatzwerkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft zu erweitern. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Protokolle zur Vorbereitung von Flüssig-EM-Proben zu rationalisieren. Der Grund für die entwickelten Techniken ist der Einsatz neuer Mikrochip-Designs und Autoloader-Geräte, die sowohl für die Datenerfassung von Flüssigkeiten als auch für Kryo-EM geeignet sind (Abbildung 1)7,14,15,16,17). Die Baugruppen werden mechanisch mit Standard-Rasterclips für automatisierte Instrumente wie dem Krios versiegelt, der mehrere Proben pro Sitzung aufnehmen kann, oder einem F200C TEM (Abbildung 2). Diese Methodik erweitert den Einsatz hochauflösender Bildgebung über Standard-Kryo-EM-Anwendungen hinaus und demonstriert breitere Zwecke für die Echtzeit-Materialanalyse.
Im aktuellen Videoartikel werden Protokolle zur Herstellung von Virusbaugruppen in Flüssigkeit mit und ohne handelsübliche Probenhalter vorgestellt. Mit dem speziellen Probenhalter für Flüssig-EM können dünnflüssige Proben strukturelle Informationen liefern, die mit Kryo-EM-Proben vergleichbar sind, sowie dynamische Einblicke in die Proben. Demonstriert werden auch Methoden zur Vorbereitung flüssiger Proben mit Autoloader-Werkzeugen für Hochdurchsatzroutinen. Der große Vorteil gegenüber anderen Techniken besteht darin, dass die automatisierte Probenproduktion es dem Benutzer ermöglicht, seine Proben vor der Datenerfassung schnell auf optimale Dicke und Elektronendosierung zu beurteilen. Diese Screening-Technik identifiziert schnell ideale Bereiche für Echtzeitaufnahmen in Flüssigkeit oder Eis12,14,18,19. Für die Zwecke der 3D-Strukturbestimmung kann Liquid-EM die seit langem etablierten Kryo-EM-Methoden ergänzen, die in Kryo-EM implementiert sind. Leser, die konventionelle TEM- oder Kryo-EM-Technologien einsetzen, können die Verwendung von Flüssig-EM-Workflows in Betracht ziehen, um neue, dynamische Beobachtungen ihrer Proben in einer Weise bereitzustellen, die ihre aktuellen Strategien ergänzt.
Zu den in diesem Protokoll verwendeten Virusproben gehören gereinigte adenoassoziierte Virussubtypen 3 (AAV), die als Geschenk gewonnen und unter Standardbedingungen kultiviertwerden 12. Ebenfalls verwendet wurden nicht-infektiöse subvirale SARS-CoV-2-Anordnungen, die aus dem Serum von COVID-19-Patienten12 gewonnen und aus einer kommerziellen Quelle gewonnen wurden. Schließlich wurden gereinigte Affenrotavirus (SA11-Stamm) Doppelschichtpartikel (DLPs) aus dem Labor von Dr. Sarah M. McDonald Esstman an der Wake Forest University gewonnen und unter Standardbedingungen 6,17 kultiviert. Die hier beschriebenen Softwarepakete sind frei verfügbar und die Links wurden im Abschnitt Materialverzeichnis bereitgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie (Flüssig-EM) ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da Wissenschaftler nun Echtzeitprozesse auf der Nanoskala beobachten können. Es ist äußerst wünschenswert, hochauflösende Kryo-EM-Informationen mit dynamischen Beobachtungen zu koppeln, da viele Ereignisse auf schnellen Zeitskalen auftreten - im Millisekundenbereich oder schneller. Verbesserte Kenntnisse über flexible Strukturen können auch bei der Entwicklung neuartiger Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 helfen. Noch wichtiger ist, dass die Betrachtung biologischer Materialien in einer flüssigen Umgebung einen einzigartigen Einblick in ihre Leistung im menschlichen Körper bietet. Hier werden neu entwickelte Methoden vorgestellt, um die nanoskaligen Eigenschaften von Virusanordnungen in flüssigem und glasigem Eis zu untersuchen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden gut definierte Stichproben als Modellsysteme verwendet. Direkte Vergleiche von Probenvorbereitungsmethoden und repräsentativen Strukturinformationen werden vorgestellt. Sub-Nanometer-Merkmale werden für Strukturen gezeigt, die im Bereich von ~3,5-Å-10 Å aufgelöst sind. Andere aktuelle Ergebnisse, die diesen komplementären Rahmen unterstützen, umfassen dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten und Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet sind. Insgesamt verbessern diese korrelativen Anwendungen unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für ihre Verwendung in der menschlichen Gesundheit und Krankheit.

Ein Liquid-TEM mit 200 kV wurde für alle Liquid-EM-Bildgebungsexperimente und ein Kryo-TEM mit 300 kV für die gesamte Kryo-EM-Datenerfassung verwendet. Repräsentative Bilder und Strukturen mehrerer Viren werden präsentiert, um den Nutzen der Methoden bei verschiedenen Testpersonen zu demonstrieren. Dazu gehören rekombinante adeno-assoziierte Virus-Subtyp 3 (AAV), SARS-CoV-2-subvirale Anordnungen, die aus dem Patientenserum abgeleitet sind, und Affenrotavirus-Doppelschichtpartikel (DLPs), SA11-Stamm. Zunächst werden...

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Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Hier werden Protokolle beschrieben, um Virusanordnungen herzustellen, die für die Flüssig-EM- und Kryo-EM-Analyse auf der Nanoskala mittels Transmissionselektronenmikroskopie geeignet sind.

Weiterentwicklung der hochauflösenden Bildgebung von Virusanordnungen in Flüssigkeit und Eis

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Das Interesse an der Flüssigelektronenmikroskopie ist in den letzten Jahren sprunghaft angestiegen, da wir jetzt auf der Nanoskala Echtzeitprozesse visualisieren können. Verbessertes Wissen über diese flexiblen Strukturen kann uns helfen, neuartige Reagenzien zur Bekämpfung neu auftretender Krankheitserreger wie SARS-CoV-2 zu entwickeln. Die Betrachtung von Proteinen in einer flüssigen Umgebung hilft, biologische Systeme nachzuahmen und gibt uns die Möglichkeit, die Proteine dynamischer zu betrachten.Und dieses Experiment zeigt Ihnen neue Techniken, wie Sie Proteine sowohl in Glaseis als auch in flüssigen Umgebungen verwenden und visualisieren können. Zu den jüngsten Ergebnissen gehören dynamische Einblicke in Impfstoffkandidaten in Antikörper-basierte Therapien, die in Flüssigkeit abgebildet werden. Korrelative Flüssigkeits- und Kryo-EM-Anwendungen verbessern unsere Fähigkeit, molekulare Dynamik zu visualisieren, und bieten einen einzigartigen Kontext für die menschliche Gesundheit und Krankheit.Leser, die konventionelle TEM- oder Kryo-EM-Technologien einsetzen, können die Implementierung flüssiger EM-Workflows in Betracht ziehen, um neue dynamische Beobachtungen ihrer Proben in einer Weise zu ermöglichen, die ihre aktuellen Strategien ergänzt. Handelsübliche Flüssigkeits-EM-Systeme können Durchfluss, Mischen, elektrochemische Stimuli und Temperaturregelung bereitstellen, die für viele Echtzeit-Bildgebungsanwendungen unerlässlich sind. Die hier vorgestellte Mikrochip-Sandwich-Methode beschreibt eine einfache Einstiegsmöglichkeit, Proben zunächst in Flüssigkeit zu betrachten, bevor der Sprung zu einem komplexeren kommerziellen System für In-situ-Experimente erfolgt.Reinigen Sie zunächst die Siliziumnitrid-Mikrochips, indem Sie jeden Chip zwei Minuten lang in 150 Milliliter Aceton inkubieren, gefolgt von einer Inkubation in 150 Milliliter Methanol für zwei Minuten. Lassen Sie die Späne in einem laminaren Luftstrom trocknen. Plasmareinigen Sie die getrockneten Späne mit einem Glimmentladungsinstrument, das unter Standardbedingungen 45 Sekunden lang mit Argongas betrieben wird.Als nächstes laden Sie einen trockenen Basis-Mikrochip in die Spitze des Probenhalters und fügen dem Basischip etwa 0,2 Mikroliter der Probe hinzu. Nach einer Inkubation von ein bis zwei Minuten legen Sie den oberen Chip auf den nassen Basischip, der die Probe enthält. Setzen Sie die Baugruppe zu einem hermetisch abgeschlossenen Gehäuse zusammen, das mechanisch von drei Messingschrauben gehalten wird.Pumpen Sie die Spitze mit einer turbogepumpten Trockenpumpstation auf 10 auf minus sechs Torr. Die Halterung ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden. Plasma reinigt die Mikrochips und Kohlenstoffgitter mit einem Glimmentladungsinstrument für 45 Sekunden.Und fügen Sie etwa zwei Mikroliter Probe zu einem Glow-entladenen Mikrochip hinzu, der auf einer Gelpackung platziert ist. Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier oder einer Pipette und inkubieren Sie für ein bis zwei Minuten. Fügen Sie dann das glühend entladene Kohlenstoffgitter zu dem nassen Mikrochip hinzu, der die Probe enthält.Setzen Sie die Baugruppe mit einem einzigen Kippprobenhalter bei Raumtemperatur zusammen, um ein hermetisch abgeschlossenes Gehäuse zu bilden. Alternativ können Sie Autoloader-Rasterclips verwenden und die Sandwichbaugruppe auf den unteren C-Clip legen. Legen Sie den oberen Clip auf die Baugruppe und verwenden Sie das Standardspannwerkzeug, um die Baugruppe zusammenzuschließen.Die Probe ist nun bereit, in das TEM eingesetzt zu werden. Untersuchen Sie Proben, die in Autoladern unter Kryobedingungen oder bei Raumtemperatur platziert werden. Für die Flüssigkeits-EM-Bildgebung laden Sie den Probenhalter in den TEM, der mit einer Feldemissionspistole ausgestattet ist, und arbeiten mit 200 Kilovolt.Schalten Sie die Pistole ein und stellen Sie die euzentrische Höhe des Mikroskoptisches in Bezug auf die Probe ein, indem Sie die Wobbler-Funktion verwenden, wobei die Probe von minus 15 Grad auf plus 15 Grad in der Säule geneigt wird. Dieses Verfahren passt den Tisch in Z-Richtung an die Probendicke an und trägt zu einer genauen Vergrößerung während der Bildaufnahme bei. Nehmen Sie Bilder als lange gerahmte Filme oder einzelne Bilder mit dem Softwarepaket zur seriellen Datenerfassung auf und implementieren Sie automatisierte Bildbearbeitungsroutinen.Nehmen Sie Bilder unter niedrig dosierten Bedingungen mit Vergrößerungen von 28, 000X bis 92, 000X und 40 Bildern pro Sekunde auf. Passen Sie die Belichtungszeiten an, um Strahlschäden an der Probe zu minimieren, und verwenden Sie einen Unschärfebereich von minus ein bis vier Mikrometern bei der angegebenen Vergrößerung. Wenn eine dicke Lösung gefunden wird, verwenden Sie höhere Defokussierungswerte oder wählen Sie einen anderen Bereich von Interesse aus.Stellen Sie sicher, dass die Lösung während der gesamten Bildgebungssitzung in den Proben vorhanden ist, indem Sie den Elektronenstrahl auf einen Opferbereich fokussieren, der nicht für die Datenerfassung verwendet wird, bis Blasen gebildet werden. Analysieren Sie Filme auf SARS-CoV-2-Partikel mit dem Programm RELION-3.0.8 oder einer anderen Bildverarbeitungssoftware. Führen Sie die Bewegungskorrektur mit dem Programm MotionCor2 durch.Nach der Korrektur extrahieren Sie Partikel mit dem Auto-Picking-Tool im Programmsoftwarepaket. Typische Kartongrößen sind 330 Pixel für flüssige Proben und 350 Pixel für Eisproben. Berechnen Sie die anfänglichen Rekonstruktionen unter Verwendung der C1-Symmetrie mit der 3D-Anfangsmodellroutine des Programms und den ab initio-Modelloptionen im Datenverarbeitungssoftwarepaket.Führen Sie dann Verfeinerungsprotokolle in der Datenverarbeitungssoftware durch. Untersuchen Sie die Ergebnisse mit einem Softwarepaket für die Molekularstrukturanalyse und bewerten Sie dynamische Veränderungen. Ein Vergleich von Flüssig-EM- und Kryo-EM-Strukturen im adeno-assoziierten Virussubtyp drei oder AAV wird hier gezeigt.Die repräsentativen Bilder zeigen die Struktur von AAV in der Lösung und im Eis. Die Rotationsansichten der AAV VP1-Untereinheit, die aus den Flüssigkeits- und Eisstrukturen extrahiert wird, sind hier dargestellt. Diese Bilder stellen die dynamischen Werte in den flüssigen Strukturen dar, die mit der Morph-Map-Funktion in der Molekularstrukturanalyse-Software erzeugt werden.Die durchschnittlichen Strukturen aus mehreren Virusanordnungen zeigen Konformationsänderungen mit einer Durchmesseränderung von fast 5%, gemessen anhand von EM-Daten. Ein Bild von subviralen SARS-CoV-2-Anordnungen, die aus Serumfraktionen von COVID-19-Patienten isoliert wurden, ist hier gezeigt. Diese weißen Blasen zeigen das Vorhandensein von Flüssigkeit in der Probe an.Eine EM-Rekonstruktion dieser subviralen Anordnungen ist hier mit farbigen radialen Dichten bei fünf Nanometerscheiben durch die Karte dargestellt. Das repräsentative Bild beschreibt die Analyse von Rotavirus-Doppelschichtpartikeln, die in Glaseis mit der Mikrochip-Sandwich-Technik hergestellt wurden. Die Verwendung von Reinigungsmitteln, Glycerin, Polyethylen, Glykolen und hohem Zuckergehalt sollte für die Flüssig-EM-Bildgebung minimiert oder vermieden werden.Diese Reagenzien können Artefakte einführen, übermäßiges Sprudeln, Hydrolyseprodukte und freie Radikale aufgrund von Strahlschäden erzeugen. Die Verwendung dieser Protokolle wird es Wissenschaftlern ermöglichen, dynamische Prozesse im atomaren Detail zu untersuchen. Und dies erstreckt sich über mehrere Bereiche der Wissenschaft, einschließlich Medizin, Biowissenschaften und Materialforschung.Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben, wie modernste Werkzeuge ein spannendes Mittel darstellen können, um biologische Makromoleküle mit neuen Augen sichtbar zu machen. Das Feld der Flüssigelektronenmikroskopie könnte die Untersuchung dieser neuartigen Viren, die eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen, verbessern und vielleicht sogar zu unseren Pandemievorsorgemaßnahmen beitragen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Forschung

Biochemie

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster Resonanz-Energietransfermessungen in lebenden Pflanzenzellen

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...