Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר לוק ה. ונדנברגה (בית הספר לרפואה של הרווארד, המחלקה לרפואת עיניים) על אספקת AAV-3 מטוהר. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות והמכון הלאומי לסרטן (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 עד D.F.K.).

1. טעינת מחזיק הדגימה עבור נוזל-EM
<ol><li>נקו את שבבי הסיליקון ניטריד (SiN) על ידי דגירה של כל שבב ב-150 מ"ל של אצטון למשך 2 דקות ולאחר מכן דגירה ב-150 מ"ל של מתנול למשך 2 דקות. אפשרו לשבבים להתייבש בזרימת אוויר למינרית.</li>
	<li>פלזמה לנקות את השבבים המיובשים באמצעות מכשיר פריקה זוהר הפועל בתנאים...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-SiN+&#8211;+An+alternative+substrate+to+visualize+active+viral+assemblies.">Cryo-SiN &#8211; An alternative substrate to visualize active viral assemblies.</a> Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).</li><li>Solares, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+disease-relevant+p53.">Microchip-based structure determination of disease-relevant p53.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).</li><li>Casasanta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

הזדמנויות חדשות מוצגות כדי לייעל את זרימות העבודה הנוכחיות של Liquid-EM על-ידי שימוש בכלים וטכנולוגיות אוטומטיים חדשים המותאמים מתחום cryo-EM. יישומים הכרוכים בטכניקת כריך השבב החדשה הם משמעותיים ביחס לשיטות אחרות מכיוון שהם מאפשרים ניתוח הדמיה ברזולוציה גבוהה בקרח נוזלי או זגוגי. אחד השלבים ה?...

המחקר הביו-רפואי משפר את הבנתנו את בריאות האדם ומחלותיו באמצעות פיתוח טכנולוגיות חדשות. הדמיה ברזולוציה גבוהה משנה את השקפתנו על עולם הננו - ומאפשרת לנו לחקור תאים ומולקולות בפירוט רב 1,2,3,4,5. מידע סטטי של רכיבים דינמיים כגון פולימרים רכים, מכלולי חלבונים או וירוסים אנושיים חושף רק תמונת מצב מוגבלת של הנרטיב המורכב שלהם. כדי להבין טוב יותר כיצד ישויות מולקולריות פועלות, יש לחקור במשותף את המבנה והתפקוד שלהן.
ההתקדמות האחרונה בייצור חומרים כגון גרפן דק אטומית או שבבים מבוססי סיליקון מספקת הזדמנויות חדשות לניתוח מבנה-תפקוד בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופי אלקטרונים (TEMs). חומרים אלה יכולים ליצור תאים אטומים הרמטית להדמיית EM חיה 6,7,8,9,10,11. התחום החדש של liquid-EM, טמפרטורת החדר בקורלציה לקריו-EM, מספק תצוגות חסרות תקדים של חומרים קשים או רכים בתמיסה, ומאפשר למדענים לחקור בו זמנית את המבנה והדינמיקה של הדגימה שלהם. יישומי Liquid-EM כוללים הקלטות בזמן אמת של ננו-חלקיקים טיפוליים המקיימים אינטראקציה עם תאי גזע סרטניים, כמו גם שינויים במורכבות המולקולרית של פתוגנים נגיפיים12,13,14.
בדיוק כפי שההתקדמות המתודולוגית דרבנה את מהפכת הפתרון בתחום הקריו-EM, יש צורך בטכניקות ושיטות חדשות כדי להרחיב את השימוש ב-liquid-EM ככלי בעל תפוקה גבוהה עבור הקהילה המדעית. המטרה הכוללת של השיטות המוצגות כאן היא לייעל את פרוטוקולי ההכנה של דגימות Liquid-EM. הרציונל מאחורי הטכניקות שפותחו הוא שימוש בעיצובי שבבים חדשים ובהתקני טעינה אוטומטית, המתאימים הן לאיסוף נתונים נוזליים והן לאיסוף נתונים קריו-EM (איור 1)7,14,15,16,17. המכלולים אטומים מכנית באמצעות תפסי רשת סטנדרטיים עבור מכשירים אוטומטיים, כגון ה-Krios, שיכולים להכיל דגימות מרובות בכל סשן או F200C TEM (איור 2). מתודולוגיה זו מרחיבה את השימוש בהדמיה ברזולוציה גבוהה מעבר ליישומי cryo-EM סטנדרטיים המדגימים מטרות רחבות יותר לניתוח חומרים בזמן אמת.
במאמר הווידאו הנוכחי מוצגים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים בנוזל עם ובלי מחזיקי דגימה זמינים מסחרית. באמצעות מחזיק הדגימה המיוחד עבור liquid-EM, דגימות נוזליות דקות יכולות לספק מידע מבני הדומה לדגימות cryo-EM, כמו גם תובנות דינמיות של הדגימות. כמו כן הודגמו שיטות להכנת דגימות נוזליות באמצעות כלי autoloader עבור שגרות תפוקה גבוהה. היתרון העיקרי על פני טכניקות אחרות הוא שייצור דגימות אוטומטי מאפשר למשתמש להעריך במהירות את הדגימות שלו עבור עובי אופטימלי ומינון אלקטרונים לפני איסוף הנתונים. טכניקת סינון זו מזהה במהירות אזורים אידיאליים להקלטות בזמן אמת בנוזל או בקרח12,14,18,19. לצורך קביעת מבנה תלת-ממדי, Liquid-EM עשוי להשלים את שיטות cryo-EM הוותיקות המיושמות ב- cryo-EM. קוראים המשתמשים בטכנולוגיות TEM או cryo-EM קונבנציונליות עשויים לשקול להשתמש בזרימות עבודה של Liquid-EM כדי לספק תצפיות חדשות ודינמיות של הדגימות שלהם באופן המשלים את האסטרטגיות הנוכחיות שלהם.
דגימות וירוסים המשמשות בפרוטוקול זה כוללות תת-סוג וירוס מטוהר הקשור לאדנו 3 (AAV) שהושג במתנה ותורבית בתנאים סטנדרטיים12. כמו כן נעשה שימוש במכלולים תת-ויראליים לא זיהומיים של SARS CoV-2 שמקורם בסרום של חוליCOVID-19 12 והתקבלו ממקור מסחרי. לבסוף, חלקיקים דו-שכבתיים מטוהרים מסוג simian rotavirus (זן SA11) התקבלו ממעבדתה של ד"ר שרה מ. מקדונלד אסתמן באוניברסיטת ווייק פורסט וגודלו בתרבית בתנאים סטנדרטיים 6,17. חבילות התוכנה המתוארות כאן זמינות באופן חופשי והקישורים סופקו בסעיף טבלת חומרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

העניין במיקרוסקופיה של אלקטרונים נוזליים (liquid-EM) הרקיע שחקים בשנים האחרונות כאשר מדענים יכולים כעת לצפות בתהליכים בזמן אמת בקנה מידה ננומטרי. רצוי מאוד להתאים מידע cryo-EM ברזולוציה גבוהה עם תצפיות דינמיות כמו אירועים רבים מתרחשים על צירי זמן מהירים - בטווח של אלפית השנייה או מהר יותר. ידע משופר על מבנים גמישים יכול גם לסייע בתכנון ריאגנטים חדשים כדי להילחם בפתוגנים מתפתחים, כגון SARS-CoV-2. חשוב מכך, צפייה בחומרים ביולוגיים בסביבה נוזלית מספקת הצצה ייחודית לביצועיהם בגוף האדם. מוצגות כאן שיטות שפותחו לאחרונה כדי לחקור את התכונות הננומטריות של מכלולי וירוסים בקרח נוזלי וזגוגי. כדי להשיג מטרה זו, דגימות מוגדרות היטב שימשו כמערכות מודל. מוצגות השוואות זו לצד זו של שיטות הכנת המדגם ומידע מבני מייצג. תכונות תת-ננומטר מוצגות עבור מבנים שנפתרו בטווח של ~3.5-Å-10 Å. תוצאות עדכניות אחרות התומכות במסגרת משלימה זו כוללות תובנות דינמיות של מועמדים לחיסון וטיפולים מבוססי נוגדנים המצולמים בנוזל. באופן כללי, יישומים קורלטיביים אלה מקדמים את היכולת שלנו לדמיין דינמיקה מולקולרית, ומספקים הקשר ייחודי לשימוש בהם בבריאות האדם ובמחלות.

נוזל-TEM הפועל ב-200 קילו-וולט שימש לכל ניסויי ההדמיה של נוזל-EM וקריו-TEM הפועל ב-300 קילו-וולט שימש לכל איסוף הנתונים של cryo-EM. תמונות מייצגות ומבנים של וירוסים מרובים מוצגים כדי להדגים את התועלת של השיטות על פני נבדקים שונים. אלה כוללים תת-סוג נגיף רקומביננטי הקשור לאדנו 3 (AAV), מכלולים תת-נגיפיים ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

כאן מתוארים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים המתאימים לניתוח נוזל-EM וקריו-EM בקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.

קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

העניין במיקרוסקופיית אלקטרונים נוזליים הרקיע שחקים בשנים האחרונות, כפי שאנו יכולים לדמיין כיום בתהליכים ננומטריים בזמן אמת. ידע משופר על מבנים גמישים אלה יכול לסייע לנו בפיתוח ריאגנטים חדשניים כדי להילחם בפתוגנים מתפתחים כגון SARS-CoV-2. צפייה בחלבונים בסביבה נוזלית עוזרת לחקות מערכות ביולוגיות ונותנת לנו הזדמנות להסתכל על החלבונים בצורה דינמית יותר.והניסוי הזה יראה לכם טכניקות חדשות כיצד להשתמש ולדמיין חלבונים הן בסביבות קרח זגוגיות והן בסביבות נוזליות. התוצאות האחרונות כוללות תובנות דינמיות של מועמדים לחיסון בטיפולים מבוססי נוגדנים המצולמים בנוזל. יישומי נוזל וקריו-EM קורלטיביים מקדמים את היכולת שלנו לדמיין דינמיקה מולקולרית, ומספקים הקשר ייחודי לבריאות האדם ולמחלות.קוראים המשתמשים בטכנולוגיות TEM או cryo-EM קונבנציונליות עשויים לשקול ליישם זרימות עבודה של EM נוזלי כדי לספק תצפיות דינמיות חדשות של הדגימות שלהם באופן המשלים את האסטרטגיות הנוכחיות שלהם. מערכות Liquid-EM הזמינות מסחרית יכולות לספק זרימה, ערבוב, גירויים אלקטרוכימיים ובקרת טמפרטורה, החיוניים ליישומי הדמיה רבים בזמן אמת. שיטת כריך השבבים המוצגת כאן מתארת דרך פשוטה ברמת הכניסה לצפייה ראשונה בדגימות בנוזל לפני ביצוע הקפיצה למערכת מסחרית מורכבת יותר לניסויים באתרם.כדי להתחיל, לנקות את שבבי סיליקון ניטריד על ידי דגירה כל שבב ב 150 מיליליטר של אצטון במשך שתי דקות, ואחריו דגירה ב 150 מיליליטר של מתנול במשך שתי דקות. אפשרו לשבבים להתייבש בזרימת אוויר למינרית. פלזמה לנקות את השבבים המיובשים באמצעות מכשיר פריקה זוהר הפועל בתנאים סטנדרטיים במשך 45 שניות באמצעות גז ארגון.לאחר מכן, טען שבב בסיס יבש לתוך קצה מחזיק הדגימה והוסף כ -0.2 מיקרוליטר של הדגימה לשבב הבסיס. לאחר דגירה במשך דקה עד שתי דקות, מניחים את השבב העליון על שבב הבסיס הרטוב המכיל את הדגימה. שתלו את המכלול יחד כדי ליצור מארז אטום הרמטית המוחזק במקומו באופן מכני על ידי שלושה ברגי פליז.שאבו את הקצה ל-10 עד מינוס שש טור באמצעות תחנת שאיבה יבשה עם שאיבה טורבו. המחזיק מוכן כעת להכנסתו ל- TEM. פלזמה לנקות את שבבים ורשתות פחמן באמצעות מכשיר פריקה זוהר במשך 45 שניות.ולהוסיף כשני מיקרוליטרים של דגימה לשבב זוהר משוחרר המונח על חבילת ג'ל. הסר את הפתרון העודף באמצעות נייר סינון או פיפטה ודגרה במשך דקה עד שתי דקות. לאחר מכן הוסיפו את רשת הפחמן הזוהרת שנפלטה לשבב הרטוב המכיל את הדגימה.שתלו את המכלול יחד באמצעות מחזיק דגימת הטיה יחיד בטמפרטורת החדר כדי ליצור מארז אטום הרמטית. לחלופין, השתמשו במהדקי רשת עם טעינה אוטומטית והניחו את מכלול הכריך על תפס C התחתון. הניחו את התפס העליון על גבי המכלול והשתמשו בכלי ההידוק הסטנדרטי כדי לאטום את המכלול.הדגימה מוכנה כעת להחדרה ל- TEM. בדוק דגימות המונחות במעמיסים אוטומטיים בתנאי קריו או בטמפרטורת החדר. להדמיית נוזל-EM, טען את מחזיק הדגימה ל- TEM המצויד באקדח פליטת שדה ופעל במהירות של 200 קילו-וולט.הפעל את האקדח והתאם את הגובה האוצנטרי של שלב המיקרוסקופ ביחס לדגימה על ידי שימוש בפונקציית הנדנדה, הטיית הדגימה ממינוס 15 מעלות לפלוס 15 מעלות בעמודה. הליך זה מתאים את השלב בכיוון Z כדי להתאים לעובי הדגימה ומסייע להבטיח הגדלה מדויקת במהלך הקלטת התמונה. הקלט תמונות כסרטים ממוסגרים ארוכים או תמונות בודדות באמצעות חבילת התוכנה לאיסוף נתונים סדרתי, תוך יישום שגרות הדמיה אוטומטיות.קבל תמונות בתנאים של מינון נמוך בהגדלה הנעה בין 28, 000X ל- 92, 000X ו- 40 פריימים לשנייה. התאם את זמני החשיפה כדי למזער את נזקי הקרן לדגימה והשתמש בטווח הפחתה של מינוס אחד עד ארבעה מיקרומטרים בהגדלה שצוינה. אם נתקלת בתמיסה עבה, השתמש בערכי defocus גבוהים יותר או בחר אזור עניין אחר.ודא שהפתרון נמצא בדגימות לאורך כל סשן ההדמיה על ידי מיקוד קרן האלקטרונים באזור קורבן שאינו משמש לאיסוף נתונים עד ליצירת בועות. נתח סרטים עבור חלקיקי SARS-CoV-2 באמצעות תוכנית RELION-3.0.8 או כל תוכנה אחרת לעיבוד תמונה. בצע תיקון תנועה באמצעות תוכנית MotionCor2.לאחר התיקון, חלץ חלקיקים באמצעות כלי הבחירה האוטומטית בחבילת התוכנה של התוכנית. גדלים אופייניים של קופסאות הם 330 פיקסלים לדגימות נוזליות ו-350 פיקסלים לדגימות קרח. חשב את השחזורים הראשוניים באמצעות סימטריית C1 עם שגרת המודל הראשוני התלת-ממדי של התוכנית ואפשרויות מודל ab initio בחבילת התוכנה לעיבוד נתונים.לאחר מכן בצע פרוטוקולי חידוד בתוכנת עיבוד הנתונים. בחן את התוצאות באמצעות חבילת תוכנה לניתוח מבנה מולקולרי תוך הערכת שינויים דינמיים. השוואה של מבנים נוזליים-EM וקריו-EM בתת-סוג וירוס הקשור לאדנו שלוש או AAV מוצגת כאן.התמונות המייצגות מראות את המבנה של AAV בתמיסה ובקרח. התצוגות הסיבוביות של תת-היחידה AAV VP1 המופקות ממבני הנוזל והקרח מוצגות כאן. תמונות אלה מייצגות את הערכים הדינמיים במבנים הנוזליים הנוצרים באמצעות פונקציית מפת שינוי הצורה בתוכנת ניתוח המבנה המולקולרי.המבנים הממוצעים ממכלולי וירוסים מרובים מראים שינויים קונפורמיים עם שינוי בקוטר של כמעט 5% הנמדד באמצעות נתוני EM. תמונה של מכלולים תת-ויראליים של SARS-CoV-2 שבודדו משברי סרום מחולי COVID-19 מוצגת כאן. בועות לבנות אלה מצביעות על נוכחות של נוזל בדגימה.שחזור EM של מכלולים תת-ויראליים אלה מוצג כאן עם צפיפויות רדיאליות צבעוניות בפרוסות של חמישה ננומטר דרך המפה. התמונה המייצגת מתארת את הניתוח של חלקיקים דו-שכבתיים של רוטה-וירוס שהוכנו בקרח זגוגי באמצעות טכניקת כריך השבב. יש למזער את השימוש בדטרגנטים, גליצרול, פוליאתילן, גליקולים ורמות גבוהות של סוכרים לצורך הדמיית נוזל-EM.ריאגנטים אלה עשויים להציג חפצים, ליצור מבעבע מוגזם, מוצרי הידרוליזה ורדיקלים חופשיים עקב נזק לקרן. השימוש בפרוטוקולים אלה יאפשר למדענים להיות מסוגלים לחקור תהליכים דינמיים בפירוט אטומי. וזה משתרע על פני תחומים רבים של המדע כולל רפואה, מדעי החיים וחקר חומרים.הפרוטוקולים המוצגים כאן מתארים כיצד כלים חדישים יכולים לספק אמצעי מרגש לדמיין מקרומולקולות ביולוגיות באמצעות עיניים חדשות. שדה מיקרוסקופיית האלקטרונים הנוזלית עשוי לשפר את האופן שבו אנו חוקרים את הנגיפים החדשים האלה שמהווים איום על בריאות האדם, ואולי אפילו לתרום לאמצעי המוכנות שלנו למגפה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

מדידות העברת אנרגיה תהודה Förster בתאי צמח חיים

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...