Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
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Gli autori riconoscono il Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Dipartimento di Oftalmologia) per aver fornito AAV-3 purificato. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health e dal National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).

1. Caricamento del portacampioni per liquid-EM
<ol><li>Pulire i microchip di nitruro di silicio (SiN) incubando ciascun chip in 150 ml di acetone per 2 minuti, seguito dall'incubazione in 150 ml di metanolo per 2 minuti. Lasciare asciugare i trucioli nel flusso d'aria laminare.</li>
	<li>Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento a scarica di bagliore operante in condizioni standard di 30 W, 15 mA per 45 s utilizzando gas Argon.</li>
	<li>Caricare un microchip a base asciutta nella...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-SiN+&#8211;+An+alternative+substrate+to+visualize+active+viral+assemblies.">Cryo-SiN &#8211; An alternative substrate to visualize active viral assemblies.</a> Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).</li><li>Solares, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+disease-relevant+p53.">Microchip-based structure determination of disease-relevant p53.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).</li><li>Casasanta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

Vengono presentate nuove opportunità per semplificare gli attuali flussi di lavoro liquid-EM utilizzando nuovi strumenti automatizzati e tecnologie adattate dal campo crio-EM. Le applicazioni che coinvolgono la nuova tecnica a sandwich di microchip sono significative rispetto ad altri metodi perché consentono l'analisi di imaging ad alta risoluzione in ghiaccio liquido o vetroso. Uno dei passaggi più critici del protocollo è la produzione di campioni con lo spessore liquido ideale per visualizzare dettagli squisiti a...

La ricerca biomedica migliora la nostra comprensione della salute umana e delle malattie attraverso lo sviluppo di nuove tecnologie. L'imaging ad alta risoluzione sta trasformando la nostra visione del nanomondo, permettendoci di studiare cellule e molecole in dettaglio squisito 1,2,3,4,5. Le informazioni statiche di componenti dinamici come polimeri molli, assemblaggi proteici o virus umani rivelano solo un'istantanea limitata della loro complessa narrazione. Per comprendere meglio come operano le entità molecolari, la loro struttura e funzione devono essere studiate congiuntamente.
I recenti progressi nella produzione di materiali come il grafene atomicamente sottile o i microchip a base di silicio offrono nuove opportunità per l'analisi struttura-funzione in tempo reale utilizzando microscopi elettronici a trasmissione (TEM). Questi materiali possono creare camere ermeticamente sigillate per l'imaging EM live 6,7,8,9,10,11. Il nuovo campo di liquido-EM, la temperatura ambiente correlata alla crio-EM, fornisce una visione senza precedenti di materiali duri o morbidi in soluzione, consentendo agli scienziati di studiare simultaneamente la struttura e la dinamica del loro campione. Le applicazioni liquid-EM includono registrazioni in tempo reale di nanoparticelle terapeutiche che interagiscono con le cellule staminali tumorali e cambiamenti nelle complessità molecolari dei patogeni virali12,13,14.
Proprio come i progressi metodologici hanno stimolato la rivoluzione della risoluzione nel campo della crio-EM, sono necessarie nuove tecniche e metodi per estendere l'uso di liquid-EM come strumento ad alto rendimento per la comunità scientifica. L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di semplificare i protocolli di preparazione dei campioni liquidi-EM. La logica alla base delle tecniche sviluppate è quella di impiegare nuovi progetti di microchip e dispositivi di autoloader, adatti sia per la raccolta di dati liquidi che crio-EM (Figura 1) 7,14,15,16,17. I gruppi sono sigillati meccanicamente utilizzando clip a griglia standard per strumenti automatizzati, come Krios, che possono ospitare più campioni per sessione o un TEM F200C (Figura 2). Questa metodologia espande l'uso dell'imaging ad alta risoluzione oltre le applicazioni crio-EM standard, dimostrando scopi più ampi per l'analisi dei materiali in tempo reale.
Nell'attuale articolo video, vengono presentati i protocolli per la preparazione di assemblaggi di virus in liquido con e senza portacampioni disponibili in commercio. Utilizzando il portacampioni specializzato per liquido-EM, i campioni liquidi sottili possono fornire informazioni strutturali paragonabili ai campioni crio-EM, nonché approfondimenti dinamici dei campioni. Vengono inoltre dimostrati metodi per la preparazione di campioni liquidi utilizzando strumenti di caricamento automatico per routine ad alta produttività. Il vantaggio principale rispetto ad altre tecniche è che la produzione automatizzata di campioni consente all'utente di valutare rapidamente i propri campioni per lo spessore e il dosaggio di elettroni ottimali prima della raccolta dei dati. Questa tecnica di screening identifica rapidamente le aree ideali per le registrazioni in tempo reale in liquido o ghiaccio12,14,18,19. Ai fini della determinazione della struttura 3D, liquid-EM può integrare i metodi crio-EM di lunga data implementati nella crio-EM. I lettori che impiegano tecnologie TEM o crio-EM convenzionali possono prendere in considerazione l'utilizzo di flussi di lavoro liquid-EM per fornire nuove osservazioni dinamiche dei loro campioni in un modo che integri le loro attuali strategie.
I campioni di virus utilizzati in questo protocollo includono il sottotipo 3 del virus adeno-associato purificato (AAV) ottenuto come dono e coltivato in condizioni standard12. Sono stati utilizzati anche assemblaggi subvirali non infettivi di SARS CoV-2 derivati dal siero di pazienti COVID-1912 e ottenuti da una fonte commerciale. Infine, le particelle purificate a doppio strato (DLP) del rotavirus delle scimmie (ceppo SA11) sono state ottenute dal laboratorio della dottoressa Sarah M. McDonald Esstman presso la Wake Forest University e coltivate utilizzando condizioni standard 6,17. I pacchetti software qui descritti sono disponibili gratuitamente e i collegamenti sono stati forniti nella sezione Tabella dei materiali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

L'interesse per la microscopia a elettroni liquidi (liquid-EM) è salito alle stelle negli ultimi anni, poiché gli scienziati possono ora osservare i processi in tempo reale su scala nanometrica. È estremamente desiderabile accoppiare informazioni crio-EM ad alta risoluzione con osservazioni dinamiche poiché molti eventi si verificano su scale temporali rapide - nell'intervallo di millisecondi o più velocemente. Una migliore conoscenza delle strutture flessibili può anche aiutare nella progettazione di nuovi reagenti per combattere i patogeni emergenti, come SARS-CoV-2. Ancora più importante, la visualizzazione di materiali biologici in un ambiente fluido offre uno sguardo unico delle loro prestazioni nel corpo umano. Qui sono presentati metodi recentemente sviluppati per studiare le proprietà su scala nanometrica degli assemblaggi di virus nel ghiaccio liquido e vetroso. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati campioni ben definiti come sistemi modello. Vengono presentati confronti affiancati dei metodi di preparazione dei campioni e delle informazioni strutturali rappresentative. Le caratteristiche sub-nanometriche sono mostrate per le strutture risolte nell'intervallo di ~ 3,5-Å-10 Å. Altri risultati recenti che supportano questo quadro complementare includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini e delle terapie basate su anticorpi visualizzate in liquido. Nel complesso, queste applicazioni correlate migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per il loro uso nella salute umana e nelle malattie.

Un TEM liquido funzionante a 200 kV è stato utilizzato per tutti gli esperimenti di imaging liquid-EM e un crio-TEM funzionante a 300 kV è stato utilizzato per tutta la raccolta di dati crio-EM. Vengono presentate immagini rappresentative e strutture di più virus per dimostrare l'utilità dei metodi in vari soggetti del test. Questi includono il virus adeno-associato ricombinante sottotipo 3 (AAV), gli assemblaggi subvirali SARS-CoV-2 derivati dal siero del paziente e le particelle a doppio strato (DLP) del rotavirus ...

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Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l'analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

L'interesse per la microscopia elettronica liquida è salito alle stelle negli ultimi anni, come ora possiamo visualizzare nei processi in tempo reale su scala nanometrica. Una migliore conoscenza di queste strutture flessibili può aiutarci a sviluppare nuovi reagenti per combattere agenti patogeni emergenti come SARS-CoV-2. Osservare le proteine in un ambiente fluido aiuta a imitare i sistemi biologici e ci dà l'opportunità di guardare le proteine in modo più dinamico.E questo esperimento ti mostrerà nuove tecniche su come utilizzare e visualizzare le proteine sia in ambienti di ghiaccio vitreo che liquidi. I risultati recenti includono approfondimenti dinamici dei candidati vaccini nelle terapie a base di anticorpi visualizzate in liquido. Le applicazioni correlate liquide e crio-EM migliorano la nostra capacità di visualizzare le dinamiche molecolari, fornendo un contesto unico per la salute e le malattie umane.I lettori che impiegano tecnologie TEM o crio-EM convenzionali possono prendere in considerazione l'implementazione di flussi di lavoro EM liquidi per fornire nuove osservazioni dinamiche dei loro campioni in un modo che integri le loro attuali strategie. I sistemi liquid-EM disponibili in commercio possono fornire flusso, miscelazione, stimoli elettrochimici e controllo della temperatura, che sono essenziali per molte applicazioni di imaging in tempo reale. Il metodo a sandwich di microchip qui presentato descrive un modo semplice per visualizzare i campioni in liquido prima di fare il salto verso un sistema commerciale più complesso per esperimenti in situ.Per iniziare, pulire i microchip di nitruro di silicio incubando ciascun chip in 150 millilitri di acetone per due minuti, seguito dall'incubazione in 150 millilitri di metanolo per due minuti. Lasciare asciugare i trucioli in un flusso d'aria laminare. Pulire al plasma i trucioli essiccati utilizzando uno strumento di scarica a bagliore funzionante in condizioni standard per 45 secondi utilizzando gas argon.Quindi, caricare un microchip a base secca nella punta del supporto del campione e aggiungere circa 0,2 microlitri del campione al chip di base. Dopo l'incubazione per uno o due minuti, posizionare il chip superiore sul chip di base bagnato contenente il campione. Piantate insieme l'assieme per formare un involucro ermeticamente sigillato tenuto in posizione meccanicamente da tre viti in ottone.Pompare la punta a 10 a meno sei torr utilizzando una stazione di pompaggio a secco turbo pompata. Il supporto è ora pronto per essere inserito nel TEM. Pulire al plasma i microchip e le griglie di carbonio utilizzando uno strumento di scarica del bagliore per 45 secondi.E aggiungi circa due microlitri di campione a un microchip scaricato a bagliore posto su un pacchetto di gel. Rimuovere la soluzione in eccesso con carta da filtro o una pipetta e incubare per uno o due minuti. Quindi aggiungere la griglia di carbonio scaricata a bagliore al microchip bagnato contenente il campione.Piantare insieme l'assieme utilizzando un singolo portacampioni inclinabile a temperatura ambiente per formare un involucro ermeticamente sigillato. In alternativa, utilizzate le clip a griglia con caricamento automatico e posizionate il gruppo sandwich sulla clip C inferiore. Posizionare la clip superiore sopra il gruppo e utilizzare lo strumento di serraggio standard per sigillare il gruppo.Il campione è ora pronto per essere inserito nel TEM. Esaminare i campioni posti in caricatori automatici in condizioni criogeniche o a temperatura ambiente. Per l'imaging liquido-EM, caricare il portacampioni nel TEM dotato di una pistola ad emissione di campo e operare a 200 kilovolt.Accendere la pistola e regolare l'altezza eucentrica dello stadio del microscopio rispetto al campione utilizzando la funzione oscillante, inclinando il campione da meno 15 gradi a più 15 gradi nella colonna. Questa procedura regola lo stadio nella direzione Z per adattarsi allo spessore del campione e aiuta a garantire un ingrandimento accurato durante la registrazione dell'immagine. Registra le immagini come filmati con fotogrammi lunghi o singole immagini utilizzando il pacchetto software di raccolta dati seriale, implementando routine di imaging automatizzate.Acquisisci immagini in condizioni di basso dosaggio con ingrandimenti compresi tra 28.000X e 92.000X e 40 fotogrammi al secondo. Regolare i tempi di esposizione per ridurre al minimo i danni del fascio al campione e utilizzare un intervallo di sfocatura da meno uno a quattro micrometri all'ingrandimento specificato. Se viene rilevata una soluzione spessa, utilizzare valori di sfocatura più elevati o selezionare un'area di interesse diversa.Assicurarsi che la soluzione sia presente nei campioni durante la sessione di imaging focalizzando il fascio di elettroni su un'area sacrificale non utilizzata per la raccolta dei dati fino a quando non si formano bolle. Analizza i filmati per le particelle di SARS-CoV-2 utilizzando il programma RELION-3.0.8 o qualsiasi altro software di elaborazione delle immagini. Eseguire la correzione del movimento utilizzando il programma MotionCor2.Una volta corrette, estrarre le particelle utilizzando lo strumento di auto-picking nel pacchetto software del programma. Le dimensioni tipiche delle scatole sono 330 pixel per i campioni liquidi e 350 pixel per i campioni di ghiaccio. Calcola le ricostruzioni iniziali utilizzando la simmetria C1 con la routine del modello iniziale 3D del programma e le opzioni del modello ab initio nel pacchetto software di elaborazione dati.Quindi eseguire protocolli di perfezionamento nel software di elaborazione dati. Esaminare i risultati utilizzando un pacchetto software di analisi della struttura molecolare durante la valutazione dei cambiamenti dinamici. Qui viene mostrato un confronto tra strutture liquido-EM e crio-EM nel sottotipo tre o AAV del virus adeno-associato.Le immagini rappresentative mostrano la struttura di AAV nella soluzione e nel ghiaccio. Le viste rotazionali della subunità AAV VP1 estratta dalle strutture liquide e ghiacciate sono mostrate qui. Queste immagini rappresentano i valori dinamici nelle strutture liquide generate utilizzando la funzione morph map nel software di analisi della struttura molecolare.Le strutture medie di più gruppi di virus mostrano cambiamenti conformazionali con una variazione di diametro di quasi il 5% misurata utilizzando i dati EM. Qui viene mostrata un'immagine degli assemblaggi subvirali di SARS-CoV-2 isolati da frazioni sieriche di pazienti COVID-19. Queste bolle bianche indicano la presenza di liquido nel campione.Una ricostruzione EM di questi assemblaggi subvirali è mostrata qui con densità radiali colorate a cinque fette nanometriche attraverso la mappa. L'immagine rappresentativa descrive l'analisi delle particelle a doppio strato di rotavirus preparate nel ghiaccio vitreo utilizzando la tecnica del sandwich con microchip. L'uso di detergenti, glicerolo, polietilene, glicoli e alti livelli di zuccheri dovrebbe essere ridotto al minimo o evitato per l'imaging liquido-EM.Questi reagenti possono introdurre artefatti, creare eccessivi gorgoglii, prodotti di idrolisi e radicali liberi a causa di danni al fascio. L'uso di questi protocolli consentirà agli scienziati di essere in grado di studiare i processi dinamici a dettaglio atomico. E questo si estende a più campi della scienza, tra cui medicina, scienze della vita e ricerca sui materiali.I protocolli qui presentati descrivono come strumenti all'avanguardia possano fornire un mezzo entusiasmante per visualizzare macromolecole biologiche attraverso nuovi occhi. Il campo della microscopia elettronica liquida può elevare il modo in cui studiamo questi nuovi virus che rappresentano una minaccia per la salute umana, forse anche contribuendo alle nostre misure di preparazione alla pandemia.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificazione di Plant proteine ​​Ice vincolante attraverso la valutazione di Ice-ricristallizzazione inibizione e isolanti Utilizzando Ice-affinità Purificazione

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Ricerca

Biochimica

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F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

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