Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Department of Ophthalmology) for å gi renset AAV-3. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health og National Cancer Institute (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 til D.F.K.).

1. Lasting av prøveholderen for væske-EM
<ol><li>Rengjør silisiumnitrid (SiN) mikrochips ved å inkubere hver brikke i 150 ml aceton i 2 minutter etterfulgt av inkubasjon i 150 ml metanol i 2 minutter. La flis tørke i laminær luftstrøm.</li>
	<li>Plasma rengjør de tørkede sjetongene ved hjelp av et glødutladningsinstrument som opererer under standardforhold på 30 W, 15 mA for 45 s ved bruk av Argon-gass.</li>
	<li>Legg en tørr base mikrochip i spissen av prøveholderen. Tilsett ~0,2 μL prø...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-SiN+&#8211;+An+alternative+substrate+to+visualize+active+viral+assemblies.">Cryo-SiN &#8211; An alternative substrate to visualize active viral assemblies.</a> Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).</li><li>Solares, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+disease-relevant+p53.">Microchip-based structure determination of disease-relevant p53.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).</li><li>Casasanta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

Nye muligheter presenteres for å effektivisere dagens væske-EM-arbeidsflyter ved å bruke nye automatiserte verktøy og teknologier tilpasset kryo-EM-feltet. Applikasjoner som involverer den nye mikrochipsandwichteknikken er signifikante med hensyn til andre metoder fordi de muliggjør høyoppløselig bildeanalyse i flytende eller glassaktig is. Et av de mest kritiske trinnene i protokollen er å produsere prøver med den ideelle væsketykkelsen for å visualisere utsøkte detaljer på nanoskalanivå. Ideelle interesse...

Biomedisinsk forskning forbedrer vår forståelse av menneskers helse og sykdom gjennom utvikling av ny teknologi. Høyoppløselig bildebehandling forvandler vårt syn på nanoverden - slik at vi kan studere celler og molekyler i utsøkt detalj 1,2,3,4,5. Statisk informasjon om dynamiske komponenter som myke polymerer, proteinsamlinger eller humane virus avslører bare et begrenset øyeblikksbilde av deres komplekse fortelling. For bedre å forstå hvordan molekylære enheter opererer, må deres struktur og funksjon undersøkes i fellesskap.
Nylige fremskritt i produksjonen av materialer som atomisk tynn grafen eller silisiumbaserte mikrochips gir nye muligheter for sanntids strukturfunksjonsanalyse ved hjelp av transmisjonselektronmikroskop (TEM). Disse materialene kan skape hermetisk forseglede kamre for levende EM-avbildning 6,7,8,9,10,11. Det nye feltet væske-EM, romtemperaturen korrelerer med cryo-EM, gir enestående utsikt over harde eller myke materialer i løsning, slik at forskere samtidig kan studere strukturen og dynamikken til prøven. Væske-EM-applikasjoner inkluderer sanntidsopptak av terapeutiske nanopartikler som interagerer med kreftstamceller, samt endringer i molekylære vanskeligheter med virale patogener12,13,14.
Akkurat som metodologiske fremskritt ansporet oppløsningsrevolusjonen i kryo-EM-feltet, er det behov for nye teknikker og metoder for å utvide bruken av væske-EM som et verktøy med høy gjennomstrømning for det vitenskapelige samfunn. Det overordnede målet med metodene som presenteres her er å strømlinjeforme protokoller for fremstilling av flytende EM-prøver. Begrunnelsen bak de utviklede teknikkene er å ta i bruk nye mikrochipdesign og autoloader-enheter, egnet for både væske- og kryo-EM-datainnsamling (figur 1) 7,14,15,16,17. Samlingene er mekanisk forseglet ved hjelp av standard rutenettklemmer for automatiserte instrumenter, for eksempel Krios, som kan romme flere prøver per økt eller en F200C TEM (figur 2). Denne metoden utvider bruken av høyoppløselig bildebehandling utover standard cryo-EM-applikasjoner som demonstrerer bredere formål for sanntids materialanalyse.
I den aktuelle videoartikkelen presenteres protokoller for tilberedning av virussamlinger i væske med og uten kommersielt tilgjengelige prøveholdere. Ved å bruke den spesialiserte prøveholderen for væske-EM, kan tynne væskeprøver gi strukturell informasjon som kan sammenlignes med kryo-EM-prøver, samt dynamisk innsikt i prøvene. Det er også demonstrert metoder for fremstilling av væskeprøver ved bruk av autoloaderverktøy for rutiner med høy gjennomstrømning. Den største fordelen i forhold til andre teknikker er at automatisert prøveproduksjon gjør at brukeren raskt kan vurdere prøvene sine for optimal tykkelse og elektrondosering før datainnsamling. Denne screeningteknikken identifiserer raskt ideelle områder for sanntidsopptak i væske eller is12,14,18,19. Med henblikk på 3D-strukturbestemmelse kan væske-EM utfylle de veletablerte kryo-EM-metodene implementert i kryo-EM. Lesere som bruker konvensjonelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan vurdere å bruke flytende EM-arbeidsflyter for å gi nye, dynamiske observasjoner av prøvene sine på en måte som utfyller deres nåværende strategier.
Virusprøver som brukes i denne protokollen inkluderer renset adeno-assosiert virus subtype 3 (AAV) oppnådd som gave og dyrket under standardbetingelser12. Det ble også brukt ikke-infeksiøse SARS CoV-2 subvirale samlinger avledet fra serumet til Covid-19-pasienter12 og innhentet fra en kommersiell kilde. Til slutt ble renset simian rotavirus (SA11-stamme) dobbeltlagspartikler (DLP) hentet fra laboratoriet til Dr. Sarah M. McDonald Esstman ved Wake Forest University og dyrket ved hjelp av standardbetingelser 6,17. Programvarepakker som er beskrevet her, er fritt tilgjengelige, og koblingene er gitt i delen Materialtabell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

Interessen for væske-elektronmikroskopi (væske-EM) har skutt i været de siste årene, da forskere nå kan observere sanntidsprosesser på nanoskala. Det er ekstremt ønskelig å koble høyoppløselig kryo-EM-informasjon med dynamiske observasjoner, da mange hendelser oppstår ved raske tidsskalaer - i millisekundområdet eller raskere. Forbedret kunnskap om fleksible strukturer kan også bistå i utformingen av nye reagenser for å bekjempe nye patogener, som SARS-CoV-2. Enda viktigere, å se biologiske materialer i et flytende miljø gir et unikt glimt av deres ytelse i menneskekroppen. Her presenteres nyutviklede metoder for å undersøke nanoskalaegenskapene til virussamlinger i flytende og glassaktig is. For å oppnå dette målet ble veldefinerte prøver brukt som modellsystemer. Side-ved-side-sammenligninger av prøveprepareringsmetoder og representativ strukturinformasjon presenteres. Sub-nanometer funksjoner er vist for strukturer løst i området ~ 3,5-Å-10 Å. Andre nylige resultater som støtter dette komplementære rammeverket inkluderer dynamisk innsikt i vaksinekandidater og antistoffbaserte terapier avbildet i væske. Samlet sett fremmer disse korrelative applikasjonene vår evne til å visualisere molekylær dynamikk, noe som gir en unik kontekst for deres bruk i menneskers helse og sykdom.

En væske-TEM som opererer ved 200 kV ble brukt til alle væske-EM-avbildningseksperimenter, og en kryo-TEM som opererer ved 300 kV ble brukt til all kryo-EM-datainnsamling. Representative bilder og strukturer av flere virus presenteres for å demonstrere nytten av metodene på tvers av ulike testpersoner. Disse inkluderer rekombinant adeno-assosiert virus subtype 3 (AAV), SARS-CoV-2 subvirale samlinger avledet fra pasientserumet, og simian rotavirus dobbeltlagspartikler (DLP), SA11-stamme. For det første er sammenligni...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Her beskrives protokoller for å forberede virussamlinger egnet for væske-EM- og kryo-EM-analyse på nanoskala ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi.

Fremme høyoppløselig avbildning av virussamlinger i væske og is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Interessen for flytende elektronmikroskopi har skutt i været de siste årene, da vi nå kan visualisere på nanoskala sanntidsprosesser. Forbedret kunnskap om disse fleksible strukturene kan hjelpe oss med å utvikle nye reagenser for å bekjempe nye patogener som SARS-CoV-2. Å se proteiner i et flytende miljø bidrar til å etterligne biologiske systemer og gir oss en mulighet til å se på proteinene på en mer dynamisk måte.Og dette eksperimentet vil vise deg nye teknikker for hvordan du bruker og visualiserer proteiner i både glassaktig is og flytende miljøer. Nylige resultater inkluderer dynamisk innsikt i vaksinekandidater i antistoffbaserte terapier avbildet i væske. Korrelative væske- og kryo-EM-applikasjoner fremmer vår evne til å visualisere molekylær dynamikk, noe som gir en unik kontekst for menneskers helse og sykdom.Lesere som bruker konvensjonelle TEM- eller cryo-EM-teknologier, kan vurdere å implementere flytende EM-arbeidsflyter for å gi nye dynamiske observasjoner av prøvene sine på en måte som utfyller deres nåværende strategier. Kommersielt tilgjengelige væske-EM-systemer kan gi strømning, blanding, elektrokjemiske stimuli og temperaturkontroll, noe som er avgjørende for mange sanntidsbildeapplikasjoner. Microchip sandwich-metoden som presenteres her, beskriver en enkel inngangsnivå-måte å først se prøver i væske før du tar spranget til et mer komplekst kommersielt system for in situ-eksperimenter.For å begynne, rengjør silisiumnitridmikrochips ved å inkubere hver brikke i 150 milliliter aceton i to minutter, etterfulgt av inkubasjon i 150 milliliter metanol i to minutter. La flis tørke i en laminær luftstrøm. Plasma rengjør de tørkede sjetongene ved hjelp av et glødutladningsinstrument som opererer under standardforhold i 45 sekunder ved bruk av argongass.Deretter legger du en tørr base mikrochip inn i spissen av prøveholderen og legger rundt 0,2 mikroliter av prøven til basebrikken. Etter inkubering i ett til to minutter, plasser toppbrikken på den våte basebrikken som inneholder prøven. Plant forsamlingen sammen for å danne et hermetisk forseglet kabinett som holdes på plass mekanisk av tre messingskruer.Pump spissen til 10 til minus seks torr ved hjelp av en turbopumpet tørr pumpestasjon. Holderen er nå klar til å settes inn i TEM. Plasma rengjør mikrochips og karbongitter ved hjelp av et glødutladningsinstrument i 45 sekunder.Og legg rundt to mikroliter prøve til en glødutladet mikrochip plassert på en gelpakke. Fjern overflødig løsning ved hjelp av filterpapir eller en pipette og inkuber i ett til to minutter. Tilsett deretter det glødeutladede karbongitteret til den våte mikrochipen som inneholder prøven.Plant forsamlingen sammen ved hjelp av en enkelt vippeprøveholder ved romtemperatur for å danne et hermetisk forseglet kabinett. Alternativt kan du bruke autoloader grid clips og plassere sandwichenheten på bunnen C-klips. Plasser toppklemmen på toppen av enheten og bruk standard klemmeverktøy for å forsegle enheten sammen.Prøven er nå klar til å settes inn i TEM. Undersøk prøver plassert i auto-loaders under kryoforhold eller ved romtemperatur. For væske-EM-avbildning, last prøveholderen inn i TEM utstyrt med en feltutslippspistol og operer ved 200 kilovolt.Slå på pistolen og juster den eusentriske høyden på mikroskoptrinnet i forhold til prøven ved å bruke wobblerfunksjonen, og vipp prøven fra minus 15 grader til pluss 15 grader i kolonnen. Denne prosedyren justerer trinnet i Z-retningen for å imøtekomme prøvetykkelsen og bidrar til å sikre en nøyaktig forstørrelse under bildeopptak. Ta opp bilder som lange innrammede filmer eller individuelle bilder ved hjelp av programvarepakken for seriell datainnsamling, og implementer automatiserte bildebehandlingsrutiner.Skaff bilder under lavdoseforhold ved forstørrelser fra 28.000X til 92.000X og 40 bilder per sekund. Juster eksponeringstidene for å minimere stråleskader på prøven og bruk et defokusområde på minus en til fire mikrometer ved den angitte forstørrelsen. Hvis en tykk løsning oppstår, bruk høyere defokuseringsverdier eller velg et annet interesseområde.Sørg for at løsningen er til stede i prøvene gjennom hele bildeøkten ved å fokusere elektronstrålen på et offerområde som ikke brukes til datainnsamling før bobler dannes. Analyser filmer for SARS-CoV-2-partikler ved hjelp av RELION-3.0.8-programmet eller annen bildebehandlingsprogramvare. Utfør bevegelseskorreksjon ved hjelp av MotionCor2-programmet.Når de er korrigert, trekker du ut partikler ved hjelp av autoplukkingsverktøyet i programvarepakken for programmet. Typiske boksstørrelser er 330 piksler for flytende prøver og 350 piksler for isprøver. Beregn de første rekonstruksjonene ved hjelp av C1-symmetri med programmets 3D-modellrutine og ab initio-modellalternativene i databehandlingsprogramvarepakken.Utfør deretter forbedringsprotokoller i databehandlingsprogramvaren. Undersøk resultatene ved hjelp av en programvarepakke for molekylær strukturanalyse mens du vurderer dynamiske endringer. En sammenligning av væske-EM- og kryo-EM-strukturer i adeno-assosiert virussubtype tre eller AAV er vist her.De representative bildene viser strukturen til AAV i løsningen og i is. Rotasjonsvisningene av AAV VP1-underenheten ekstrahert fra væske- og isstrukturene er vist her. Disse bildene representerer de dynamiske verdiene i væskestrukturene som genereres ved hjelp av morph map-funksjonen i molekylærstrukturanalyseprogramvaren.De gjennomsnittlige strukturene fra flere virussamlinger viser konformasjonsendringer med en endring på nesten 5% diameter målt ved hjelp av EM-data. Et bilde av SARS-CoV-2 subvirale sammenstillinger isolert fra serumfraksjoner fra Covid-19-pasienter er vist her. Disse hvite boblene indikerer tilstedeværelsen av væske i prøven.En EM-rekonstruksjon av disse subvirale samlingene er vist her med fargede radiale tettheter på fem nanometer skiver gjennom kartet. Det representative bildet beskriver analysen av rotavirus dobbeltlags partikler fremstilt i glassaktig is ved hjelp av mikrochip-sandwichteknikken. Bruk av vaskemidler, glyserol, polyetylen, glykoler og høye nivåer av sukker bør minimeres eller unngås for væske-EM-avbildning.Disse reagensene kan introdusere gjenstander, skape overdreven boblende, hydrolyseprodukter og frie radikaler på grunn av stråleskader. Bruken av disse protokollene vil tillate forskere å kunne studere dynamiske prosesser ved atomdetaljer. Og dette spenner over flere fagområder, inkludert medisin, biovitenskap og materialforskning.Protokollene som presenteres her beskriver hvordan state-of-the-art verktøy kan gi et spennende middel til å visualisere biologiske makromolekyler gjennom nye øyne. Det flytende elektronmikroskopifeltet kan heve hvordan vi studerer disse nye virusene som utgjør en trussel mot menneskers helse, kanskje til og med bidrar til våre pandemiberedskapstiltak.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifisering av Plant is-bindende proteiner ved å bedømme is-rekrystallisasjon inhibering og isolering ved bruk av is-affinitetsrensing

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomic skala strukturelle studier av Macromolecular samlinger av Solid-state kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Høyoppløselig Complexome profilering av Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Generering og montering av virusspesifikke nukleocapsids av respiratorisk synytialvirus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Förster resonans energioverføringsmålinger i levende planteceller

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...