Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
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Os autores reconhecem o Dr. Luk H. Vandenberghe (Harvard Medical School, Departamento de Oftalmologia) por fornecer AAV-3 purificado. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Instituto Nacional do Câncer (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 a D.F.K.).

1. Carregamento do suporte do provete para o líquido-EM
<ol><li>Limpe os microchips de nitreto de silício (SiN) incubando cada chip em 150 mL de acetona por 2 min seguido de incubação em 150 mL de metanol por 2 min. Deixe os cavacos secarem em fluxo de ar laminar.</li>
	<li>Limpe a plasma os cavacos secos usando um instrumento de descarga de brilho operando sob condições padrão de 30 W, 15 mA por 45 s usando gás argônio.</li>
	<li>Coloque um microchip de base seca na ponta do suporte da amostr...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-SiN+&#8211;+An+alternative+substrate+to+visualize+active+viral+assemblies.">Cryo-SiN &#8211; An alternative substrate to visualize active viral assemblies.</a> Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).</li><li>Solares, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+disease-relevant+p53.">Microchip-based structure determination of disease-relevant p53.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).</li><li>Casasanta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

Novas oportunidades são apresentadas para agilizar os fluxos de trabalho atuais de EM líquido usando novas ferramentas e tecnologias automatizadas adaptadas do campo crio-EM. As aplicações que envolvem a nova técnica de sanduíche de microchip são significativas em relação a outros métodos, pois permitem a análise de imagens de alta resolução em gelo líquido ou vítreo. Uma das etapas mais críticas do protocolo é a produção de espécimes com a espessura líquida ideal para visualizar detalhes requintados...

A pesquisa biomédica melhora nossa compreensão da saúde e da doença humanas através do desenvolvimento de novas tecnologias. A imagem de alta resolução está transformando nossa visão do nanomundo - permitindo-nos estudar células e moléculas em detalhes requintados 1,2,3,4,5. Informações estáticas de componentes dinâmicos, como polímeros moles, conjuntos de proteínas ou vírus humanos, revelam apenas um instantâneo limitado de sua narrativa complexa. Para entender melhor como as entidades moleculares operam, sua estrutura e função devem ser investigadas em conjunto.
Avanços recentes na produção de materiais como grafeno atomicamente fino ou microchips à base de silício oferecem novas oportunidades para análise estrutura-função em tempo real usando microscópios eletrônicos de transmissão (METs). Esses materiais podem criar câmaras hermeticamente seladas para imagens EM ao vivo 6,7,8,9,10,11. O novo campo de EM-líquido, o correlato de temperatura ambiente com o crio-EM, fornece visões sem precedentes de materiais duros ou macios em solução, permitindo que os cientistas estudem simultaneamente a estrutura e a dinâmica de sua amostra. As aplicações de EM líquido incluem registros em tempo real de nanopartículas terapêuticas interagindo com células-tronco cancerígenas, bem como mudanças nos meandros moleculares de patógenos virais12,13,14.
Assim como os avanços metodológicos estimularam a revolução da resolução no campo da crio-EM, novas técnicas e métodos são necessários para ampliar o uso do líquido-EM como uma ferramenta de alto rendimento para a comunidade científica. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é simplificar os protocolos de preparação de amostras líquidas-EM. A lógica por trás das técnicas desenvolvidas é empregar novos projetos de microchips e dispositivos de carregador automático, adequados para a coleta de dados líquidos e crio-EM (Figura 1)7,14,15,16,17. Os conjuntos são selados mecanicamente usando clipes de grade padrão para instrumentos automatizados, como o Krios, que pode acomodar várias amostras por sessão ou um TEM F200C (Figura 2). Essa metodologia expande o uso de imagens de alta resolução para além das aplicações padrão de crio-EM, demonstrando propósitos mais amplos para análise de materiais em tempo real.
No presente artigo em vídeo, são apresentados protocolos para a preparação de conjuntos de vírus em líquido com e sem suportes de espécimes comercialmente disponíveis. Usando o suporte de amostra especializado para EM-líquido, espécimes líquidos finos podem fornecer informações estruturais comparáveis às amostras crio-EM, bem como insights dinâmicos dos espécimes. Também são demonstrados métodos para preparar amostras líquidas usando ferramentas de carregador automático para rotinas de alto rendimento. A principal vantagem sobre outras técnicas é que a produção automatizada de amostras permite que o usuário avalie rapidamente suas amostras quanto à espessura ideal e dosagem de elétrons antes da coleta de dados. Essa técnica de triagem identifica rapidamente áreas ideais para gravações em tempo real em líquido ou gelo12,14,18,19. Para fins de determinação da estrutura 3D, o líquido-EM pode complementar os métodos crio-EM estabelecidos há muito tempo implementados no crio-EM. Os leitores que empregam tecnologias convencionais de TEM ou crio-EM podem considerar o uso de fluxos de trabalho líquido-EM para fornecer observações novas e dinâmicas de suas amostras de uma maneira que complemente suas estratégias atuais.
As amostras de vírus utilizadas neste protocolo incluem o vírus adenoassociado purificado subtipo 3 (AAV) obtido como presente e cultivado em condições padrão12. Também foram utilizados conjuntos subvirais não infecciosos do SARS CoV-2 derivados do soro de pacientes com COVID-1912 e obtidos de fonte comercial. Finalmente, partículas purificadas de dupla camada (DLPs) do rotavírus símio (cepa SA11) foram obtidas do laboratório da Dra. Sarah M. McDonald Esstman na Wake Forest University e cultivadas usando condições padrão 6,17. Os pacotes de software descritos aqui estão disponíveis gratuitamente e os links foram fornecidos na seção Tabela de Materiais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

O interesse na microscopia líquida-eletrônica (EM-líquido) disparou nos últimos anos, já que os cientistas agora podem observar processos em tempo real em nanoescala. É extremamente desejável emparelhar informações crio-EM de alta resolução com observações dinâmicas, pois muitos eventos ocorrem em escalas de tempo rápidas - na faixa de milissegundos ou mais rápido. Um melhor conhecimento de estruturas flexíveis também pode ajudar no projeto de novos reagentes para combater patógenos emergentes, como o SARS-CoV-2. Mais importante ainda, a visualização de materiais biológicos em um ambiente fluido fornece um vislumbre único de seu desempenho no corpo humano. Apresentamos aqui métodos recém-desenvolvidos para investigar as propriedades em nanoescala de conjuntos de vírus em gelo líquido e vítreo. Para atingir esse objetivo, amostras bem definidas foram utilizadas como sistemas modelo. Comparações lado a lado dos métodos de preparação de amostras e informações estruturais representativas são apresentadas. Características sub-nanômetros são mostradas para estruturas resolvidas na faixa de ~3,5-Å-10 Å. Outros resultados recentes que apoiam essa estrutura complementar incluem insights dinâmicos de candidatas a vacinas e terapias baseadas em anticorpos com imagens em líquido. No geral, essas aplicações correlativas avançam nossa capacidade de visualizar a dinâmica molecular, fornecendo um contexto único para seu uso na saúde e na doença humanas.

Um TEM líquido operando a 200 kV foi utilizado para todos os experimentos de imagem de EM líquido e um TEM crio-TEM operando a 300 kV foi usado para toda a coleta de dados de crio-EM. Imagens representativas e estruturas de vários vírus são apresentadas para demonstrar a utilidade dos métodos em vários sujeitos de teste. Estes incluem vírus adenoassociado recombinante subtipo 3 (AAV), SARS-CoV-2 sub-conjuntos virais derivados do soro do paciente e partículas de dupla camada de rotavírus símio (DLPs), cepa SA11...

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Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Aqui os protocolos são descritos para preparar conjuntos de vírus adequados para análise líquido-EM e crio-EM em nanoescala usando microscopia eletrônica de transmissão.

Avançando a imagem de alta resolução de conjuntos de vírus em líquido e gelo

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

O interesse na microscopia eletrônica líquida disparou nos últimos anos, como podemos visualizar agora nos processos em tempo real em nanoescala. Um melhor conhecimento sobre essas estruturas flexíveis pode nos ajudar a desenvolver novos reagentes para combater patógenos emergentes, como o SARS-CoV-2. Ver proteínas em um ambiente fluido ajuda a imitar sistemas biológicos e nos dá a oportunidade de olhar para as proteínas de uma maneira mais dinâmica.E este experimento mostrará novas técnicas sobre como usar e visualizar proteínas em ambientes de gelo vítreo e líquido. Resultados recentes incluem insights dinâmicos de candidatas a vacinas em terapias baseadas em anticorpos com imagens em líquido. As aplicações correlativas de líquido e crio-EM avançam nossa capacidade de visualizar a dinâmica molecular, fornecendo um contexto único para a saúde e a doença humanas.Os leitores que empregam tecnologias convencionais de TEM ou crio-EM podem considerar a implementação de fluxos de trabalho de EM líquidos para fornecer novas observações dinâmicas de suas amostras de uma forma que complemente suas estratégias atuais. Os sistemas de EM líquido comercialmente disponíveis podem fornecer fluxo, mistura, estímulos eletroquímicos e controle de temperatura, que são essenciais para muitas aplicações de imagem em tempo real. O método sanduíche de microchip apresentado aqui descreve uma maneira simples de nível de entrada para visualizar primeiro os espécimes em líquido antes de dar o salto para um sistema comercial mais complexo para experimentos in situ.Para começar, limpe os microchips de nitreto de silício incubando cada chip em 150 mililitros de acetona por dois minutos, seguido de incubação em 150 mililitros de metanol por dois minutos. Deixe os cavacos secarem em um fluxo de ar laminar. Limpe a plasma os cavacos secos usando um instrumento de descarga de brilho operando em condições padrão por 45 segundos usando gás argônio.Em seguida, carregue um microchip de base seca na ponta do suporte da amostra e adicione cerca de 0,2 microlitros da amostra ao chip de base. Depois de incubar por um a dois minutos, coloque o chip superior no chip de base úmida que contém a amostra. Plante o conjunto em conjunto para formar um invólucro hermeticamente selado mantido no lugar mecanicamente por três parafusos de latão.Bombeie a ponta para 10 para o torr de menos seis usando uma estação de bombeamento seco com bombeamento turbo. O suporte está agora pronto para ser inserido no TEM. O plasma limpa os microchips e as grades de carbono usando um instrumento de descarga de brilho por 45 segundos.E adicione cerca de dois microlitros de amostra a um microchip descarregado de brilho colocado em um pacote de gel. Retire o excesso de solução usando papel de filtro ou uma pipeta e incube por um a dois minutos. Em seguida, adicione a grade de carbono descarregada por brilho ao microchip úmido que contém a amostra.Plante o conjunto em conjunto usando um único suporte de amostra de inclinação à temperatura ambiente para formar um invólucro hermeticamente fechado. Como alternativa, use clipes de grade do carregador automático e coloque o conjunto sanduíche no clipe C inferior. Coloque o clipe superior em cima do conjunto e use a ferramenta de fixação padrão para selar o conjunto.O espécime está agora pronto para ser inserido no TEM. Examine as amostras colocadas em carregadores automáticos sob condições criogênicas ou à temperatura ambiente. Para imagens de EM líquido, carregue o suporte da amostra no MET equipado com um canhão de emissão de campo e opere a 200 quilovolts.Ligue a pistola e ajuste a altura eucêntrica do estágio do microscópio em relação à amostra usando a função oscilante, inclinando a amostra de menos 15 graus para mais 15 graus na coluna. Este procedimento ajusta o estágio na direção Z para acomodar a espessura da amostra e ajuda a garantir uma ampliação precisa durante a gravação da imagem. Grave imagens como filmes longos emoldurados ou imagens individuais usando o pacote de software de coleta de dados seriais, implementando rotinas de imagem automatizadas.Adquira imagens em condições de baixa dose em ampliações que variam de 28.000X a 92, 000X e 40 quadros por segundo. Ajuste os tempos de exposição para minimizar os danos do feixe à amostra e use uma faixa de desfocagem de menos um a quatro micrômetros na ampliação especificada. Se uma solução espessa for encontrada, use valores de desfocagem mais altos ou selecione uma região diferente de interesse.Certifique-se de que a solução esteja presente nas amostras durante toda a sessão de imagem, concentrando o feixe de elétrons em uma área de sacrifício não usada para coleta de dados até que as bolhas sejam formadas. Analise filmes para partículas de SARS-CoV-2 usando o programa RELION-3.0.8 ou qualquer outro software de processamento de imagem. Execute a correção de movimento usando o programa MotionCor2.Uma vez corrigido, extraia partículas usando a ferramenta de seleção automática no pacote de software do programa. Os tamanhos típicos das caixas são de 330 pixels para espécimes líquidos e 350 pixels para espécimes de gelo. Calcule as reconstruções iniciais usando a simetria C1 com a rotina do modelo inicial 3D do programa e as opções do modelo ab initio no pacote de software de processamento de dados.Em seguida, execute protocolos de refinamento no software de processamento de dados. Examine os resultados usando um pacote de software de análise de estrutura molecular enquanto avalia as mudanças dinâmicas. Uma comparação das estruturas líquido-EM e crio-EM no subtipo de vírus adenoassociado três ou AAV é mostrada aqui.As imagens representativas mostram a estrutura do AAV na solução e no gelo. As vistas rotacionais da subunidade AAV VP1 extraídas das estruturas líquidas e de gelo são mostradas aqui. Essas imagens representam os valores dinâmicos nas estruturas líquidas geradas usando a função morph map no software de análise de estrutura molecular.As estruturas médias de vários conjuntos de vírus mostram mudanças conformacionais com uma mudança de diâmetro de quase 5% medida usando dados EM. Uma imagem de conjuntos subvirais do SARS-CoV-2 isolados de frações séricas de pacientes com COVID-19 é mostrada aqui. Essas bolhas brancas indicam a presença de líquido na amostra.Uma reconstrução EM desses conjuntos subvirais é mostrada aqui com densidades radiais coloridas a cinco fatias nanométricas através do mapa. A imagem representativa descreve a análise de partículas de dupla camada de rotavírus preparadas em gelo vítreo utilizando a técnica de sanduíche de microchip. O uso de detergentes, glicerol, polietileno, glicóis e altos níveis de açúcares deve ser minimizado ou evitado para imagens líquidas-EM.Esses reagentes podem introduzir artefatos, criar borbulhamento excessivo, produtos de hidrólise e radicais livres devido a danos no feixe. O uso desses protocolos permitirá que os cientistas possam estudar processos dinâmicos em detalhes atômicos. E isso se estende por vários campos da ciência, incluindo medicina, ciências da vida e pesquisa de materiais.Os protocolos apresentados aqui descrevem como ferramentas de última geração podem fornecer um meio empolgante de visualizar macromoléculas biológicas através de novos olhos. O campo da microscopia eletrônica líquida pode elevar a forma como estudamos esses novos vírus que representam uma ameaça à saúde humana, talvez até contribuindo para nossas medidas de preparação para a pandemia.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificação de Proteínas de gelo Planta de ligao por meio da avaliação da Inibição de gelo-recristalização e isolamento utilizando purificação por afinidade de gelo

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Bioquímica

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Medidas de transferência de energia de ressonância förster em células vegetais vivas

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...