Name: advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice
Uploaded: 2022-07-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Авторы выражают признательность доктору Луку Х. Ванденберге (Гарвардская медицинская школа, отделение офтальмологии) за предоставление очищенного AAV-3. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения и Национальным институтом рака (R01CA193578, R01CA227261, R01CA219700 до D.F.K.).

1. Загрузка держателя образца для жидкости-EM
<ol><li>Очистите микрочипы нитрида кремния (SiN), инкубируя каждый чип в 150 мл ацетона в течение 2 мин с последующей инкубацией в 150 мл метанола в течение 2 мин. Дайте стружке высохнуть в ламинарном воздушном потоке.</li>
	<li>Плазменная очистка ...

<ol>
	<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+structure,+function+and+regulation+of+type+III+secretion+systems.">Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (6), 323-337 (2017).</li><li>Oikonomou, C. M., Chang, Y. -. W., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+view+into+prokaryotic+cell+biology+from+electron+cryotomography.">A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 205-220 (2016).</li><li>Murata, K., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+for+structural+analysis+of+dynamic+biological+macromolecules.">Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules.</a> Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 324-334 (2018).</li><li>DiMaio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+accuracy+models+from+4.5+&#197;+cryo-electron+microscopy+data+with+density-guided+iterative+local+refinement.">Atomic accuracy models from 4.5 &#197; cryo-electron microscopy data with density-guided iterative local refinement.</a> Nature Methods. 12 (4), 361-365 (2015).</li><li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+protein+synthesis+based+on+cryo-electron+microscopy+of+the+E.+coli+ribosome.">A model of protein synthesis based on cryo-electron microscopy of the E. coli ribosome.</a> Nature. 376 (6539), 441-444 (1995).</li><li>Dukes, M. J., Gilmore, B. L., Tanner, J. R., McDonald, S. M., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+of+biological+assemblies+in+liquid.">In situ TEM of biological assemblies in liquid.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50936 (2013).</li><li>Dearnaley, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-cell+electron+tomography+of+biological+systems.">Liquid-cell electron tomography of biological systems.</a> Nano Letters. 19 (10), 6734-6741 (2019).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+wet+biological+samples+by+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy.">Direct observation of wet biological samples by graphene liquid cell transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 15 (7), 4737-4744 (2015).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Motion+of+DNA-Au+nanoconjugates+in+graphene+liquid+cell+electron+microscopy.">3D Motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy.</a> Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Wang, X., Yang, J., Andrei, C. M., Soleymani, L., Grandfield, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+of+calcium+phosphate+revealed+by+in+situ+liquid-phase+electron+microscopy.">Biomineralization of calcium phosphate revealed by in situ liquid-phase electron microscopy.</a> Communications Chemistry. 1, 80 (2018).</li><li>Jonaid, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+human+viruses+in+liquid+droplets.">High-resolution imaging of human viruses in liquid droplets.</a> Advanced Materials. 33 (37), 2103221 (2021).</li><li>Pohlmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+nanoparticles+interacting+with+glioblastoma+stem+cells.">Real-time visualization of nanoparticles interacting with glioblastoma stem cells.</a> Nano Letters. 15 (4), 2329-2335 (2015).</li><li>Jonaid, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tools+to+advance+high-resolution+imaging+in+liquid.">Automated tools to advance high-resolution imaging in liquid.</a> Microscopy and Microanalysis. , 1-10 (2022).</li><li>Varano, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customizable+cryo-EM+chips+improve+3D+analysis+of+macromolecules.">Customizable cryo-EM chips improve 3D analysis of macromolecules.</a> Microscopy and Microanalysis. 25, 1310-1311 (2019).</li><li>Alden, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM-on-a-chip:+Custom-designed+substrates+for+the+3D+analysis+of+macromolecules.">Cryo-EM-on-a-chip: Custom-designed substrates for the 3D analysis of macromolecules.</a> Small. 15 (21), 1900918 (2019).</li><li>Tanner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-SiN+&#8211;+An+alternative+substrate+to+visualize+active+viral+assemblies.">Cryo-SiN &#8211; An alternative substrate to visualize active viral assemblies.</a> Journal of Analytical and Molecular Techniques. , (2016).</li><li>Solares, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+disease-relevant+p53.">Microchip-based structure determination of disease-relevant p53.</a> Analytical Chemistry. 92 (23), 15558-15564 (2020).</li><li>Casasanta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microchip-based+structure+determination+of+low-molecular+weight+proteins+using+cryo-electron+microscopy.">Microchip-based structure determination of low-molecular weight proteins using cryo-electron microscopy.</a> Nanoscale. 13 (15), 7285-7293 (2021).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+data+acquisition+from+electron+microscopes+with+SerialEM.">Advanced data acquisition from electron microscopes with SerialEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 24, 864-865 (2018).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera&#8212;A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera&#8212;A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera.">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li><li>Lerch, T. F., Xie, Q., Chapman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+adeno-associated+virus+serotype+3B+(AAV-3B):+Insights+into+receptor+binding+and+immune+evasion.">The structure of adeno-associated virus serotype 3B (AAV-3B): Insights into receptor binding and immune evasion.</a> Virology. 403 (1), 26-36 (2010).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+grid-based+cryo-EM+of+PKC+binding+to+RACK1+on+the+ribosome.">Affinity grid-based cryo-EM of PKC binding to RACK1 on the ribosome.</a> Journal of Structural Biology. 181 (2), 190-194 (2013).</li><li>Kiss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+enveloped+viruses+on+affinity+grids+for+downstream+cryo-electron+microscopy+applications.">Capturing enveloped viruses on affinity grids for downstream cryo-electron microscopy applications.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (1), 164-174 (2014).</li><li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+affinity+capture+devices&#8212;a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy.">The development of affinity capture devices&#8212;a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc Advances. 2 (6), 2408-2412 (2012).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes.">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184 (4132), 77-78 (1974).</li><li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers.">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5068-5072 (1974).</li><li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+object.">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological object.</a> Advances in Biological and Medical Physics. 15, 161-270 (1974).</li><li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily.">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186 (4162), 407-414 (1974).</li><li>Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+diffraction+of+wet+proteins:+Catalase.">Electron diffraction of wet proteins: Catalase.</a> Science. 177 (4045), 268-270 (1972).</li></ol>

Открываются новые возможности для оптимизации текущих рабочих процессов жидкостной ЭМ за счет использования новых автоматизированных инструментов и технологий, адаптированных из области крио-ЭМ. Приложения, связанные с новой технологией сэндвичей с микрочипами, важны по сравнению с...

Биомедицинские исследования улучшают наше понимание здоровья человека и болезней путем разработки новых технологий. Визуализация с высоким разрешением трансформирует наш взгляд на наномир, позволяя нам изучать клетки и молекулы в мельчайших деталях 1,2,3,4,5. Статическая информация о динамических компонентах, таких как мягкие полимеры, белковые сборки или человеческие вирусы, показывает лишь ограниченный снимок их сложного повествования. Чтобы лучше понять, как работают молекулярные объекты, их структура и функция должны быть совместно исследованы.
Последние достижения в производстве таких материалов, как атомарно тонкий графен или микрочипы на основе кремния, предоставляют новые возможности для анализа структуры и функции в режиме реального времени с использованием просвечивающих электронных микроскопов (TEM). Эти материалы могут создавать герметично закрытые камеры для живой ЭМ-визуализации 6,7,8,9,10,11. Новое поле жидкости-ЭМ, комнатная температура коррелирует с крио-ЭМ, обеспечивает беспрецедентные представления твердых или мягких материалов в растворе, позволяя ученым одновременно изучать структуру и динамику их образца. Приложения Liquid-EM включают записи в реальном времени терапевтических наночастиц, взаимодействующих с раковыми стволовыми клетками, а также изменения в молекулярных тонкостях вирусных патогенов 12,13,14.
Так же, как методологические достижения стимулировали революцию разрешения в области крио-ЭМ, необходимы новые методы и методы для расширения использования жидкой ЭМ в качестве высокопроизводительного инструмента для научного сообщества. Общая цель методов, представленных здесь, заключается в оптимизации протоколов подготовки образцов жидкостной ЭМ. Обоснование разработанных методов заключается в использовании новых конструкций микрочипов и устройств автозагрузки, подходящих как для сбора жидкостных, так и крио-ЭМ данных (рисунок 1)7,14,15,16,17. Сборки механически герметизированы с использованием стандартных сетчатых зажимов для автоматизированных приборов, таких как Krios, которые могут вмещать несколько образцов за сеанс или F200C TEM (рисунок 2). Эта методология расширяет использование изображений с высоким разрешением за пределы стандартных крио-ЭМ-приложений, демонстрируя более широкие цели для анализа материалов в режиме реального времени.
В текущей видеостатье представлены протоколы подготовки вирусных сборок в жидкости с коммерчески доступными держателями образцов и без них. Использование специализированного держателя образцов для жидких ЭМ, тонких жидких образцов может предоставить структурную информацию, сопоставимую с крио-ЭМ-образцами, а также динамическое понимание образцов. Также продемонстрированы методы подготовки жидких образцов с использованием инструментов автозагрузчика для высокопроизводительных процедур. Основным преимуществом по сравнению с другими методами является то, что автоматизированное производство образцов позволяет пользователю быстро оценивать свои образцы для оптимальной толщины и дозировки электронов до сбора данных. Этот метод скрининга быстро определяет идеальные области для записи в реальном времени в жидкости или льду 12,14,18,19. Для целей 3D-определения структуры жидкость-ЭМ может дополнять давно устоявшиеся крио-ЭМ методы, реализованные в крио-ЭМ. Читатели, использующие обычные технологии ТЕА или крио-ЭМ, могут рассмотреть возможность использования рабочих процессов жидкостной ЭМ для обеспечения новых, динамических наблюдений за своими образцами таким образом, чтобы дополнить их текущие стратегии.
Образцы вирусов, используемые в этом протоколе, включают очищенный аденоассоциированный вирус подтипа 3 (AAV), полученный в качестве подарка и культивируемый в стандартных условиях12. Также использовались неинфекционные СУБВИРУСНЫЕ сборки SARS CoV-2, полученные из сыворотки 12 пациентов сCOVID-19 и полученные из коммерческого источника. Наконец, очищенные обезьяньи ротавирус (штамм SA11) двухслойные частицы (DLP) были получены из лаборатории доктора Сары М. Макдональд Эссен в Университете Уэйк Форест и культивированы с использованием стандартных условий 6,17. Пакеты программного обеспечения, описанные здесь, находятся в свободном доступе, а ссылки были предоставлены в разделе «Таблица материалов».

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A11-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader clipping tool</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also SubAngstrom supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoloader grid clips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>top and bottom clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon-coated gold EM grids</td>
			<td>Electron Microcopy Sciences</td>
			<td>CF400-AU-50</td>
			<td>400-mesh, 5-nm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVID-19 patient serum</td>
			<td>RayBiotech</td>
			<td>CoV-Pos-S-500</td>
			<td>500 microliters of PCR+ serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A412-1</td>
			<td>1 Liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwell-integrad microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPB-42A1-10</td>
			<td>10x10-mm window arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore Inc.</td>
			<td>SN100-A10Q33B</td>
			<td>9 large windows, 10-nn thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMWindows microchips</td>
			<td>Simpore, Inc.&#160;</td>
			<td>SN100-A05Q33A</td>
			<td>9 small windows, 5-nm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top microchips</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td>EPT-50W</td>
			<td>500 mm x 100 mm window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #1 filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>100 pieces, 90 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DirectView direct electron detector</td>
			<td>Direct Electron</td>
			<td></td>
			<td>6-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 3 EC direct electron detector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>14-micron pixel spacing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatan 655 Dry pump station</td>
			<td>Gatan, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Pump holder tip to 10-6 range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark IV Vitrobot</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>state-of-the-art specimen preparation unit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow, glow discharge unit</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Negative polarity mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poseidon Select specimen holder</td>
			<td>Protochips, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>&#160;FEI compatible;specimen holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talos F200C TEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>200 kV; Liquid-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G3</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>300 kV; Cryo-TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freely available software</td>
			<td>Website link</td>
			<td></td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoSPARC</td>
			<td>https://cryosparc.com/</td>
			<td></td>
			<td>other image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTFFIND4</td>
			<td>https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4</td>
			<td></td>
			<td>CTF finding program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MotionCorr2</td>
			<td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RELION</td>
			<td>https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php?title=Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SerialEM</td>
			<td>https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UCSF Chimera</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
			<td></td>
			<td>molecular structure analysis software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice

Интерес к жидкостно-электронной микроскопии (liquid-EM) резко возрос в последние годы, поскольку ученые теперь могут наблюдать процессы в режиме реального времени на наноуровне. Крайне желательно сочетать крио-ЭМ-информацию высокого разрешения с динамическими наблюдениями, так как многие события происходят в быстрых временных масштабах - в миллисекундном диапазоне или быстрее. Улучшенные знания о гибких структурах также могут помочь в разработке новых реагентов для борьбы с новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Что еще более важно, просмотр биологических материалов в жидкой среде дает уникальное представление об их производительности в организме человека. Здесь представлены недавно разработанные методы исследования наноразмерных свойств вирусных сборок в жидком и стекловидном льду. Для достижения этой цели в качестве модельных систем использовались четко определенные образцы. Представлены параллельные сравнения методов пробоподготовки и репрезентативной структурной информации. Субнанометровые особенности показаны для структур, разрешенных в диапазоне ~3,5-Å-10 Å. Другие недавние результаты, которые поддерживают эту дополнительную структуру, включают динамическое понимание кандидатов на вакцину и терапии на основе антител, изображенной в жидкости. В целом, эти коррелятивные приложения повышают нашу способность визуализировать молекулярную динамику, обеспечивая уникальный контекст для их использования в здоровье человека и болезнях.

Жидкость-ТЭМ, работающая на 200 кВ, использовалась для всех экспериментов по визуализации жидких ЭМ, а крио-ТЭМ, работающий на 300 кВ, использовался для сбора всех крио-ЭМ данных. Репрезентативные изображения и структуры нескольких вирусов представлены, чтобы продемонстрировать полезност...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice at JoVE.com

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Здесь описаны протоколы для подготовки вирусных сборок, пригодных для жидкостно-ЭМ и крио-ЭМ анализа на наноуровне с использованием просвечивающей электронной микроскопии.

Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...

Интерес к жидкостной электронной микроскопии резко возрос в последние годы, поскольку теперь мы можем визуализировать на наноуровне процессы реального времени. Улучшенные знания об этих гибких структурах могут помочь нам в разработке новых реагентов для борьбы с новыми патогенами, такими как SARS-CoV-2. Просмотр белков в жидкой среде помогает имитировать биологические системы и дает нам возможность взглянуть на белки более динамичным образом.И этот эксперимент покажет вам новые методы использования и визуализации белков как в стекловидном льду, так и в жидкой среде. Последние результаты включают динамическое понимание вакцин-кандидатов в терапии на основе антител, изображенной в жидкости. Коррелятивные жидкостные и крио-ЭМ-приложения повышают нашу способность визуализировать молекулярную динамику, обеспечивая уникальный контекст для здоровья и болезней человека.Читатели, использующие обычные технологии ТЭМ или крио-ЭМ, могут рассмотреть возможность внедрения рабочих процессов жидких ЭМ для обеспечения новых динамических наблюдений за своими образцами таким образом, чтобы дополнить их текущие стратегии. Коммерчески доступные жидкостно-электромагнитные системы могут обеспечивать поток, смешивание, электрохимические стимулы и контроль температуры, которые необходимы для многих приложений визуализации в режиме реального времени. Представленный здесь метод сэндвича с микрочипами описывает простой способ начального уровня для первого просмотра образцов в жидкости, прежде чем перейти к более сложной коммерческой системе для экспериментов in situ.Для начала очистите микрочипы нитрида кремния, инкубируя каждый чип в 150 миллилитрах ацетона в течение двух минут, с последующей инкубацией в 150 миллилитрах метанола в течение двух минут. Дайте стружке высохнуть в ламинарном воздушном потоке. Плазменная очистка высушенной стружки с помощью прибора тлеющего разряда, работающего в стандартных условиях в течение 45 секунд с использованием газа аргона.Затем загрузите микрочип сухим основанием в наконечник держателя образца и добавьте около 0,2 микролитра образца в базовый чип. После инкубации в течение одной-двух минут поместите верхний чип на влажную основу, содержащую образец. Сажьте сборку вместе, чтобы сформировать герметично закрытый корпус, механически удерживаемый на месте тремя латунными винтами.Накачайте наконечник до 10 до минус шести торр с помощью турбонасосной сухой насосной станции. Теперь держатель готов к установке в ТЕА. Плазменная очистка микрочипов и углеродных решеток с помощью прибора тлеющего разряда в течение 45 секунд.И добавьте около двух микролитров образца к микрочипу с разряженным свечением, помещенному на гелевую упаковку. Удалите лишний раствор с помощью фильтровальной бумаги или пипетки и высиживайте в течение одной-двух минут. Затем добавьте тлеющую разряженную углеродную сетку к мокрому микрочипу, содержащему образец.Посадите сборку вместе, используя один держатель для наклонных образцов при комнатной температуре, чтобы сформировать герметично закрытый корпус. Кроме того, можно использовать зажимы сетки автозагрузчика и поместить сэндвич-узел на нижний зажим C. Поместите верхний зажим поверх сборки и используйте стандартный зажимной инструмент, чтобы запечатать узел вместе.В настоящее время образец готов к включению в ТЕА. Исследуйте образцы, помещенные в автозагрузчики в криоаналиматах или при комнатной температуре. Для получения жидкостно-электромагнитной визуализации загрузите держатель образца в ТЕА, оснащенный полевой эмиссионной пушкой, и работайте при 200 киловольтах.Включите пистолет и отрегулируйте эйцентрическую высоту ступени микроскопа по отношению к образцу с помощью функции воблера, наклонив образец от минус 15 градусов до плюс 15 градусов в колонне. Эта процедура регулирует ступень в направлении Z, чтобы приспособиться к толщине образца и помогает обеспечить точное увеличение во время записи изображения. Записывайте изображения в виде длинных кадров или отдельных изображений с помощью программного пакета для сбора последовательных данных, реализуя автоматизированные процедуры обработки изображений.Получайте изображения в условиях низких доз с увеличением от 28 000X до 92 000X и 40 кадров в секунду. Отрегулируйте время экспозиции, чтобы свести к минимуму повреждение луча образцом, и используйте диапазон расфокусировки от минус одного до четырех микрометров при указанном увеличении. При обнаружении толстого раствора используйте более высокие значения расфокусировки или выберите другую интересующую область.Убедитесь, что раствор присутствует в образцах на протяжении всего сеанса визуализации, фокусируя электронный пучок на жертвенной области, не используемой для сбора данных, пока не образуются пузырьки. Анализируйте фильмы на наличие частиц SARS-CoV-2 с помощью программы RELION-3.0.8 или любого другого программного обеспечения для обработки изображений. Выполните коррекцию движения с помощью программы MotionCor2.После исправления извлекайте частицы с помощью инструмента автоподбора в программном пакете. Типичные размеры коробки составляют 330 пикселей для жидких образцов и 350 пикселей для образцов льда. Рассчитайте начальные реконструкции, используя симметрию C1 с помощью процедуры начальной 3D-модели программы и параметров модели ab initio в программном пакете для обработки данных.Затем выполните уточнение протоколов в программном обеспечении для обработки данных. Изучите результаты с помощью программного пакета для анализа молекулярной структуры при оценке динамических изменений. Здесь показано сравнение жидких ЭМ и крио-ЭМ структур в аденоассоциированном вирусе третьего подтипа или AAV.Репрезентативные изображения показывают структуру AAV в растворе и во льду. Здесь показаны вращательные виды субъединицы AAV VP1, извлеченной из жидких и ледяных структур. Эти изображения представляют динамические значения в жидких структурах, генерируемых с помощью функции морфной карты в программном обеспечении для анализа молекулярной структуры.Средние структуры из нескольких вирусных сборок показывают конформационные изменения с почти 5% изменением диаметра, измеренным с использованием электромагнитных данных. Здесь показано изображение субвирусных сборок SARS-CoV-2, выделенных из сывороточных фракций пациентов с COVID-19. Эти белые пузырьки указывают на наличие жидкости в образце.Эм-реконструкция этих субвирусных сборок показана здесь с цветными радиальными плотностями на пяти нанометровых срезах через карту. Репрезентативное изображение описывает анализ ротавирусных двухслойных частиц, приготовленных в стекловидном льду с использованием метода сэндвича с микрочипом. Использование моющих средств, глицерина, полиэтилена, гликолей и высоких уровней сахара следует свести к минимуму или избегать для визуализации жидкостной ЭМ.Эти реагенты могут вводить артефакты, создавать чрезмерное пузырьки, продукты гидролиза и свободные радикалы из-за повреждения пучка. Использование этих протоколов позволит ученым иметь возможность изучать динамические процессы в атомных деталях. И это охватывает несколько областей науки, включая медицину, науки о жизни и исследования материалов.Представленные здесь протоколы описывают, как современные инструменты могут обеспечить захватывающие средства для визуализации биологических макромолекул новыми глазами. Область жидкостной электронной микроскопии может повысить то, как мы изучаем эти новые вирусы, которые представляют угрозу для здоровья человека, возможно, даже способствуя нашим мерам по обеспечению готовности к пандемии.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

Генерация и сборка вирус-специфических нуклеокапсидов респираторно-синцитиального вируса

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Measurements in Living Plant Cells

Измерения резонансного переноса энергии Фёрстера в живых растительных клетках

Sensitized emission-based F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) experiments are easily done but depend on the microscopic setup. Confocal laser ...