Name: induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-09-09T12:30:00
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Les auteurs reconnaissent le soutien de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) et du State Key Laboratory of Drug Research.

Le Comité de protection des animaux de l’Université de Tongji a approuvé le présent travail et toutes les directives en matière de soins aux animaux ont été suivies. Des souris C57BL / 6J mâles ou femelles âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées pour les expériences. On s’est assuré que l’âge et le sexe étaient les mêmes dans les groupes expérimentaux; sinon, la susceptibilité à la maladie a été affectée. Les souris ont été logées dans un environnement spécifique exempt d’agents pa...

La SEP est une maladie inflammatoire démyélinisante du SNC et est l’un des troubles neurologiques les plus courants causant une invalidité chronique chez les jeunes, imposant un fardeau énorme aux familles et à la société 3,4. La SEP a toujours été classée comme une maladie auto-immune à médiation par les lymphocytes T spécifiques aux organes, incitant le système auto-immun à éroder lentement le SNC, ce qui impliquera plusieurs systèmes dans to...

Les maladies auto-immunes sont un spectre de troubles causés par la réponse immunitaire du système immunitaire à ses propres antigènes entraînant des lésions tissulaires ou un dysfonctionnement1. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique de polyneuropathie du système nerveux central (SNC), caractérisée par une infiltration inflammatoire, une démyélinisation et une dégénérescence axonale neuronale 2,3. À l’heure actuelle, la SEP a touché jusqu’à 2,5 millions de personnes dans le monde, principalement des jeunes et des personnes d’âge moyen âgées de 20 à 40 ans, qui sont souvent l’épine dorsale de leur famille et de la société. Cela a eu un impact et un préjudice considérables pour les familles et la société 2,4.
La SEP est une maladie multifactorielle aux manifestations cliniques diverses et complexes. En plus des troubles neurologiques classiques caractérisés par une infiltration inflammatoire et une démyélinisation, la SEP présente souvent une déficience visuelle, une dyskinésie des membres et des troubles cognitifs et émotionnels 5,6,7. Si les patients atteints de SEP ne reçoivent pas le traitement approprié et correct, la moitié d’entre eux vivront dans des fauteuils roulants après 20 ans, et près de la moitié d’entre eux éprouveront des symptômes dépressifs et anxieux, conduisant à des niveaux beaucoup plus élevés d’idées suicidaires que la population générale 8,9.
Malgré une longue période de recherche, l’étiologie de la SP reste insaisissable et la pathogenèse de la SEP n’a pas encore été élucidée. Les modèles animaux de SP ont permis de servir d’outils de test pour explorer le développement de maladies et de nouvelles approches thérapeutiques, malgré les différences significatives entre les systèmes immunitaire des rongeurs et humains, tout en partageant certains principes de base. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est actuellement le modèle animal idéal pour étudier la SEP, qui utilise l’immunité autoantigénique des protéines de myéline pour induire une auto-immunité aux composants du SNC chez les souris sensibles, avec l’ajout d’adjuvant de Freund complet (CFA) et de toxine de la coqueluche (PTX) pour améliorer la réponse immunitaire humorale. Selon le bagage génétique et les antigènes immunitaires, différents processus pathogènes, y compris aigus, récurrents-rémittents ou chroniques, sont obtenus pour imiter diverses formes cliniques de SEP10,11,12. Les immunogènes pertinents couramment utilisés dans la construction des modèles EAE proviennent de protéines auto-SNC, telles que la protéine basique de myéline (MBP), la protéine protéolipide (PLP) ou la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG). Les souris SJL/L immunisées par MBP ou PLP développent une évolution cyclique récurrente-rémittente et le MOG déclenche une EAE progressive chronique chez les souris C57BL/611,12,13.
L’objectif principal du traitement modificateur de la maladie (DMT) est de minimiser les symptômes de la maladie et d’améliorer la fonction6. Plusieurs médicaments sont utilisés cliniquement pour soulager la SEP, mais aucun médicament n’a encore été utilisé pour la guérir complètement, révélant la nécessité d’un traitement synergique. Les souris C57BL / 6 sont actuellement les plus couramment utilisées pour construire des souris transgéniques, et dans ce travail, un modèle EAE induit par MOG35-55 chez les souris C57BL / 6J avec une échelle de 5 points a été utilisé pour surveiller la progression de la maladie. Les modèles EAE souffrent également d’humeurs anxieuses et de perte osseuse, ainsi que des lésions démyélinisantes largement connues. Ici, la méthode pour évaluer les symptômes de l’EAE à partir de perspectives multiples à l’aide d’un test en plein champ et d’une analyse de micro-tomodensitométrie (Micro-CT) est également décrite.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe(with 26 G needle)</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>HAIKELASI</td>
			<td>KY-LXG2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locomotion activity (open field) video analysis system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td>DigBehv-002</td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55 peptide</td>
			<td>Gill Biochemical Co., Ltd</td>
			<td>GLS-Y-M-03590</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td>
			<td>BD</td>
			<td>231141</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open field reaction chamber</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>516560</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>J21010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing film</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS 234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;CT 35 desktop microCT scanner</td>
			<td>Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune typique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration inflammatoire, une démyélinisation et des lésions axonales. À l’heure actuelle, il n’existe aucune mesure pour guérir complètement la SP, mais de multiples traitements modificateurs de la maladie (DMT) sont disponibles pour contrôler et atténuer la progression de la maladie. Il existe des similitudes significatives entre les caractéristiques pathologiques du SNC des patients atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et de SEP. L’EAE a été largement utilisée comme modèle représentatif pour déterminer l’efficacité des médicaments contre la SP et explorer la mise au point de nouveaux traitements contre la SP. L’induction active de l’EAE chez la souris a un effet stable et reproductible et est particulièrement adaptée à l’étude des effets des médicaments ou des gènes sur la neuroinflammation auto-immune. La méthode d’immunisation des souris C57BL/6J avec la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG35-55) et l’évaluation quotidienne des symptômes de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique sont principalement partagées. Compte tenu de l’étiologie complexe de la SEP avec diverses manifestations cliniques, le système de notation clinique existant ne peut pas satisfaire l’évaluation du traitement de la maladie. Pour éviter les lacunes d’une seule intervention, de nouveaux indicateurs permettant d’évaluer l’EAE en fonction des manifestations cliniques d’humeurs anxieuses et d’ostéoporose chez les patients atteints de SEP sont créés afin de fournir une évaluation plus complète du traitement de la SEP.

Après immunisation des souris, le poids corporel des souris est enregistré quotidiennement et leurs symptômes cliniques sont évalués selon le protocole décrit ci-dessus (étape 4). Chez les souris C57BL / 6J immunisées avec le peptide MOG, parce que l’emplacement de la lésion est principalement confiné à la moelle épinière, la pathogenèse des souris EAE se propage de l’extrémité de la queue à la tête. Au début de la maladie, les souris EAE présentent une faiblesse et un affaissement de la queue, su...

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Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Le présent protocole décrit l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin utilisant la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline et la surveillance du processus de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique. Les symptômes expérimentaux liés à l’encéphalomyélite auto-immune sont analysés à l’aide d’une micro-tomodensitométrie du fémur de souris et d’un test en plein champ pour évaluer le processus de la maladie de manière exhaustive.

Induction et divers indicateurs d’évaluation de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...

Actuellement, il n’existe pas de remède complet pour la sclérose en plaques. Notre protocole permet la construction efficace d’un modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune pour aider à explorer les thérapies de la sclérose en plaques. Le principal avantage de notre protocole est une évaluation plus complète du traitement de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale sous de multiples perspectives.Préparez d’abord l’émulsion de peptide glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline en dissolvant le peptide lyophilisé et le PBS pré-refroidi stérile sans ions calcium et magnésium à pH 7,4. Ajouter une bille d’acier stérilisée de cinq millimètres à un tube microcentrifuge propre de deux millilitres. Ajoutez ensuite 500 microlitres d’adjuvant de Freuds complet contenant cinq milligrammes par millilitre de microbactérie tuberculeuse lyophilisée et 500 microlitres d’émulsion peptidique glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline dans le tube.Maintenant, faites osciller le tube sur un lyser tissulaire pendant 10 minutes. Ensuite, refroidissez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes. Répétez le processus quatre fois jusqu’à ce qu’une solution visqueuse blanche soit formée.Ensuite, diluez la solution de tige de la toxine de la coqueluche 50 fois dans du PBS stérile de pH 7,4 sans ions calcium et magnésium pour obtenir une concentration finale de 200 nanogrammes par 100 microlitres. Pour précipiter toute l’émulsion peptidique glycoprotéique oligodendrocytaire de myéline initialement préparée au fond du tube, centrifuger le tube à quatre degrés Celsius pendant deux à trois secondes, en appuyant sur le bouton d’impulsion de l’équipement. Aspirer l’émulsion peptidique glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline avec une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 22 et transférer l’émulsion dans un nouveau baril de seringue de 1 millilitre.Fixez une aiguille de calibre 26 au canon et fixez la connexion avec un film d’étanchéité. Injecter 100 microlitres de l’émulsion peptidique glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline par voie sous-cutanée de chaque côté de la colonne dorsale d’une souris. Après l’injection, observez la formation automatique de masses bulbeuses sous la peau et le dos.Ensuite, par voie intrapéritonéale, injectez 100 microlitres de toxine coqueluche dans la même souris. Préparer une chambre de réaction en plein champ et mettre en place un système d’analyse vidéo pour enregistrer la locomotion de la souris. Pour nettoyer la chambre de réaction avant l’expérience, vaporisez de l’éthanol à 70% sur toute la zone et essuyez avec une serviette en papier propre.Ensuite, placez une souris dans le coin d’une chambre de réaction. Pour commencer la prise de vue, cliquez sur le bouton de démarrage de la capture dans la barre de menu du système d’enregistrement vidéo et enregistrez l’heure. En gardant le silence dans la salle de test, laissez la souris bouger librement pendant cinq minutes.Ensuite, arrêtez l’enregistrement et enregistrez la vidéo. Remettez la souris dans sa cage. Nettoyez ensuite la zone de test avec de l’éthanol à 70% et passez à la souris suivante.Gardez la souris euthanasiée à plat sur un plateau de dissection et fixez les extrémités. Tenez la peau des membres postérieurs chez la souris avec une pince et ouvrez la peau et les muscles avec des ciseaux. Ensuite, séparez le fémur du tibia et de l’os de la hanche en utilisant soigneusement les ciseaux.Enlevez les muscles adhérant au fémur avec des ciseaux. Placez ensuite le fémur dans de l’éthanol à 70% à température ambiante. Dans cette étude, la capacité du peptide dérivé de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline à induire l’EAE a été évaluée.Les souris injectées avec le peptide ont connu une perte de poids progressive. Après six à neuf jours d’injection, ils ont développé des symptômes d’EAE qui ont culminé après 14 à 16 jours. Les tracés de piste du test en plein champ ont démontré que l’EAE modifie le comportement exploratoire normal des souris.Par rapport aux souris normales, les souris atteintes d’EAE ont parcouru beaucoup moins de distance dans les phases précoces, de pic et de rémission. Les souris atteintes d’EAE avaient également une durée d’activité significativement réduite dans les phases de pic et de rémission de la maladie. De plus, dans les trois phases, les souris EAE avaient beaucoup moins de distance de déplacement et de temps passé dans le centre.La tomodensitométrie des fémurs de souris EAE a révélé une architecture trabéculaire différente de celle des souris normales. Les fémurs des souris EAE avaient une densité minérale osseuse et un rapport volume osseux / volume tissulaire significativement inférieurs à ceux des souris normales. De plus, les fémurs de souris atteintes d’EAE avaient une densité de connexion trabéculaire, un nombre trabéculaire et une épaisseur trabéculaire inférieurs à ceux de souris normales.Par rapport aux souris normales, l’espacement trabéculaire a été amélioré et l’épaisseur de l’os cortical a été réduite chez les souris EAE. Nous pouvons également isoler le code du cerveau et de la colonne vertébrale des souris EAE au plus fort de la maladie et analyser la production de cellules immunitaires et de cytokines par cytométrie grippale.

Research

JoVE Journal

Biology

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