Name: induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-09-09T12:30:00
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Die Autoren würdigen die Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) und das State Key Laboratory of Drug Research.

Das Tierpflegekomitee der Tongji-Universität genehmigte die vorliegende Arbeit und alle Richtlinien für die Tierpflege wurden befolgt. Für die Experimente wurden männliche oder weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen verwendet. Es wurde sichergestellt, dass Alter und Geschlecht in den Versuchsgruppen gleich waren; Andernfalls war die Anfälligkeit für die Krankheit beeinträchtigt. Die Mäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung mit abwechselnden 12 h Hell- und Dunkelzyklen unter ...

MS ist eine demyelinisierende entzündliche Erkrankung des ZNS und eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die bei jungen Menschen chronische Behinderungen verursachen und Familien und Gesellschaft enorm belasten 3,4. MS wurde schon immer als organspezifische T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung klassifiziert, die das Autoimmunsystem dazu veranlasst, das ZNS langsam zu erodieren, was mehrere Systeme im ganzen Körper betrifft27...

Autoimmunerkrankungen sind ein Spektrum von Erkrankungen, die durch die Immunantwort des Immunsystems auf seine eigenen Antigene verursacht werden, was zu Gewebeschäden oder Funktionsstörungen führt1. Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Autoimmunerkrankung der Polyneuropathie im zentralen Nervensystem (ZNS), gekennzeichnet durch entzündliche Infiltration, Demyelinisierung und neuronale axonale Degeneration 2,3. Derzeit sind weltweit bis zu 2,5 Millionen Menschen von MS betroffen, vor allem junge und Menschen mittleren Alters im Alter von 20 bis 40 Jahren, die oft das Rückgrat ihrer Familien und der Gesellschaft bilden. Dies hat erhebliche Auswirkungen und Schäden für Familien und die Gesellschaft verursacht 2,4.
MS ist eine multifaktorielle Erkrankung mit vielfältigen und komplexen klinischen Manifestationen. Neben klassischen neurologischen Erkrankungen, die durch entzündliche Infiltration und Demyelinisierung gekennzeichnet sind, zeigt MS häufig Sehstörungen, Gliedmaßendyskinesie sowie kognitive und emotionale Störungen 5,6,7. Wenn MS-Patienten nicht die richtige und korrekte Behandlung erhalten, wird die Hälfte von ihnen nach 20 Jahren im Rollstuhl leben, und fast die Hälfte von ihnen wird depressive und Angstsymptome haben, was zu einem viel höheren Maß an Suizidgedanken führt als die Allgemeinbevölkerung 8,9.
Trotz einer langen Forschungszeit bleibt die Ätiologie der MS schwer fassbar, und die Pathogenese der MS ist noch nicht aufgeklärt. Tiermodelle von MS haben es ermöglicht, als Testwerkzeuge zu dienen, um die Krankheitsentwicklung und neue therapeutische Ansätze zu erforschen, trotz der signifikanten Unterschiede zwischen dem Nagetier- und dem menschlichen Immunsystem, während gleichzeitig einige Grundprinzipien geteilt werden. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist derzeit das ideale Tiermodell für die Untersuchung von MS, das Autoantigen-Immunität von Myelinproteinen verwendet, um Autoimmunität gegen ZNS-Komponenten in anfälligen Mäusen zu induzieren, mit dem Zusatz von vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) und Keuchhustentoxin (PTX), um die humorale Immunantwort zu verstärken. Abhängig vom genetischen Hintergrund und den Immunantigenen werden verschiedene Krankheitsprozesse, einschließlich akuter, schubförmig-remittierender oder chronischer, erhalten, um verschiedene klinische Formen von MS10,11,12 nachzuahmen. Die relevanten Immunogene, die üblicherweise bei der Konstruktion von EAE-Modellen verwendet werden, stammen aus Selbst-ZNS-Proteinen wie Myelin-Basisprotein (MBP), Proteolipidprotein (PLP) oder Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). MBP- oder PLP-immunisierte SJL/L-Mäuse entwickeln einen schubförmig-remittierenden Verlauf, und MOG löst chronisch progrediente EAE bei C57BL/6-Mäusenaus 11,12,13.
Der Hauptzweck der krankheitsmodifizierenden Therapie (DMT) besteht darin, Krankheitssymptome zu minimieren und die Funktion zu verbessern6. Mehrere Medikamente werden klinisch zur Linderung von MS eingesetzt, aber noch wurde kein Medikament verwendet, um es vollständig zu heilen, was die Notwendigkeit einer synergistischen Behandlung aufzeigt. C57BL / 6-Mäuse werden derzeit am häufigsten verwendet, um transgene Mäuse zu konstruieren, und in dieser Arbeit wurde ein EAE-Modell, das durch MOG35-55 in C57BL / 6J-Mäusen mit einer 5-Punkte-Skala induziert wurde, verwendet, um das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. EAE-Modelle leiden auch unter angstähnlichen Stimmungen und Knochenschwund sowie den weithin bekannten demyelinisierenden Läsionen. Hier wird auch die Methode beschrieben, die Symptome der EAE aus mehreren Perspektiven mittels Freifeldtest und Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) zu beurteilen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe(with 26 G needle)</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>HAIKELASI</td>
			<td>KY-LXG2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locomotion activity (open field) video analysis system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td>DigBehv-002</td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55 peptide</td>
			<td>Gill Biochemical Co., Ltd</td>
			<td>GLS-Y-M-03590</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td>
			<td>BD</td>
			<td>231141</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open field reaction chamber</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>516560</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>J21010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing film</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS 234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;CT 35 desktop microCT scanner</td>
			<td>Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis

Multiple Sklerose (MS) ist eine typische Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die durch entzündliche Infiltration, Demyelinisierung und axonale Schäden gekennzeichnet ist. Derzeit gibt es keine Maßnahmen, um MS vollständig zu heilen, aber mehrere krankheitsmodifizierende Therapien (DMT) sind verfügbar, um das Fortschreiten der Krankheit zu kontrollieren und zu mildern. Es gibt signifikante Ähnlichkeiten zwischen den pathologischen Merkmalen des ZNS der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und MS-Patienten. EAE wurde häufig als repräsentatives Modell verwendet, um die Wirksamkeit von MS-Medikamenten zu bestimmen und die Entwicklung neuer Therapien für MS-Erkrankungen zu untersuchen. Die aktive Induktion von EAE bei Mäusen hat eine stabile und reproduzierbare Wirkung und eignet sich besonders für die Untersuchung der Auswirkungen von Medikamenten oder Genen auf autoimmune Neuroinflammation. Die Methode der Immunisierung von C57BL/6J-Mäusen mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) und die tägliche Beurteilung der Krankheitssymptome mittels eines klinischen Scoring-Systems wird hauptsächlich geteilt. Angesichts der komplexen Ätiologie der MS mit verschiedenen klinischen Manifestationen kann das bestehende klinische Bewertungssystem die Bewertung der Krankheitsbehandlung nicht erfüllen. Um die Mängel einer einzelnen Intervention zu vermeiden, werden neue Indikatoren zur Beurteilung der EAE basierend auf klinischen Manifestationen von angstähnlichen Stimmungen und Osteoporose bei MS-Patienten erstellt, um eine umfassendere Bewertung der MS-Behandlung zu ermöglichen.

Nach der Immunisierung der Mäuse wird das Körpergewicht der Mäuse täglich aufgezeichnet und ihre klinischen Symptome werden gemäß dem oben beschriebenen Protokoll (Schritt 4) bewertet. Bei C57BL / 6J-Mäusen, die mit MOG-Peptid immunisiert wurden, breitet sich die Pathogenese der EAE-Mäuse vom Schwanzende bis zum Kopf aus, da die Läsion hauptsächlich auf das Rückenmark beschränkt ist. Zu Beginn der Krankheit zeigen EAE-Mäuse Schwäche und Herabhängen des Schwanzes, gefolgt von Schwäche der Hintergliedmaßen...

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Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...

Derzeit gibt es keine vollständige Heilung für Multiple Sklerose. Unser Protokoll ermöglicht die effektive Konstruktion eines experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Modells, um die Erforschung von Therapien für Multiple Sklerose zu unterstützen. Der Hauptvorteil unseres Protokolls ist eine umfassendere Bewertung der Behandlung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis aus mehreren Perspektiven.Bereiten Sie zunächst eine Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion her, indem lyophilisiertes Peptid und steriles vorgekühltes PBS ohne Calcium- und Magnesiumionen bei pH 7,4 gelöst werden. Fügen Sie eine sterilisierte Fünf-Millimeter-Stahlkugel in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern hinzu. Dann fügen Sie 500 Mikroliter des kompletten Freuds-Adjuvans mit fünf Milligramm pro Milliliter lyophilisiertem Mikrobakterium tuberculosis und 500 Mikroliter der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion in die Röhre hinzu.Schwingen Sie nun die Röhre auf einem Gewebelyseur für 10 Minuten. Anschließend kühlen Sie die Röhrchen 10 Minuten auf Eis. Wiederholen Sie den Vorgang viermal, bis sich eine weißviskose Lösung bildet.Als nächstes verdünnen Sie die Pertussis-Toxin-Stiellösung 50-mal in sterilem PBS von pH 7,4 ohne Calcium- und Magnesiumionen, um eine Endkonzentration von 200 Nanogramm pro 100 Mikroliter zu erreichen. Um die gesamte anfänglich hergestellte Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptidemulsion am Boden des Röhrchens auszufällen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für zwei bis drei Sekunden, indem Sie die Impulstaste am Gerät drücken. Die Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion wird mit einer Ein-Milliliter-Spritze abgesaugt, die mit einer 22-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und die Emulsion in einen neuen 1-Milliliter-Spritzenzylinder überführt.Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel am Lauf und sichern Sie die Verbindung mit einer Dichtungsfolie. Injizieren Sie 100 Mikroliter der Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptidemulsion subkutan auf jede Seite der Rückenwirbelsäule einer Maus. Beobachten Sie nach der Injektion die automatische Bildung von bauchigen Massen unter der Haut und dem Rücken.Dann intraperitoneal injizieren Sie 100 Mikroliter Pertussis-Toxin in dieselbe Maus. Bereiten Sie eine Reaktionskammer im offenen Feld vor und richten Sie ein Videoanalysesystem zur Aufzeichnung der Fortbewegung von Mäusen ein. Um die Reaktionskammer vor dem Experiment zu reinigen, sprühen Sie 70% Ethanol auf die gesamte Fläche und wischen Sie mit einem sauberen Papiertuch ab.Als nächstes platzieren Sie eine Maus in der Ecke einer Reaktionskammer. Um mit der Aufnahme zu beginnen, klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnahme starten in der Menüleiste des Videoaufzeichnungssystems und notieren Sie die Zeit. Halten Sie Stille im Testraum und lassen Sie die Maus fünf Minuten lang frei bewegen.Stoppen Sie dann die Aufnahme und speichern Sie das Video. Setzen Sie die Maus wieder in ihren Käfig. Reinigen Sie dann den Testbereich mit 70% Ethanol und fahren Sie mit der nächsten Maus fort.Halten Sie die eingeschläferte Maus flach auf einem Seziertablett und fixieren Sie die Extremitäten. Halten Sie die Hintergliedmaßenhaut mit einer Pinzette in der Maus und öffnen Sie die Haut und Muskeln mit einer Schere. Als nächstes trennen Sie den Femur von der Tibia und dem Hüftknochen, indem Sie vorsichtig die Schere benutzen.Entfernen Sie die Muskeln, die am Oberschenkelknochen haften, mit einer Schere. Dann legen Sie den Femur in 70% Ethanol bei Raumtemperatur. In dieser Studie wurde die Fähigkeit von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-abgeleiteten Peptiden, EAE zu induzieren, bewertet.Mäuse, denen das Peptid injiziert wurde, erlebten einen fortschreitenden Gewichtsverlust. Nach sechs bis neun Tagen Injektion entwickelten sie EAE-Symptome, die nach 14 bis 16 Tagen ihren Höhepunkt erreichten. Trackplots aus dem Freilandtest zeigten, dass EAE das normale explorative Verhalten von Mäusen verändert.Im Vergleich zu normalen Mäusen legten die Mäuse mit EAE in den frühen Beginn-, Spitzen- und Remissionsphasen signifikant weniger Strecken zurück. Mäuse mit EAE hatten auch eine signifikant reduzierte Aktivitätsdauer in den Spitzen- und Remissionsphasen der Krankheit. Darüber hinaus hatten die EAE-Mäuse in allen drei Phasen signifikant weniger Reisedistanz und Zeit, die sie im Zentrum verbrachten.Mikrocomputertomographie-Scans von Oberschenkelknochen von EAE-Mäusen zeigten eine trabekuläre Architektur, die sich von normalen Mäusen unterscheidet. Femuren von EAE-Mäusen hatten signifikant weniger Knochenmineraldichte und Knochenvolumen zu Gewebevolumen als die von normalen Mäusen. Darüber hinaus hatten Femuren von Mäusen mit EAE eine geringere trabekuläre Verbindungsdichte, Trabekelzahl und Trabekulardicke als die von normalen Mäusen.Im Vergleich zu normalen Mäusen wurde der trabekuläre Abstand bei EAE-Mäusen vergrößert und die kortikale Knochendicke reduziert. Wir können auch den Gehirn- und Wirbelsäulencode von EAE-Mäusen auf dem Höhepunkt der Krankheit isolieren und die Produktion von Immunzellen und Zytokinen durch Grippezytometrie analysieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS) that commonly affects young adults. It is characterized by ...

Forschung

Biologie

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Loading Drosophila Nerve Terminals mit Calcium-Indikatoren

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

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Experimentelle Ansätze zur Tissue Engineering

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

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Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

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A Novel Bayesian Change-Punkt Algorithmus für genomweite Analyse Diverse ChIPseq Datentypen

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Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...