Name: induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-09-09T12:30:00
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Gli autori riconoscono il sostegno della National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) e dello State Key Laboratory of Drug Research.

Il Comitato per la cura degli animali dell'Università di Tongji ha approvato il presente lavoro e sono state seguite tutte le linee guida per la cura degli animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi o femmine C57BL / 6J tra 8-12 settimane di età. È stato assicurato che l'età e il sesso fossero gli stessi nei gruppi sperimentali; Altrimenti, la suscettibilità alla malattia è stata influenzata. I topi sono stati alloggiati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni con cicli alternati di lu...

La SM è una malattia infiammatoria demielinizzante del SNC ed è uno dei disturbi neurologici più comuni che causano disabilità cronica nei giovani, imponendo un enorme onere alle famiglie e alla società 3,4. La SM è sempre stata classificata come una malattia autoimmune mediata dalle cellule T organo-specifiche, inducendo il sistema autoimmune a erodere lentamente il SNC, che coinvolgerà più sistemi in tutto il corpo27. I sintomi c...

Le malattie autoimmuni sono uno spettro di disturbi causati dalla risposta immunitaria del sistema immunitario ai propri antigeni con conseguente danno o disfunzione tissutale1. La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica della polineuropatia nel sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e degenerazione assonale neuronale 2,3. Attualmente, la SM ha colpito ben 2,5 milioni di persone in tutto il mondo, per lo più giovani e persone di mezza età di età compresa tra 20 e 40 anni, che sono spesso la spina dorsale delle loro famiglie e della società. Ciò ha causato notevoli ripercussioni e danni alle famiglie e alla società 2,4.
La SM è una malattia multifattoriale con manifestazioni cliniche diverse e complesse. Oltre ai classici disturbi neurologici caratterizzati da infiltrazione infiammatoria e demielinizzazione, la SM mostra spesso deficit visivo, discinesia degli arti e disturbi cognitivi ed emotivi 5,6,7. Se i pazienti con SM non ricevono il trattamento adeguato e corretto, metà di loro vivrà in sedia a rotelle dopo 20 anni e quasi la metà di loro sperimenterà sintomi depressivi e ansiosi, portando a livelli molto più elevati di ideazione suicidaria rispetto alla popolazione generale 8,9.
Nonostante un lungo periodo di ricerca, l'eziologia della SM rimane elusiva e la patogenesi della SM non è stata ancora chiarita. I modelli animali di SM hanno permesso di servire come strumenti di test per esplorare lo sviluppo della malattia e nuovi approcci terapeutici, nonostante le differenze significative tra il sistema immunitario dei roditori e quello umano, condividendo allo stesso tempo alcuni principi di base. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è attualmente il modello animale ideale per lo studio della SM, che utilizza l'immunità autoantigenica dalle proteine della mielina per indurre l'autoimmunità ai componenti del SNC nei topi sensibili, con l'aggiunta di adiuvante completo di Freund (CFA) e tossina della pertosse (PTX) per migliorare la risposta immunitaria umorale. A seconda del background genetico e degli antigeni immunitari, si ottengono diversi processi patologici, tra cui acuto, recidivante-remittente o cronico, per imitare varie forme cliniche di SM10,11,12. Gli immunogeni rilevanti comunemente usati nella costruzione di modelli EAE provengono da proteine del SNC, come la proteina basica della mielina (MBP), la proteina proteolipidica (PLP) o la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG). I topi SJL/L immunizzati con MBP o PLP sviluppano un decorso recidivante-remittente e la MOG innesca EAE cronica progressiva nei topi C57BL/611,12,13.
Lo scopo principale della terapia modificante la malattia (DMT) è ridurre al minimo i sintomi della malattia e migliorare la funzione6. Diversi farmaci sono usati clinicamente per alleviare la SM, ma nessun farmaco è stato ancora usato per curarla completamente, rivelando la necessità di un trattamento sinergico. I topi C57BL / 6 sono attualmente i più comunemente usati per costruire topi transgenici e, in questo lavoro, è stato utilizzato un modello EAE indotto da MOG35-55 in topi C57BL / 6J con una scala a 5 punti per monitorare la progressione della malattia. I modelli EAE soffrono anche di stati d'animo ansiosi e perdita ossea e lesioni demielinizzanti ampiamente note. Qui viene descritto anche il metodo per valutare i sintomi dell'EAE da più prospettive utilizzando test in campo aperto e analisi di tomografia micro-computerizzata (Micro-CT).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe(with 26 G needle)</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>HAIKELASI</td>
			<td>KY-LXG2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locomotion activity (open field) video analysis system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td>DigBehv-002</td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55 peptide</td>
			<td>Gill Biochemical Co., Ltd</td>
			<td>GLS-Y-M-03590</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td>
			<td>BD</td>
			<td>231141</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open field reaction chamber</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>516560</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>J21010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing film</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS 234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;CT 35 desktop microCT scanner</td>
			<td>Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis

La sclerosi multipla (SM) è una tipica malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e danno assonale. Attualmente, non ci sono misure per curare completamente la SM, ma sono disponibili più terapie modificanti la malattia (DMT) per controllare e mitigare la progressione della malattia. Esistono somiglianze significative tra le caratteristiche patologiche del SNC dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) e dei pazienti con SM. L'EAE è stato ampiamente utilizzato come modello rappresentativo per determinare l'efficacia dei farmaci per la SM ed esplorare lo sviluppo di nuove terapie per la malattia della SM. L'induzione attiva di EAE nei topi ha un effetto stabile e riproducibile ed è particolarmente indicata per studiare gli effetti di farmaci o geni sulla neuroinfiammazione autoimmune. Il metodo di immunizzazione dei topi C57BL/6J con glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG35-55) e la valutazione giornaliera dei sintomi della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico è principalmente condiviso. Data la complessa eziologia della SM con diverse manifestazioni cliniche, il sistema di punteggio clinico esistente non può soddisfare la valutazione del trattamento della malattia. Per evitare le carenze di un singolo intervento, vengono creati nuovi indicatori per valutare l'EAE sulla base delle manifestazioni cliniche di stati d'animo ansiosi e osteoporosi nei pazienti con SM per fornire una valutazione più completa del trattamento della SM.

Dopo l'immunizzazione dei topi, il peso corporeo dei topi viene registrato quotidianamente e i loro sintomi clinici vengono valutati secondo il protocollo sopra descritto (fase 4). Nei topi C57BL/6J immunizzati con peptide MOG, poiché la posizione della lesione è principalmente limitata al midollo spinale, la patogenesi dei topi EAE si diffonde dalla coda alla testa. All'inizio della malattia, i topi EAE mostrano debolezza e abbassamento della coda, seguiti da debolezza degli arti posteriori, movimento scoordinato e pa...

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Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...

Attualmente non esiste una cura completa per la sclerosi multipla. Il nostro protocollo consente la costruzione efficace di un modello sperimentale di encefalomielite autoimmune per aiutare a esplorare le terapie per la malattia della sclerosi multipla. Il vantaggio principale del nostro protocollo è una valutazione più completa del trattamento dell'encefalomielite autoimmune sperimentale da molteplici prospettive.Per prima cosa preparare l'emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria della mielina sciogliendo il peptide liofilizzato e il PBS pre-raffreddato sterile senza ioni calcio e magnesio a pH 7,4. Aggiungere una sfera d'acciaio sterilizzata da cinque millimetri a un micro tubo di centrifuga pulito da due millilitri. Quindi aggiungere 500 microlitri di adiuvante completo di Freuds contenente cinque milligrammi per millilitro di microbatterio tuberculosis liofilizzato e 500 microlitri di emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielina al tubo.Ora fai oscillare il tubo su un lyser tissutale per 10 minuti. Quindi raffreddare i tubi sul ghiaccio per 10 minuti. Ripetere il processo quattro volte fino a formare una soluzione viscosa bianca.Quindi, diluire la soluzione di gambo della tossina della pertosse 50 volte in PBS sterile di pH 7,4 senza ioni di calcio e magnesio per ottenere una concentrazione finale di 200 nanogrammi per 100 microlitri. Per precipitare tutta l'emulsione peptidica di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica inizialmente preparata sul fondo del tubo, centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius per due o tre secondi, premendo il pulsante dell'impulso sull'apparecchiatura. Aspirare l'emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielinica con una siringa da un millilitro dotata di un ago da 22 gauge e trasferire l'emulsione in un nuovo cilindro di siringa da 1 millilitro.Attaccare un ago calibro 26 alla canna e fissare la connessione con una pellicola sigillante. Iniettare 100 microlitri di emulsione peptidica glicoproteina oligodendrocitaria mielinica per via sottocutanea su ciascun lato della spina dorsale di un topo. Dopo l'iniezione, osservare la formazione automatica di masse bulbose sotto la pelle e il dorso.Quindi per via intraperitoneale, iniettare 100 microlitri di tossina della pertosse nello stesso topo. Preparare una camera di reazione in campo aperto e impostare un sistema di analisi video per la registrazione della locomozione del topo. Per pulire la camera di reazione prima dell'esperimento, spruzzare il 70% di etanolo su tutta l'area e pulire con un tovagliolo di carta pulito.Quindi posiziona un mouse nell'angolo di una camera di reazione. Per iniziare le riprese, fare clic sul pulsante di avvio acquisizione nella barra dei menu del sistema di registrazione video e registrare l'ora. Mantenendo il silenzio nella stanza di prova, lascia che il mouse si muova liberamente per cinque minuti.Quindi interrompere la registrazione e salvare il video. Rimetti il mouse nella sua gabbia. Quindi pulire l'area di prova con etanolo al 70% e procedere al mouse successivo.Tenere il topo eutanasia piatto su un vassoio da dissezione e fissare le estremità. Tenere la pelle degli arti posteriori nel mouse con una pinza e aprire la pelle e i muscoli con le forbici. Quindi, separare il femore dalla tibia e dall'osso dell'anca usando attentamente le forbici.Rimuovere i muscoli aderenti al femore con le forbici. Quindi posizionare il femore in etanolo al 70% a temperatura ambiente. In questo studio, è stata valutata la capacità del peptide derivato dalla glicoproteina oligodendrocitaria della mielina di indurre EAE.I topi iniettati con il peptide hanno sperimentato una progressiva perdita di peso. Dopo sei-nove giorni di iniezione, hanno sviluppato sintomi EAE che hanno raggiunto il picco dopo 14-16 giorni. I grafici delle tracce del test in campo aperto hanno dimostrato che EAE altera il normale comportamento esplorativo dei topi.Rispetto ai topi normali, i topi con EAE hanno percorso una distanza significativamente inferiore nelle fasi di esordio precoce, picco e remissione. I topi con EAE avevano anche una durata dell'attività significativamente ridotta nelle fasi di picco e remissione della malattia. Inoltre, in tutte e tre le fasi i topi EAE avevano significativamente meno distanza di viaggio e tempo trascorso al centro.Le scansioni di tomografia microcomputerizzata di femori di topi EAE hanno rivelato un'architettura trabecolare diversa dai topi normali. I femori dei topi EAE avevano significativamente meno densità minerale ossea e volume osseo al volume del volume tissutale rispetto a quelli dei topi normali. Inoltre, i femori di topi con EAE avevano meno densità di connessione trabecolare, numero trabecolare e spessore trabecolare rispetto a quelli dei topi normali.Rispetto ai topi normali, la spaziatura trabecolare è stata migliorata e lo spessore osseo corticale è stato ridotto nei topi EAE. Possiamo anche isolare il cervello e il codice spinale dei topi EAE al culmine della malattia e analizzare la produzione di cellule immunitarie e citochine mediante citometria influenzale.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Induzione e punteggio clinico dell&#39;epatite cronica-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS) that commonly affects young adults. It is characterized by ...

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