Name: induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-09-09T12:30:00
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著者らは、中国国家自然科学財団(32070768、31871404、31900658、32270754)および国家重点薬物研究所からの支援を認めている。

同済大学の動物管理委員会は現在の作業を承認し、すべての動物飼育ガイドラインに従いました。8〜12週齢の雄または雌のC57BL / 6Jマウスを実験に使用しました。実験群では年齢と性別が同じであることが確認された。そうでなければ、病気に対する感受性が影響を受けました。マウスを、一定の条件(室温23±1°C、湿度50%±10%)で12時間の明暗サイクルを交互に行い、マウスの餌と水を自由に利?...

MSはCNSの脱髄炎症性疾患であり、若者に慢性障害を引き起こす最も一般的な神経障害の1つであり、家族や社会に大きな負担をかけています3,4。MSは常に臓器特異的T細胞媒介性自己免疫疾患として分類されており、自己免疫系がCNSをゆっくりと侵食するように誘導し、これは全身の複数の系を含むであろう27。典型的な臨床症状には...

自己免疫疾患は、それ自体の抗原に対する免疫系の免疫応答によって引き起こされる一連の障害であり、組織の損傷または機能障害を引き起こします1。多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)における多発ニューロパチーの慢性自己免疫疾患であり、炎症性浸潤、脱髄、およびニューロン軸索変性を特徴とする2,3。現在、MSは世界中で250万人もの人々に影響を与えており、主に20〜40歳の若者と中年の人々であり、家族や社会のバックボーンであることがよくあります。これは、家族や社会に多大な影響と害をもたらしました2,4。
MSは、多様で複雑な臨床症状を伴う多因子性疾患です。炎症性浸潤および脱髄を特徴とする古典的な神経障害に加えて、MSはしばしば視覚障害、四肢ジスキネジア、および認知および感情障害を示します5,6,7。MS患者が適切で正しい治療を受けない場合、その半数は20年後に車椅子で生活し、半数近くが抑うつ症状や不安症状を経験し、一般集団よりもはるかに高いレベルの自殺念慮につながります8,9。
長い研究期間にもかかわらず、MSの病因はとらえどころのないままであり、MSの病因はまだ解明されていません。MSの動物モデルは、げっ歯類とヒトの免疫系の間に大きな違いがあるにもかかわらず、同時にいくつかの基本原則を共有しながら、疾患の発症と新しい治療アプローチを探求するためのテストツールとして機能することを可能にしました。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は現在、MSを研究するための理想的な動物モデルであり、ミエリンタンパク質からの自己抗原免疫を使用して感受性マウスのCNS成分に対する自己免疫を誘導し、完全なフロイントアジュバント(CFA)と百日咳毒素(PTX)を加えて体液性免疫応答を強化します。遺伝的背景および免疫抗原に応じて、MS10、11、12の様々な臨床形態を模倣するために、急性、再発寛解、または慢性を含む異なる疾患プロセスが得られる。EAEモデルの構築に一般的に使用される関連する免疫原は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、またはミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)などの自己CNSタンパク質に由来します。MBPまたはPLP免疫SJL/Lマウスは再発寛解型経過を発症し、MOGはC57BL/6マウスにおいて慢性進行性EAEを引き起こす11,12,13。
疾患修飾療法(DMT)の主な目的は、疾患の症状を最小限に抑え、機能を改善することです6。MSを緩和するために臨床的に使用されている薬剤はいくつかありますが、MSを完全に治癒するための薬剤はまだ使用されておらず、相乗的治療の必要性が明らかになりました。現在、トランスジェニックマウスの構築にはC57BL/6マウスが最も一般的に使用されており、この研究では、C57BL/6JマウスのMOG35-55 によって誘導されたEAEモデルを5点スケールで使用して、疾患の進行を監視しました。EAEモデルはまた、不安のような気分や骨量減少、および広く知られている脱髄病変に苦しんでいます。ここでは、オープンフィールドテストとマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)分析を用いてEAEの症状を多角的に評価する方法についても説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe(with 26 G needle)</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>HAIKELASI</td>
			<td>KY-LXG2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locomotion activity (open field) video analysis system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td>DigBehv-002</td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55 peptide</td>
			<td>Gill Biochemical Co., Ltd</td>
			<td>GLS-Y-M-03590</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td>
			<td>BD</td>
			<td>231141</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open field reaction chamber</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>516560</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>J21010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing film</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS 234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;CT 35 desktop microCT scanner</td>
			<td>Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis

多発性硬化症(MS)は、炎症性浸潤、脱髄、および軸索損傷を特徴とする中枢神経系(CNS)の典型的な自己免疫疾患です。現在、MSを完全に治癒するための対策はありませんが、疾患の進行を制御および緩和するために、複数の疾患修飾療法(DMT)が利用可能です。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)とMS患者のCNS病理学的特徴の間には有意な類似点がある。EAEは、MS薬の有効性を判断し、MS疾患の新しい治療法の開発を探索するための代表的なモデルとして広く使用されています。マウスにおけるEAEの能動的誘導は、安定かつ再現性のある効果を有し、自己免疫性神経炎症に対する薬物または遺伝子の効果を研究するのに特に適している。C57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)を免疫する方法と、臨床スコアリングシステムを用いた疾患症状の日々の評価が主に共有されています。多様な臨床症状を伴うMSの複雑な病因を考えると、既存の臨床スコアリングシステムは疾患治療の評価を満たすことができません。単一の介入の欠点を回避するために、MS患者の不安様気分および骨粗鬆症の臨床症状に基づいてEAEを評価するための新しい指標が作成され、MS治療のより包括的な評価が提供されます。

マウスの免疫後、マウスの体重が毎日記録され、それらの臨床症状が上記のプロトコルに従って評価される(ステップ4)。MOGペプチドを免疫したC57BL/6Jマウスでは、病変部位が主に脊髄に限定されるため、EAEマウスの病因は尾端から頭部に広がります。疾患の開始時に、EAEマウスは尾の脱力感および垂れ下がりを示し、続いて後肢の脱力感、協調性のない動き、および麻痺を示す。病気が悪化?...

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Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...

現在、多発性硬化症の完全な治療法はありません。私たちのプロトコルは、多発性硬化症の治療法を探求するのに役立つ実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルの効果的な構築を可能にします。私たちのプロトコルの主な利点は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の治療をより包括的に評価することです 複数の視点から。まずpH7.4でカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含まない凍結乾燥ペプチドおよび滅菌予冷PBSを溶解することによりミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドエマルジョンを調製する。清潔な2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに滅菌された5ミリメートルの鋼球を1つ追加します。次に、凍結乾燥結核菌1ミリリットルあたり5ミリグラムおよび500マイクロリットルのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドエマルジョンを含む500マイクロリットルの完全なフロイトアジュバントをチューブに加えます。次に、ティッシュライザーでチューブを10分間振動させます。次に、チューブを氷上で10分間冷却します。白色粘性溶液が形成されるまでこのプロセスを4回繰り返します。次に、百日咳毒素の茎溶液をカルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まないpH 7.4の滅菌PBSで50倍に希釈して、100マイクロリットルあたり200ナノグラムの最終濃度を達成します。最初に調製したミエリン希突起膠細胞糖タンパク質ペプチドエマルジョンをすべてチューブの底部に沈殿させるには、装置のパルスボタンを押して、チューブを摂氏4度で2〜3秒間遠心分離します。ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチドエマルジョンを22ゲージの針を備えた1ミリリットルのシリンジで吸引し、エマルジョンを新しい1ミリリットルのシリンジバレルに移します。26ゲージの針をバレルに取り付け、シーリングフィルムで接続を固定します。100マイクロリットルのミエリン希突起膠細胞糖タンパク質ペプチドエマルジョンをマウスの背背脊椎の両側に皮下注射する。注射後、皮膚と背部の下に球根状の腫瘤が自動的に形成されるのを観察します。次に腹腔内に、100マイクロリットルの百日咳毒素を同じマウスに注射します。オープンフィールド反応チャンバーを準備し、マウスの移動を記録するためのビデオ分析システムをセットアップします。実験前に反応室を洗浄するには、70%エタノールを全体にスプレーし、清潔なペーパータオルで拭きます。次に、反応室の隅にマウスを置きます。撮影を開始するには、ビデオ録画システムのメニューバーにある[キャプチャの開始]ボタンをクリックして、時間を記録します。テストルームで沈黙を保ちながら、マウスを5分間自由に動かします。次に、録画を停止してビデオを保存します。マウスをケージに戻します。次に、70%エタノールでテスト領域を洗浄し、次のマウスに進みます。安楽死させたマウスを解剖トレイに平らに保ち、四肢を固定します。マウスの後肢の皮膚を鉗子で保持し、ハサミで皮膚と筋肉を開きます。次に、ハサミを慎重に使用して、大腿骨を脛骨と腰の骨から分離します。大腿骨に付着している筋肉をハサミで取り除きます。次に、大腿骨を室温の70%エタノールに入れます。この研究では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質由来ペプチドがEAEを誘導する能力を評価しました。ペプチドを注射したマウスは、進行性の体重減少を経験した。注射の6〜9日後、彼らは14〜16日後にピークに達するEAE症状を発症しました。オープンフィールドテストのトラックプロットは、EAEがマウスの通常の探索行動を変えることを示しました。正常なマウスと比較して、EAEを有するマウスは、初期発症、ピーク、および寛解期に有意に短い距離を移動した。EAEを有するマウスはまた、疾患のピーク期および寛解期における活動持続時間が大幅に減少した。さらに、3つのフェーズすべてにおいて、EAEマウスの移動距離と中心で過ごす時間が有意に少なかった。EAEマウスの大腿骨のマイクロコンピューター断層撮影スキャンは、通常のマウスとは異なる小柱構造を明らかにしました。EAEマウスの大腿骨は、正常マウスのものよりも骨塩密度と骨体積対組織体積比が有意に少なかった。さらに、EAEマウスの大腿骨は、正常マウスよりも線維柱帯接続密度、骨梁数、および骨梁の厚さが少なかった。正常マウスと比較して、EAEマウスでは線維柱帯が拡大し、皮質骨の厚さが減少しました。また、疾患ピーク時のEAEマウスの脳および脊髄コードを分離し、インフルエンザサイトメトリーによって免疫細胞およびサイトカインの産生を解析することもできます。

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

誘導および慢性-再発実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアリング

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS) that commonly affects young adults. It is characterized by ...

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

カルシウムインジケータ付きのロードショウジョウバエの神経終末

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Experimental Approaches to Tissue Engineering

組織工学への実験的アプローチ

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

ラットにおける養子遅延型過敏症の誘導とモニタリング

Delayed type hypersensitivity (DTH) is an inflammatory reaction mediated by CCR7- effector memory T lymphocytes that infiltrate the site of injection of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

放射性その場で</em組織における多様な遺伝子発現パターンを検出するための>ハイブリダイゼーション

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...