Name: induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-09-09T12:30:00
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Os autores reconhecem o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) e do State Key Laboratory of Drug Research.

O Comitê de Cuidados com os Animais da Universidade de Tongji aprovou o presente trabalho, e todas as diretrizes de cuidados com os animais foram seguidas. Camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas entre 8-12 semanas de idade foram utilizados para os experimentos. Garantiu-se que a idade e o sexo fossem os mesmos nos grupos experimentais; caso contrário, a suscetibilidade à doença foi afetada. Os camundongos foram alojados em um ambiente específico livre de patógenos com ciclos alternados de 12 h de luz e escuridão s...

A SM é uma doença inflamatória desmielinizante do SNC e é um dos distúrbios neurológicos mais comuns causadores de incapacidade crônica em jovens, impondo um enorme fardo às famílias e à sociedade 3,4. A SM sempre foi classificada como uma doença autoimune mediada por células T específicas de órgãos, induzindo o sistema autoimune a corroer lentamente o SNC, o que envolverá múltiplos sistemas em todo o corpo27. Os sintomas ...

As doenças autoimunes são um espectro de distúrbios causados pela resposta imune do sistema imunológico aos seus próprios antígenos, resultando em danos ou disfunção tecidual1. A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica de polineuropatia no sistema nervoso central (SNC), caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e degeneração axonal neuronal 2,3. Atualmente, a EM afetou até 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente jovens e pessoas de meia-idade com idades entre 20 e 40 anos, que são muitas vezes a espinha dorsal de suas famílias e da sociedade. Isso tem causado considerável impacto e danos às famílias e à sociedade 2,4.
A SM é uma doença multifatorial com manifestações clínicas diversas e complexas. Além dos distúrbios neurológicos clássicos caracterizados por infiltração inflamatória e desmielinização, a SM frequentemente apresenta deficiência visual, discinesia de membros e distúrbios cognitivos e emocionais 5,6,7. Se os pacientes com EM não receberem o tratamento adequado e correto, metade deles viverá em cadeiras de rodas após 20 anos, e quase metade deles experimentará sintomas depressivos e de ansiedade, levando a níveis muito mais elevados de ideação suicida do que a população em geral 8,9.
Apesar de um longo período de pesquisa, a etiologia da EM permanece indescritível, e a patogênese da EM ainda não foi elucidada. Modelos animais de EM permitiram servir como ferramentas de teste para explorar o desenvolvimento de doenças e novas abordagens terapêuticas, apesar das diferenças significativas entre os sistemas imunológico de roedores e humanos, ao mesmo tempo em que compartilhavam alguns princípios básicos. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é atualmente o modelo animal ideal para o estudo da EM, que usa a imunidade de autoantígenos das proteínas da mielina para induzir a autoimunidade aos componentes do SNC em camundongos suscetíveis, com a adição de adjuvante de Freund completo (CFA) e toxina pertussis (PTX) para melhorar a resposta imune humoral. Dependendo do contexto genético e dos antígenos imunológicos, diferentes processos patológicos, incluindo agudos, remitentes-recorrentes ou crônicos, são obtidos para mimetizar várias formas clínicas de SM10,11,12. Os imunógenos relevantes comumente usados na construção de modelos EAE vêm de proteínas do auto-SNC, como a proteína básica de mielina (MBP), a proteína proteolipídica (PLP) ou a glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG). Camundongos SJL/L imunizados com MBP ou PLP desenvolvem um curso remitente-recorrente, e o MOG desencadeia EAE crônica progressiva em camundongos C57BL/611,12,13.
O principal objetivo da terapia modificadora da doença (DMT) é minimizar os sintomas da doença e melhorar a função6. Várias drogas são usadas clinicamente para aliviar a EM, mas nenhuma droga ainda foi usada para curá-la completamente, revelando a necessidade de tratamento sinérgico. Os camundongos C57BL/6 são atualmente os mais comumente utilizados para a construção de camundongos transgênicos e, neste trabalho, um modelo EAE induzido pelo MOG35-55 em camundongos C57BL/6J com uma escala de 5 pontos foi usado para monitorar a progressão da doença. Os modelos EAE também sofrem de humor semelhante à ansiedade e perda óssea, e as lesões desmielinizantes amplamente conhecidas. Aqui, o método para avaliar os sintomas de EAE a partir de múltiplas perspectivas usando teste de campo aberto e análise de tomografia micro-computadorizada (Micro-CT) também é descrito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe(with 26 G needle)</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>HAIKELASI</td>
			<td>KY-LXG2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locomotion activity (open field) video analysis system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td>DigBehv-002</td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55 peptide</td>
			<td>Gill Biochemical Co., Ltd</td>
			<td>GLS-Y-M-03590</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td>
			<td>BD</td>
			<td>231141</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open field reaction chamber</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>516560</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>J21010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing film</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS 234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;CT 35 desktop microCT scanner</td>
			<td>Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune típica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e dano axonal. Atualmente, não há medidas para curar completamente a EM, mas várias terapias modificadoras da doença (DMT) estão disponíveis para controlar e mitigar a progressão da doença. Existem semelhanças significativas entre as características patológicas do SNC da encefalomielite autoimune experimental (EAE) e pacientes com EM. O EAE tem sido amplamente utilizado como um modelo representativo para determinar a eficácia dos medicamentos para EM e explorar o desenvolvimento de novas terapias para a doença da EM. A indução ativa de EAE em camundongos tem um efeito estável e reprodutível e é particularmente adequada para estudar os efeitos de drogas ou genes na neuroinflamação autoimune. O método de imunização de camundongos C57BL/6J com glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) e a avaliação diária dos sintomas da doença usando um sistema de pontuação clínica são compartilhados principalmente. Dada a complexa etiologia da SM com diversas manifestações clínicas, o sistema de pontuação clínica existente não pode satisfazer a avaliação do tratamento da doença. Para evitar as deficiências de uma única intervenção, novos indicadores para avaliar EAE com base nas manifestações clínicas de humor semelhante à ansiedade e osteoporose em pacientes com EM são criados para fornecer uma avaliação mais abrangente do tratamento da EM.

Após a imunização dos camundongos, o peso corporal dos camundongos é registrado diariamente, e seus sintomas clínicos são avaliados de acordo com o protocolo descrito acima (etapa 4). Em camundongos C57BL / 6J imunizados com peptídeo MOG, porque a localização da lesão está confinada principalmente à medula espinhal, a patogênese dos camundongos EAE se espalha da extremidade da cauda até a cabeça. No início da doença, os camundongos EAE exibem fraqueza e queda da cauda, seguidos por fraqueza dos membros p...

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Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...

Atualmente não há cura completa para a esclerose múltipla. Nosso protocolo permite a construção efetiva de um modelo experimental de encefalomielite autoimune para ajudar a explorar terapias para a doença da esclerose múltipla. A principal vantagem do nosso protocolo é uma avaliação mais abrangente do tratamento da encefalomielite autoimune experimental a partir de múltiplas perspectivas.Primeiro, prepare a emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina dissolvendo peptídeo liofilizado e PBS estéril pré-resfriado sem íons cálcio e magnésio em pH 7,4. Adicione uma esfera de aço esterilizada de cinco milímetros a um tubo de microcentrífuga limpo de dois mililitros. Em seguida, adicione 500 microlitros de adjuvante completo de Freuds contendo cinco miligramas por mililitro de microbactéria liofilizada tuberculose e 500 microlitros da emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina ao tubo.Agora oscile o tubo em um lisador de tecido por 10 minutos. Em seguida, esfrie os tubos no gelo por 10 minutos. Repita o processo quatro vezes até que uma solução viscosa branca seja formada.Em seguida, dilua a solução de caule de toxina pertussis 50 vezes em PBS estéril de pH 7,4 sem íons cálcio e magnésio para atingir uma concentração final de 200 nanogramas por 100 microlitros. Para precipitar toda a emulsão de peptídeo glicoproteico de oligodendrócitos de mielina inicialmente preparada no fundo do tubo, centrifugar o tubo a quatro graus Celsius por dois a três segundos, pressionando o botão de pulso no equipamento. Aspirar a emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina com uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 22 e transferir a emulsão para um novo barril de seringa de 1 mililitro.Fixe uma agulha de calibre 26 ao cano e prenda a conexão com um filme de vedação. Injete 100 microlitros da emulsão de peptídeo glicoproteína oligodendrócitos de mielina por via subcutânea em cada lado da coluna dorsal de um rato. Após a injeção, observe a formação automática de massas bulbosas sob a pele e o dorso.Em seguida, por via intraperitoneal, injete 100 microlitros de toxina pertussis no mesmo rato. Prepare uma câmara de reação de campo aberto e configure um sistema de análise de vídeo para registrar a locomoção do rato. Para limpar a câmara de reação antes do experimento, borrife etanol a 70% em toda a área e limpe com uma toalha de papel limpa.Em seguida, coloque um rato no canto de uma câmara de reação. Para começar a filmar, clique no botão Iniciar captura na barra de menus do sistema de gravação de vídeo e registre o tempo. Mantendo silêncio na sala de testes, deixe o mouse se mover livremente por cinco minutos.Em seguida, pare a gravação e salve o vídeo. Coloque o mouse de volta em sua gaiola. Em seguida, limpe a área de teste com etanol a 70% e prossiga para o próximo mouse.Mantenha o rato eutanasiado plano em uma bandeja de dissecação e fixe as extremidades. Segure a pele do membro posterior no rato com fórceps e abra a pele e os músculos com uma tesoura. Em seguida, separe o fêmur da tíbia e do osso do quadril usando cuidadosamente a tesoura.Remova os músculos aderentes ao fêmur com uma tesoura. Em seguida, coloque o fêmur em etanol a 70% à temperatura ambiente. Neste estudo, avaliou-se a capacidade do peptídeo derivado da glicoproteína oligodendrócitos da mielina de induzir EAE.Ratos injetados com o peptídeo experimentaram perda de peso progressiva. Após seis a nove dias de injeção, eles desenvolveram sintomas de EAE que atingiram o pico após 14 a 16 dias. Gráficos de pista do teste de campo aberto demonstraram que o EAE altera o comportamento exploratório normal dos camundongos.Em comparação com ratos normais, os ratos com EAE viajaram significativamente menos distância nas fases iniciais de início, pico e remissão. Camundongos com EAE também tiveram uma duração de atividade significativamente reduzida nas fases de pico e remissão da doença. Além disso, em todas as três fases, os camundongos EAE tiveram significativamente menos distância de viagem e tempo gasto no centro.Tomografia computadorizada de fêmures de camundongos EAE revelou uma arquitetura trabecular diferente de camundongos normais. Os fêmures de camundongos EAE tiveram significativamente menos densidade mineral óssea e relação volume ósseo/volume tecidual do que aqueles de camundongos normais. Além disso, fêmures de camundongos com EAE apresentaram menor densidade de conexão trabecular, número trabecular e espessura trabecular do que aqueles de camundongos normais.Em comparação com camundongos normais, o espaçamento trabecular foi aumentado e a espessura óssea cortical foi reduzida em camundongos EAE. Também podemos isolar o cérebro e o código espinhal de camundongos EAE no pico da doença e analisar a produção de células imunes e citocinas por citometria da gripe.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS) that commonly affects young adults. It is characterized by ...

Biologia

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