Name: induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis
Uploaded: 2022-09-09T12:30:00
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Los autores reconocen el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) y el Laboratorio Estatal Clave de Investigación de Medicamentos.

El Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Tongji aprobó el presente trabajo y se siguieron todas las pautas de cuidado de los animales. Se utilizaron ratones machos o hembras C57BL / 6J entre 8-12 semanas de edad para los experimentos. Se aseguró que la edad y el sexo fueran los mismos en los grupos experimentales; de lo contrario, la susceptibilidad a la enfermedad se vio afectada. Los ratones fueron alojados en un ambiente específico libre de patógenos con ciclos alternos de luz y oscuridad de 12 h en ...

El SM es una enfermedad inflamatoria desmielinizante del SNC y es uno de los trastornos neurológicos más comunes que causan discapacidad crónica en los jóvenes, imponiendo una gran carga a las familias y a la sociedad 3,4. La EM siempre ha sido clasificada como una enfermedad autoinmune mediada por células T específicas de órganos, induciendo al sistema autoinmune a erosionar lentamente el SNC, lo que involucrará múltiples sistemas en todo el cuerpo<sup ...

Las enfermedades autoinmunes son un espectro de trastornos causados por la respuesta inmune del sistema inmune a sus propios antígenos que resultan en daño o disfunción tisular1. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica de polineuropatía en el sistema nervioso central (SNC), caracterizada por infiltración inflamatoria, desmielinización y degeneración axonal neuronal 2,3. En la actualidad, la EM ha afectado a hasta 2,5 millones de personas en todo el mundo, en su mayoría jóvenes y de mediana edad de entre 20 y 40 años, que a menudo son la columna vertebral de sus familias y de la sociedad. Esto ha causado un impacto y daño considerable a las familias y a la sociedad 2,4.
La EM es una enfermedad multifactorial con manifestaciones clínicas diversas y complejas. Además de los trastornos neurológicos clásicos caracterizados por infiltración inflamatoria y desmielinización, la EM a menudo muestra discapacidad visual, discinesia de las extremidades y trastornos cognitivos y emocionales 5,6,7. Si los pacientes con EM no reciben el tratamiento adecuado y correcto, la mitad de ellos vivirá en sillas de ruedas después de 20 años, y casi la mitad de ellos experimentará síntomas depresivos y de ansiedad, lo que llevará a niveles mucho más altos de ideación suicida que la población general 8,9.
A pesar de un largo período de investigación, la etiología de la EM sigue siendo difícil de alcanzar, y la patogénesis de la EM aún no se ha dilucidado. Los modelos animales de EM han permitido servir como herramientas de prueba para explorar el desarrollo de enfermedades y nuevos enfoques terapéuticos, a pesar de las diferencias significativas entre los sistemas inmunológico roedor y humano, mientras que al mismo tiempo comparten algunos principios básicos. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es actualmente el modelo animal ideal para estudiar la EM, que utiliza la inmunidad a los autoantígenos de las proteínas de mielina para inducir la autoinmunidad a los componentes del SNC en ratones susceptibles, con la adición de adyuvante completo de Freund (CFA) y toxina pertussis (PTX) para mejorar la respuesta inmune humoral. Dependiendo de los antecedentes genéticos y los antígenos inmunes, se obtienen diferentes procesos de la enfermedad, incluidos los agudos, recurrentes-remitentes o crónicos, para imitar varias formas clínicas de EM10,11,12. Los inmunógenos relevantes comúnmente utilizados en la construcción de modelos EAE provienen de proteínas auto-SNC, como la proteína básica de mielina (MBP), la proteína proteolípida (PLP) o la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG). Los ratones SJL/L inmunizados con MBP o PLP desarrollan un curso recurrente-remitente, y MOG desencadena EAE progresiva crónica en ratones C57BL / 611,12,13.
El objetivo principal de la terapia modificadora de la enfermedad (DMT) es minimizar los síntomas de la enfermedad y mejorar la función6. Varios medicamentos se usan clínicamente para aliviar la EM, pero aún no se ha utilizado ningún medicamento para curarla por completo, lo que revela la necesidad de un tratamiento sinérgico. Los ratones C57BL/6 son actualmente los más utilizados para construir ratones transgénicos, y en este trabajo se utilizó un modelo EAE inducido por MOG35-55 en ratones C57BL/6J con una escala de 5 puntos para monitorizar la progresión de la enfermedad. Los modelos EAE también sufren de estados de ánimo similares a la ansiedad y pérdida ósea, y las lesiones desmielinizantes ampliamente conocidas. Aquí también se describe el método para evaluar los síntomas de EAE desde múltiples perspectivas mediante prueba de campo abierto y análisis de microtomografía computarizada (Micro-CT).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe(with 26 G needle)</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>HAIKELASI</td>
			<td>KY-LXG2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd</td>
			<td>60017208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s Adjuvant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioned place preference system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Locomotion activity (open field) video analysis system</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td>DigBehv-002</td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35-55 peptide</td>
			<td>Gill Biochemical Co., Ltd</td>
			<td>GLS-Y-M-03590</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra</td>
			<td>BD</td>
			<td>231141</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open field reaction chamber</td>
			<td>Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>Animal behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>516560</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>J21010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing film</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS 234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>69975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;CT 35 desktop microCT scanner</td>
			<td>Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune típica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por infiltración inflamatoria, desmielinización y daño axonal. Actualmente, no existen medidas para curar la EM por completo, pero hay múltiples terapias modificadoras de la enfermedad (DMT) disponibles para controlar y mitigar la progresión de la enfermedad. Existen similitudes significativas entre las características patológicas del SNC de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y los pacientes con EM. EAE se ha utilizado ampliamente como modelo representativo para determinar la eficacia de los fármacos para la EM y explorar el desarrollo de nuevas terapias para la enfermedad de la EM. La inducción activa de EAE en ratones tiene un efecto estable y reproducible y es particularmente adecuada para estudiar los efectos de fármacos o genes sobre la neuroinflamación autoinmune. El método de inmunización de ratones C57BL / 6J con glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) y la evaluación diaria de los síntomas de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica se comparte principalmente. Dada la compleja etiología de la EM con diversas manifestaciones clínicas, el sistema de puntuación clínica existente no puede satisfacer la evaluación del tratamiento de la enfermedad. Para evitar las deficiencias de una sola intervención, se crean nuevos indicadores para evaluar la EAE basados en las manifestaciones clínicas de estados de ánimo similares a la ansiedad y la osteoporosis en pacientes con EM para proporcionar una evaluación más completa del tratamiento de la EM.

Después de la inmunización de los ratones, el peso corporal de los ratones se registra diariamente y sus síntomas clínicos se evalúan de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente (paso 4). En ratones C57BL / 6J inmunizados con péptido MOG, debido a que la ubicación de la lesión se limita principalmente a la médula espinal, la patogénesis de los ratones EAE se propaga desde el extremo de la cola hasta la cabeza. Al comienzo de la enfermedad, los ratones EAE presentan debilidad y caída de la cola, seguidas...

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Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is a typical autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by inflammatory infiltration, demyelination, and ...

Actualmente no existe una cura completa para la esclerosis múltiple. Nuestro protocolo permite la construcción efectiva de un modelo experimental de encefalomielitis autoinmune para ayudar a explorar terapias para la enfermedad de la esclerosis múltiple. La principal ventaja de nuestro protocolo es una evaluación más completa del tratamiento de la encefalomielitis autoinmune experimental desde múltiples perspectivas.Primero preparar la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina disolviendo el péptido liofilizado y el PBS estéril preenfriado sin iones de calcio y magnesio a pH 7.4. Agregue una bola de acero esterilizada de cinco milímetros a un tubo de microcentrífuga limpio de dos mililitros. Luego agregue 500 microlitros de adyuvante completo de Freuds que contiene cinco miligramos por mililitro de microbacteria tuberculosis liofilizada y 500 microlitros de la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina al tubo.Ahora oscile el tubo en un lisor de tejido durante 10 minutos. Luego enfríe los tubos en hielo durante 10 minutos. Repita el proceso cuatro veces hasta que se forme una solución viscosa blanca.A continuación, diluya la solución de tallo de toxina pertussis 50 veces en PBS estéril de pH 7.4 sin iones de calcio y magnesio para lograr una concentración final de 200 nanogramos por 100 microlitros. Para precipitar toda la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina preparada inicialmente en el fondo del tubo, centrifugar el tubo a cuatro grados Celsius durante dos o tres segundos, presionando el botón de pulso en el equipo. Aspire la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina con una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 22 y transfiera la emulsión a un nuevo barril de jeringa de 1 mililitro.Fije una aguja de calibre 26 al barril y asegure la conexión con una película de sellado. Inyecte 100 microlitros de la emulsión peptídica de glicoproteína oligodendrocitos de mielina por vía subcutánea a cada lado de la columna dorsal de un ratón. Después de la inyección, observe la formación automática de masas bulbosas debajo de la piel y el dorso.Luego, por vía intraperitoneal, inyecte 100 microlitros de toxina pertussis en el mismo ratón. Prepare una cámara de reacción de campo abierto y configure un sistema de análisis de video para grabar la locomoción del ratón. Para limpiar la cámara de reacción antes del experimento, rocíe etanol al 70% en toda el área y limpie con una toalla de papel limpia.A continuación, coloque un ratón en la esquina de una cámara de reacción. Para comenzar a disparar, haga clic en el botón de inicio de captura en la barra de menú del sistema de grabación de video y grabe la hora. Manteniendo el silencio en la sala de pruebas, deje que el mouse se mueva libremente durante cinco minutos.Luego detenga la grabación y guarde el video. Vuelva a colocar el ratón en su jaula. Luego limpie el área de prueba con etanol al 70% y continúe con el siguiente ratón.Mantenga el ratón sacrificado plano en una bandeja de disección y fije las extremidades. Sostenga la piel de las extremidades posteriores en el ratón con fórceps y abra la piel y los músculos con tijeras. A continuación, separe el fémur de la tibia y el hueso de la cadera usando cuidadosamente las tijeras.Retire los músculos adheridos al fémur con tijeras. Luego coloque el fémur en etanol al 70% a temperatura ambiente. En este estudio, se evaluó la capacidad del péptido derivado de la glicoproteína oligodendrocitos de mielina para inducir EAE.Los ratones inyectados con el péptido experimentaron una pérdida de peso progresiva. Después de seis a nueve días de inyección, desarrollaron síntomas de EAE que alcanzaron su punto máximo después de 14 a 16 días. Los gráficos de seguimiento de la prueba de campo abierto demostraron que EAE altera el comportamiento exploratorio normal de los ratones.En comparación con los ratones normales, los ratones con EAE viajaron significativamente menos distancia en las fases tempranas de inicio, pico y remisión. Los ratones con EAE también tuvieron una duración significativamente reducida de la actividad en las fases pico y de remisión de la enfermedad. Además, en las tres fases los ratones EAE tuvieron significativamente menos distancia de viaje y tiempo pasado en el centro.Las tomografías microcomputarizadas de fémures de ratones EAE revelaron una arquitectura trabecular diferente a la de ratones normales. Los fémures de ratones EAE tenían significativamente menos densidad mineral ósea y proporción de volumen óseo a volumen de tejido que los de ratones normales. Además, los fémures de ratones con EAE tenían menos densidad de conexión trabecular, número trabecular y grosor trabecular que los de ratones normales.En comparación con los ratones normales, el espaciamiento trabecular se mejoró y el grosor del hueso cortical se redujo en ratones EAE. También podemos aislar el cerebro y el código espinal de ratones EAE en el pico de la enfermedad y analizar la producción de células inmunes y citoquinas mediante citometría gripal.

Research

JoVE Journal

Biology

Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

La inducción y la puntuación clínica de enfermedades crónico-recurrente encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS) that commonly affects young adults. It is characterized by ...

Investigación

Biología

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Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...