Name: fragmenting bulk hydrogels and processing into granular hydrogels for biomedical applications
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla National Science Foundation attraverso il programma UPenn MRSEC (DMR-1720530) e borse di ricerca universitarie (a V.G.M e M.E.P.) e il National Institutes of Health (R01AR077362 a J.A.B.).

1. Fabbricazione di idrogel sfusi all'interno di una siringa utilizzando il photocrosslinking
NOTA: una panoramica della fabbricazione di idrogel sfuso all'interno di una siringa mediante fotocollegamento è mostrata nella Figura 1. Questo protocollo utilizza acido ialuronico modificato dal norbornene (NorHA) per fabbricare idrogel di massa utilizzando una reazione tiolo-ene foto-mediata. Le procedure dettagliate per la sintesi di NorHA sono descrit...

Qui vengono descritti i metodi per fabbricare idrogel granulari utilizzando microgel frammentati per estrusione e imballaggio mediante centrifugazione o filtrazione sotto vuoto. Rispetto ad altri metodi di fabbricazione di microgel (ad esempio, microfluidica, emulsioni batch, elettrospruzzi, fotolitografia), la fabbricazione di microgel a frammentazione di estrusione è altamente rapida, a basso costo, facilmente scalabile e suscettibile di un'ampia varietà di sistemi di idrogel. Inoltre, questo protocollo è altamente ...

Gli idrogel granulari sono fabbricati attraverso l'imballaggio di particelle di idrogel (cioè microgel) e sono una classe entusiasmante di biomateriali con molte proprietà vantaggiose per applicazioni biomediche 1,2,3. A causa della loro struttura particolata, gli idrogel granulari sono diradamento del taglio e auto-guarigione, consentendo il loro uso come inchiostri per la stampa di estrusione (bio) inchiostri, supporti granulari per la stampa incorporata e terapie iniettabili 4,5,6,7,8,9. Inoltre, lo spazio vuoto tra i microgel fornisce una porosità su microscala per il movimento cellulare e la diffusione molecolare 8,10,11. Inoltre, più popolazioni di microgel possono essere combinate in un'unica formulazione per consentire una maggiore sintonizzazione e funzionalità del materiale 8,10,12,13. Queste importanti proprietà hanno motivato la rapida espansione dello sviluppo di idrogel granulare negli ultimi anni.
È disponibile una gamma di metodi per formare microgel verso la fabbricazione di idrogel granulari, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi. Ad esempio, i microgel sono spesso formati da emulsioni acqua-in-olio che utilizzano microfluidica a goccia 4,11,13,14,15,16,17, emulsioni batch 7,18,19,20,21,22 o elettrospruzzi 6,23, 24,25. Questi metodi producono microgel sferici con diametri uniformi (microfluidici) o polidispersi (emulsioni batch, elettrosperatori). Esistono alcune limitazioni a questi metodi di fabbricazione di emulsioni acqua-in-olio, tra cui la produzione potenzialmente a bassa produttività, la necessità di soluzioni precursori di idrogel a bassa viscosità e l'elevato costo e le risorse per l'installazione. Inoltre, questi protocolli possono richiedere oli e tensioattivi aggressivi che devono essere lavati dai microgel utilizzando procedure che aggiungono fasi di lavorazione e possono essere difficili da tradurre in condizioni sterili per applicazioni biomediche in molti laboratori. Eliminando la necessità di emulsioni acqua-in-olio, può essere utilizzata anche la (foto)litografia, dove vengono utilizzati stampi o fotomaschere per controllare la polimerizzazione di microgel da soluzioni precursori di idrogel 1,26,27. Come la microfluidica, questi metodi possono essere limitati nella loro produttività, il che rappresenta una grande sfida quando sono necessari grandi volumi.
In alternativa a questi metodi, la frammentazione meccanica di idrogel sfusi è stata utilizzata per fabbricare microgel con dimensioni irregolari 19,28,29,30,31,32. Ad esempio, gli idrogel sfusi possono essere preformati e successivamente passati attraverso reti o setacci per formare microgel frammentati, un processo che è stato fatto anche in presenza di cellule all'interno di filamenti di microgel33,34. Gli idrogel sfusi sono stati anche trasformati in microgel con interruzione meccanica utilizzando tecniche come la macinazione con mortaio e pestello o attraverso l'uso di frullatori commerciali 35,36,37. Altri hanno anche usato l'agitazione meccanica durante la formazione di idrogel per fabbricare microgel frammentati (cioè gel fluidi)31.
I metodi qui descritti espandono queste tecniche di frammentazione meccanica e presentano un approccio semplice per fabbricare microgel con frammentazione di estrusione, utilizzando idrogel di acido ialuronico fototrasferibile (HA) come esempio. La frammentazione dell'estrusione utilizza solo siringhe e aghi per fabbricare microgel frammentati in un metodo a basso costo, ad alta produttività e facilmente scalabile che è appropriato per una vasta gamma di idrogel19,32. Inoltre, i metodi per assemblare questi microgel frammentati in idrogel granulari sono descritti utilizzando la centrifugazione (imballaggio basso) o la filtrazione sottovuoto (imballaggio alto). Infine, l'applicazione di questi idrogel granulari frammentati viene discussa per l'uso come inchiostro da stampa per estrusione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre metodi semplici che siano adattabili a un'ampia varietà di idrogel e possano essere implementati praticamente in qualsiasi laboratorio interessato agli idrogel granulari.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G NT Premium Series Dispensing Tip</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG30-0.5HPX</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5&#34; needle. Various sizes are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black folders</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5&#34;)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVH5</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5&#34; needle. Various sizes are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5&#34;)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVJ3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5&#34;)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVL0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Membrane Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent or confocal microscope</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td>To visualize microgels and granular hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrusion printer</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td>Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Adapters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-888-107</td>
			<td>Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#34;Analyze Particles&#34; information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock Tip Caps</td>
			<td>Integrated Dispensin g Solutions</td>
			<td>9991329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula for scooping</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Capable of speed up to 18,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscoft Execl</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Other programs can be used, such as Google Slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniCure S2000 Spot UV Curing System</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td>S2000</td>
			<td>Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB966C</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiometer</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repetier Host</td>
			<td>Hot-World GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td>3D printing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-based extrusion printer</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td>This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks/CAD software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SolidWorks Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Eye Protection (i.e., safety glasses)</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fragmenting bulk hydrogels and processing into granular hydrogels for biomedical applications

Gli idrogel granulari sono gruppi inceppati di microparticelle di idrogel (cioè "microgel"). Nel campo dei biomateriali, gli idrogel granulari hanno molte proprietà vantaggiose, tra cui iniettabilità, porosità su microscala e sintoniabilità mescolando più popolazioni di microgel. I metodi per fabbricare microgel spesso si basano su emulsioni acqua-in-olio (ad esempio, microfluidica, emulsioni batch, elettrospraying) o fotolitografia, che possono presentare elevate richieste in termini di risorse e costi e potrebbero non essere compatibili con molti idrogel. Questo lavoro descrive metodi semplici ma altamente efficaci per fabbricare microgel utilizzando la frammentazione dell'estrusione e per elaborarli in idrogel granulari utili per applicazioni biomediche (ad esempio, inchiostri per stampa 3D). In primo luogo, gli idrogel sfusi (utilizzando l'acido ialuronico fotocollegabile (HA) come esempio) vengono estrusi attraverso una serie di aghi con diametri sequenzialmente più piccoli per formare microgel frammentati. Questa tecnica di fabbricazione in microgel è rapida, a basso costo e altamente scalabile. Vengono descritti i metodi per inceppare i microgel in idrogel granulari mediante centrifugazione e filtrazione sotto vuoto, con post-reticolazione opzionale per la stabilizzazione dell'idrogel. Infine, gli idrogel granulari fabbricati da microgel frammentati sono dimostrati come inchiostri da stampa per estrusione. Mentre gli esempi qui descritti utilizzano HA fotocollegabile per la stampa 3D, i metodi sono facilmente adattabili per un'ampia varietà di tipi di idrogel e applicazioni biomediche.

I risultati rappresentativi di questi protocolli sono mostrati nella Figura 3 e nella Figura 6. La frammentazione dell'estrusione produce microgel con forme poligonali frastagliate con diametri compresi tra 10 e 300 μm (Figura 3). Inoltre, la circolarità varia da 0,2 (non circolare) a quasi 1 (cerchio perfetto) e le proporzioni vanno da 1 a 3 (Figura 3). Questi parametri descrivono le forme irregolari...

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Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Questo lavoro descrive metodi semplici, adattabili e a basso costo per fabbricare microgel con frammentazione di estrusione, elaborare i microgel in idrogel granulari iniettabili e applicare gli idrogel granulari come inchiostri da stampa per estrusione per applicazioni biomediche.

Frammentazione di idrogel sfusi e lavorazione in idrogel granulari per applicazioni biomediche

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Gli idrogel granulari sono una nuova entusiasmante classe di biomateriali con molte proprietà vantaggiose. La nostra speranza è che condividendo questi metodi, possiamo aumentare l'accesso e l'innovazione negli idrogel granulari per applicazioni biomediche. Questa tecnica è semplice, a basso costo, facilmente adattabile a molte sostanze chimiche e può essere implementata praticamente in qualsiasi laboratorio.Caricare una siringa da 3 millilitri con la soluzione precursore dell'idrogel. Rimuovere lo stantuffo dal retro di una siringa vuota da 3 millilitri e aggiungere un tappo di punta alla parte superiore della canna della siringa. Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per trasferire la soluzione precursore dell'idrogel nella canna della siringa con il tappo della punta.Tenere la canna della siringa con la soluzione precursore dell'idrogel in una mano con il cappuccio della punta rivolto verso il basso e l'estremità aperta della canna rivolta verso l'alto. Riportare lo stantuffo della siringa all'apertura del retro della canna della siringa. Spingere delicatamente lo stantuffo della siringa nella canna quel tanto che basta per sigillare l'apertura sul retro della canna della siringa, tenendo attentamente insieme lo stantuffo e la canna della siringa per assicurarsi che il retro della canna della siringa sia sigillato con lo stantuffo.Capovolgere la siringa in modo che lo stantuffo sia rivolto verso il basso e il cappuccio della punta sia ora rivolto verso l'alto. Rimuovere il tappo della punta e spingere delicatamente lo stantuffo nella canna della siringa fino a rimuovere tutta l'aria dalla siringa. Ricollegare il cappuccio della punta alla siringa.Assicurarsi che la soluzione precursore dell'idrogel sia fissata all'interno della siringa da 3 millilitri con un tappo a punta. Assicurarsi che vengano presi adeguati dispositivi di protezione individuale e salvaguardie prima di accendere la lampada UV. Posizionare la siringa da 3 millilitri caricata con la soluzione precursore dell'idrogel sotto la lampada uv a presa spot per un periodo di tempo desiderato per una foto-reticolazione completa.Spegnere la lampada UV e rimuovere la siringa. Assicurarsi che l'idrogel sia ora foto-reticolato all'interno della siringa. Rimuovere lo stantuffo dal retro di una siringa vuota da 3 millilitri.Fissare un tappo di punta al luer-lock. Rimuovere il cappuccio della punta dalla siringa contenente l'idrogel sfuso fotorelegato. Allineare la parte superiore della siringa idrogel con l'apertura della canna sulla siringa vuota.Estrudere l'idrogel sfuso attraverso l'apertura della siringa nella canna della siringa vuota. Tenere la siringa che contiene l'idrogel estruso in modo tale che il cappuccio della punta sia rivolto verso il basso e l'apertura della canna sia rivolta verso l'alto. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aggiungere 1,5 microlitri di PBS alla canna della siringa.Allineare lo stantuffo della siringa con l'apertura della canna, spingendo a malapena lo stantuffo abbastanza da creare una guarnizione. Capovolgere la siringa in modo che lo stantuffo sia ora rivolto verso il basso e il cappuccio della punta sia rivolto verso l'alto, assicurandosi di tenere insieme lo stantuffo e la canna della siringa in posizione in modo che non fuoriesca idrogel o PBS. Invertire più volte per mescolare l'idrogel frammentato con il PBS aggiunto.Tenere la siringa in modo che il cappuccio della punta sia rivolto verso l'alto e lo stantuffo sia rivolto verso il basso. Rimuovere il tappo della punta. Spingere lo stantuffo verso l'alto per rimuovere l'aria dall'interno della siringa.Estrudere la soluzione di idrogel frammentata attraverso una serie di aghi per creare microgel frammentati. Fissare un ago smussato calibro 18 sulla parte superiore della siringa contenente l'idrogel frammentato e PBS. Rimuovere lo stantuffo da una siringa fresca da 3 millilitri e fissare un tappo di punta alla canna della siringa vuota.Estrudere la soluzione di idrogel frammentata attraverso l'ago calibro 18 nella parte posteriore della canna della siringa vuota. Gettare la siringa vuota e l'ago nel flusso di rifiuti taglienti appropriato. Ripetere l'estrusione della soluzione di idrogel con un ago calibro 23, 27 e 30.All'ultima fase di estrusione, estrudere la soluzione di microgel frammentata in tubi di microcentrifuga. Lavare e isolare la sospensione di microgel frammentata. Usando un microcentrifuga, far girare la soluzione di microgel frammentata a 5.000 volte g per 5 minuti.Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 millilitro di PBS a ciascun tubo microcentrifuga contenente microgel frammentati e vortice per 5-10 secondi. Combina 20 microlitri di sospensione di microgel frammentata con 180 microlitri di PBS per creare una sospensione di microgel frammentata diluita.Vortice per mescolare accuratamente. Trasferire 50 microlitri di sospensione di microgel frammentata diluita in un vetrino per microscopio. Utilizzare un microscopio epifluorescente per acquisire immagini di microgel marcati fluorescenti con zoom 4x o 10x.Microgel frammentati di marmellata utilizzando la filtrazione sottovuoto. Assemblare e testare l'apparato di filtrazione sottovuoto. Fissare un imbuto Buchner all'interno di un pallone filtrante.Utilizzare tubi per collegare il pallone filtrante a una linea di vuoto. Posizionare un filtro a membrana nella tazza dell'imbuto Buckner. Accendere la linea del vuoto aprendo la valvola del quadrante.Testare la connessione pipettando circa 0,5 millilitri di PBS sul filtro a membrana e osservare che tutto il PBS passa attraverso il filtro e si raccoglie sul fondo del pallone filtrante. Dopo aver acceso la linea del vuoto e aver assicurato una tenuta completa, ruotare la soluzione di microgel frammentata. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, trasferire la soluzione di microgel frammentata sul filtro a membrana.Attendere circa 30 secondi affinché il vuoto estragga PBS dalla soluzione di microgel. Spegnere la linea del vuoto. Ottenere una siringa fresca da 3 millilitri e rimuovere lo stantuffo.Utilizzare una spatola metallica per prelevare l'idrogel granulare frammentato dal filtro e trasferirlo nella parte posteriore del barilotto della siringa vuota. Riportare lo stantuffo sulla siringa. Caricare l'idrogel granulare frammentato nella siringa ed è ora pronto per l'uso.Rimuovere il cappuccio della punta e sostituirlo con un ago a scelta. Caricare la siringa nella piattaforma di stampa scelta. Carica il file G-code preparato dalla fase di pianificazione nel software di stampa 3D.Passare al pannello Anteprima di stampa e premere Stampa. Non appena la deposizione di stampa è completa, esporre i costrutti di idrogel granulare frammentato alla luce UV per la fotorelazione e la stabilizzazione. La frammentazione dell'estrusione produce microgel con forme poligonali frastagliate con diametri che vanno da 10 a 300 micrometri.La circolarità varia da 0,2 a quasi 1 e le proporzioni vanno da 1 a 3. Questi parametri descrivono le forme irregolari e frastagliate del microgel formate dal processo di frammentazione. Se imballato insieme utilizzando la centrifugazione o la filtrazione sotto vuoto, l'idrogel granulare assemblato è diradante e autoriparante.L'idrogel granulare frammentato ha un'elevata fedeltà di forma e integrità meccanica per un idrogel iniettabile. Oltre a utilizzare idrogel granulari frammentati per la stampa 3D, questi sistemi possono anche essere utilizzati come piattaforme di coltura cellulare in vitro, nonché sistemi iniettabili per la riparazione dei tessuti e la somministrazione di farmaci. Questi metodi semplici e a basso costo portano i vantaggi dei biomateriali di idrogel granulare a più ricercatori, consentendo un maggiore accesso alla fabbricazione di idrogel granulare e l'innovazione nel campo dei biomateriali.

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