Name: fragmenting bulk hydrogels and processing into granular hydrogels for biomedical applications
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation a través del programa UPenn MRSEC (DMR-1720530) y becas de investigación de posgrado (a V.G.M y M.E.P.) y los Institutos Nacionales de Salud (R01AR077362 a J.A.B.).

1. Fabricación de hidrogeles a granel dentro de una jeringa mediante fotoreticulación
NOTA: En la Figura 1 se muestra una descripción general de la fabricación de hidrogel a granel dentro de una jeringa mediante fotoreticulación. Este protocolo utiliza ácido hialurónico modificado con norborneno (NorHA) para fabricar hidrogeles a granel utilizando una reacción de tiol-ene fotomediada. Los procedimientos detallados para la síntesis de NorHA ...

Aquí, se describen los métodos para fabricar hidrogeles granulares utilizando microgeles fragmentados por extrusión y empaque por centrifugación o filtración impulsada por vacío. En comparación con otros métodos de fabricación de microgel (es decir, microfluídica, emulsiones por lotes, electropulverización, fotolitografía), la fabricación de microgel de fragmentación por extrusión es altamente rápida, de bajo costo, fácilmente escalable y susceptible de una amplia variedad de sistemas de hidrogel. Ademá...

Los hidrogeles granulares se fabrican a través del empaquetamiento de partículas de hidrogel (es decir, microgeles) y son una clase emocionante de biomateriales con muchas propiedades ventajosas para aplicaciones biomédicas 1,2,3. Debido a su estructura de partículas, los hidrogeles granulares son de adelgazamiento por cizallamiento y autocuración, lo que permite su uso como tintas (bio)de impresión por extrusión, soportes granulares para impresión incrustada y terapias inyectables 4,5,6,7,8,9. Además, el espacio vacío entre microgeles proporciona una porosidad a microescala para el movimiento celular y la difusión molecular 8,10,11. Además, se pueden combinar múltiples poblaciones de microgeles en una sola formulación para permitir una mayor capacidad de ajuste y funcionalidad del material 8,10,12,13. Estas importantes propiedades han motivado la rápida expansión del desarrollo de hidrogel granular en los últimos años.
Existe una gama de métodos disponibles para formar microgeles hacia la fabricación de hidrogel granular, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Por ejemplo, los microgeles a menudo se forman a partir de emulsiones de agua en aceite que utilizan microfluídica de gotas 4,11,13,14,15,16,17, emulsiones por lotes 7,18,19,20,21,22 o electropulverización 6,23, 24,25. Estos métodos producen microgeles esféricos con diámetros uniformes (microfluídica) o polidispersos (emulsiones por lotes, electropulverización). Existen algunas limitaciones para estos métodos de fabricación de emulsión de agua en aceite, incluida la producción potencialmente de bajo rendimiento, la necesidad de soluciones precursoras de hidrogel de baja viscosidad y el alto costo y los recursos para la configuración. Además, estos protocolos pueden requerir aceites y surfactantes agresivos que deben lavarse de los microgeles utilizando procedimientos que agregan pasos de procesamiento, y pueden ser difíciles de traducir a condiciones estériles para aplicaciones biomédicas en muchos laboratorios. Eliminando la necesidad de emulsiones de agua en aceite, también se puede utilizar la (foto)litografía, donde se utilizan moldes o fotomáscaras para controlar el curado de microgeles de soluciones precursoras de hidrogel 1,26,27. Al igual que la microfluídica, estos métodos pueden estar limitados en su rendimiento de producción, lo cual es un gran desafío cuando se necesitan grandes volúmenes.
Como alternativa a estos métodos, se ha utilizado la fragmentación mecánica de hidrogeles a granel para fabricar microgeles con tamaños irregulares 19,28,29,30,31,32. Por ejemplo, los hidrogeles a granel pueden ser preformados y posteriormente pasados a través de mallas o tamices para formar microgeles fragmentados, un proceso que incluso se ha realizado en presencia de células dentro de hebras de microgel33,34. Los hidrogeles a granel también se han procesado en microgeles con interrupción mecánica utilizando técnicas como la molienda con mortero y mortero o mediante el uso de licuadoras comerciales 35,36,37. Otros también han utilizado la agitación mecánica durante la formación de hidrogel para fabricar microgeles fragmentados (es decir, geles fluidos)31.
Los métodos aquí presentes amplían estas técnicas de fragmentación mecánica y presentan un enfoque simple para fabricar microgeles con fragmentación por extrusión, utilizando hidrogeles de ácido hialurónico (HA) fotocruzables como ejemplo. La fragmentación por extrusión utiliza solo jeringas y agujas para fabricar microgeles fragmentados en un método de bajo costo, alto rendimiento y fácilmente escalable que es apropiado para una amplia gama de hidrogeles19,32. Además, los métodos para ensamblar estos microgeles fragmentados en hidrogeles granulares se describen utilizando centrifugación (bajo embalaje) o filtración impulsada por vacío (alto embalaje). Por último, se discute la aplicación de estos hidrogeles granulares fragmentados para su uso como tinta de impresión de extrusión. El objetivo de este protocolo es introducir métodos simples que se adapten a una amplia variedad de hidrogeles y se puedan implementar en prácticamente cualquier laboratorio interesado en hidrogeles granulares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Plastic Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G NT Premium Series Dispensing Tip</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG30-0.5HPX</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 30 G, 0.5&#34; needle. Various sizes are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (3 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 3 mL syringe. Various sizes are available (14-823-XXX).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black folders</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (18 G, 0.5&#34;)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVH5</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 18 G, 0.5&#34; needle. Various sizes are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (23 G, 0.5&#34;)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVJ3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines (27 G, 1.5&#34;)</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5FVL0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Catalog Number listed here is for a case of 10 x 500 mL bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Membrane Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent or confocal microscope</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td>To visualize microgels and granular hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrusion printer</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
			<td>Other extrusion printers can be use,d such as commercially available BIOX.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Adapters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-888-107</td>
			<td>Catalog Number listed here is for a set of multiple sizes. Various sizes are available (05-888-XXX).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate-dextran (2 MDa)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>&#34;Analyze Particles&#34; information link: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock Tip Caps</td>
			<td>Integrated Dispensin g Solutions</td>
			<td>9991329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula for scooping</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td>Capable of speed up to 18,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscoft Execl</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Other programs can be used, such as Google Slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniCure S2000 Spot UV Curing System</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td>S2000</td>
			<td>Different light systems may be used to fabricate bulk hydrogels if desired.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain Buchner Funnel with Fixed Perforated Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB966C</td>
			<td>Catalog Number listed here is for 56mm diameter plate. Various sizes are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiometer</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repetier Host</td>
			<td>Hot-World GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td></td>
			<td>3D printing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-based extrusion printer</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td>This study used a custom-modified 3D FDM printer (Velleman K8200). Many alternatives are available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks/CAD software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SolidWorks Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Other programs can be used, such as Blender or TinkerCAD.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing to Connect Filter Flask to Vacuum Line</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Eye Protection (i.e., safety glasses)</td>
			<td>Various Vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fragmenting bulk hydrogels and processing into granular hydrogels for biomedical applications

Los hidrogeles granulares son conjuntos atascados de micropartículas de hidrogel (es decir, "microgeles"). En el campo de los biomateriales, los hidrogeles granulares tienen muchas propiedades ventajosas, incluida la inyectabilidad, la porosidad a microescala y la capacidad de sintonización al mezclar múltiples poblaciones de microgeles. Los métodos para fabricar microgeles a menudo se basan en emulsiones de agua en aceite (por ejemplo, microfluídica, emulsiones por lotes, electropulverización) o fotolitografía, que pueden presentar altas demandas en términos de recursos y costos, y pueden no ser compatibles con muchos hidrogeles. Este trabajo detalla métodos simples pero altamente efectivos para fabricar microgeles utilizando la fragmentación por extrusión y procesarlos en hidrogeles granulares útiles para aplicaciones biomédicas (por ejemplo, tintas de impresión 3D). En primer lugar, los hidrogeles a granel (utilizando ácido hialurónico fotoreticulable (HA) como ejemplo) se extruyen a través de una serie de agujas con diámetros secuencialmente más pequeños para formar microgeles fragmentados. Esta técnica de fabricación de microgel es rápida, de bajo costo y altamente escalable. Se describen los métodos para atascar microgeles en hidrogeles granulares por centrifugación y filtración impulsada por vacío, con post-reticulación opcional para la estabilización del hidrogel. Por último, los hidrogeles granulares fabricados a partir de microgeles fragmentados se demuestran como tintas de impresión por extrusión. Si bien los ejemplos descritos en este documento utilizan HA fotoreticulable para la impresión 3D, los métodos son fácilmente adaptables para una amplia variedad de tipos de hidrogel y aplicaciones biomédicas.

Los resultados representativos de estos protocolos se muestran en la Figura 3 y la Figura 6. La fragmentación por extrusión produce microgeles con formas de polígonos irregulares con diámetros que oscilan entre 10-300 μm (Figura 3). Además, la circularidad varía de 0.2 (no circular) a casi 1 (círculo perfecto), y la relación de aspecto varía de 1 a 3 (Figura 3). Estos parámetros describen las...

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Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Este trabajo describe métodos sencillos, adaptables y de bajo costo para fabricar microgeles con fragmentación por extrusión, procesar los microgeles en hidrogeles granulares inyectables y aplicar los hidrogeles granulares como tintas de impresión de extrusión para aplicaciones biomédicas.

Fragmentación de hidrogeles a granel y procesamiento en hidrogeles granulares para aplicaciones biomédicas

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Los hidrogeles granulares son una nueva y emocionante clase de biomateriales con muchas propiedades ventajosas. Nuestra esperanza es que al compartir estos métodos, podamos aumentar el acceso y la innovación en hidrogeles granulares para aplicaciones biomédicas. Esta técnica es simple, de bajo costo, fácilmente adaptable a muchas químicas y se puede implementar en prácticamente cualquier laboratorio.Cargue una jeringa de 3 mililitros con la solución precursora de hidrogel. Retire el émbolo de la parte posterior de una jeringa vacía de 3 mililitros y agregue una tapa de punta a la parte superior del barril de la jeringa. Use una pipeta de 1.000 microlitros para transferir la solución precursora de hidrogel al barril de la jeringa con la tapa de la punta.Sostenga el barril de la jeringa con solución precursora de hidrogel en una mano con la tapa de la punta hacia abajo y el extremo abierto del barril hacia arriba. Devuelva el émbolo de la jeringa a la abertura de la parte posterior del barril de la jeringa. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa en el barril lo suficiente como para sellar la abertura en la parte posterior del barril de la jeringa, manteniendo cuidadosamente el émbolo y el barril de la jeringa juntos para asegurarse de que la parte posterior del barril de la jeringa esté sellada con el émbolo.Invierta la jeringa de tal manera que el émbolo esté hacia abajo y la tapa de la punta ahora esté hacia arriba. Retire la tapa de la punta y empuje suavemente el émbolo en el barril de la jeringa hasta que se elimine todo el aire de la jeringa. Vuelva a colocar la tapa de la punta en la jeringa.Asegúrese de que la solución precursora de hidrogel esté asegurada dentro de la jeringa de 3 mililitros con una tapa de punta. Asegúrese de que se tomen el equipo de protección personal adecuado y las protecciones antes de encender la lámpara UV. Coloque la jeringa de 3 mililitros cargada con la solución precursora de hidrogel debajo de la lámpara de curado de puntos UV durante el tiempo deseado para que se reticule completamente.Apague la lámpara UV y retire la jeringa. Asegúrese de que el hidrogel esté ahora foto-reticulado dentro de la jeringa. Retire el émbolo de la parte posterior de una jeringa vacía de 3 mililitros.Asegure una tapa de punta al luer-lock. Retire la tapa de la punta de la jeringa que contiene el hidrogel a granel fotoreticulado. Alinee la parte superior de la jeringa de hidrogel con la abertura del barril en la jeringa vacía.Extruya el hidrogel a granel a través de la abertura de la jeringa en el barril de la jeringa vacía. Sostenga la jeringa que contiene el hidrogel extruido de tal manera que la tapa de la punta esté hacia abajo y la abertura del barril esté hacia arriba. Usando una pipeta de 1, 000 microlitros, agregue 1.5 microlitros de PBS al barril de la jeringa.Alinee el émbolo de la jeringa con la abertura del barril, apenas empujando el émbolo lo suficiente como para crear un sello. Invierta la jeringa de tal manera que el émbolo ahora esté hacia abajo y la tapa de la punta esté hacia arriba, asegurándose de mantener el émbolo y el barril de la jeringa juntos en su lugar para que no se filtre hidrogel o PBS. Invierta varias veces para mezclar el hidrogel fragmentado con el PBS agregado.Sostenga la jeringa de tal manera que la tapa de la punta esté hacia arriba y el émbolo hacia abajo. Retire la tapa de la punta. Muy suavemente, empuje el émbolo hacia arriba para eliminar el aire del interior de la jeringa.Extruir la solución de hidrogel fragmentado a través de una serie de agujas para crear microgeles fragmentados. Asegure una aguja de punta roma calibre 18 en la parte superior de la jeringa que contiene el hidrogel fragmentado y PBS. Retire el émbolo de una jeringa fresca de 3 mililitros y asegure una tapa de punta al barril de la jeringa vacío.Extruya la solución de hidrogel fragmentada a través de la aguja de calibre 18 en la parte posterior del barril de la jeringa vacío. Deseche la jeringa y la aguja vacías en el flujo de desechos de objetos punzantes adecuado. Repita la extrusión de la solución de hidrogel con una aguja de calibre 23, 27 y 30.En el último paso de extrusión, extruya la solución de microgel fragmentada en tubos de microcentrífuga. Lave y aísle la suspensión de microgel fragmentada. Usando una microcentrífuga, gire hacia abajo la solución de microgel fragmentada a 5, 000 veces g durante 5 minutos.Use una pipeta para quitar el sobrenadante. Agregue 1 mililitro de PBS a cada tubo de microcentrífuga que contenga microgeles fragmentados y vórtice durante 5 a 10 segundos. Combine 20 microlitros de suspensión de microgel fragmentado con 180 microlitros de PBS para crear una suspensión de microgel fragmentada diluida.Vórtice para mezclar a fondo. Transfiera 50 microlitros de suspensión de microgel fragmentado diluido a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Use un microscopio epifluorescente para adquirir imágenes de microgeles marcados fluorescentemente con un zoom de 4x o 10x.Microgeles fragmentados por atasco mediante filtración impulsada por vacío. Montar y probar el aparato de filtración accionado por vacío. Asegure un embudo Buchner dentro de un matraz de filtro.Utilice tubos para conectar el matraz del filtro a una línea de vacío. Coloque un filtro de membrana en la copa del embudo buckner. Encienda la línea de vacío abriendo la válvula del dial.Pruebe la conexión canalizando aproximadamente 0,5 mililitros de PBS en el filtro de membrana y observe que todo el PBS pasa a través del filtro y se acumula en la parte inferior del matraz del filtro. Después de encender la línea de vacío y asegurar un sellado completo, vórtice la solución de microgel fragmentada. Usando una pipeta de 1, 000 microlitros, transfiera la solución de microgel fragmentado al filtro de membrana.Espere aproximadamente 30 segundos para que el vacío saque el PBS de la solución de microgel. Apague la línea de vacío. Obtenga una jeringa fresca de 3 mililitros y retire el émbolo.Use una espátula de metal para extraer el hidrogel granular fragmentado del filtro y transfiéralo a la parte posterior del barril de la jeringa vacío. Devuelva el émbolo a la jeringa. Cargue el hidrogel granular fragmentado en la jeringa y ahora está listo para su uso.Retire la tapa de la punta y reemplácela con una aguja de su elección. Cargue la jeringa en la plataforma de impresión de su elección. Cargue el archivo de código G preparado desde la fase de planificación en el software de impresión 3D.Desplácese hasta el panel Vista previa de impresión y pulse Imprimir. Tan pronto como se complete la deposición de impresión, exponga las construcciones de hidrogel granular fragmentado a la luz UV para la foto-reticulación y estabilización. La fragmentación por extrusión produce microgeles con formas de polígonos dentados con diámetros que van de 10 a 300 micrómetros.La circularidad varía de 0.2 a casi 1 y la relación de aspecto varía de 1 a 3. Estos parámetros describen las formas irregulares y dentadas de microgel formadas por el proceso de fragmentación. Cuando se empaqueta juntos mediante centrifugación o filtración impulsada por vacío, el hidrogel granular ensamblado se adelgaza por cizallamiento y se autocura.El hidrogel granular fragmentado tiene una alta fidelidad de forma e integridad mecánica para un hidrogel inyectable. Además de utilizar hidrogeles granulares fragmentados para la impresión 3D, estos sistemas también se pueden utilizar como plataformas de cultivo celular in vitro, así como sistemas inyectables para la reparación de tejidos y la administración de fármacos. Estos métodos simples y de bajo costo brindan las ventajas de los biomateriales de hidrogel granular a más investigadores, lo que permite un mayor acceso a la fabricación de hidrogel granular, así como la innovación en el campo de los biomateriales.

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