Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Tak til Dr. L Bozhilova for råd om den statistiske analyse af PCR-data fra dråbegenerering. Tak til Dr. H Zhang for at levere de oocytter, der bruges til at generere data i figur 3C og figur 4B. Dette arbejde blev udført af SPB ved Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, og finansieret af et Wellcome Trust Principal Research Fellowship afholdt af PFC (212219/Z/18/Z).

Alle eksperimenter fulgte ARRIVE-retningslinjerne og blev godkendt af University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).
BEMÆRK: Alle prøveforberedelsestrin inden dråbegenerering skal udføres i et rent præ-PCR-arbejdsområde, ideelt i et UV-steriliseret skab, hvor det er muligt. Den her beskrevne protokol anvender specifikt PCR-udstyr til dråbegenerering (se Materialetabel), og selvom den generelle metode bør kunne anvendes på andre systemer, anbefales...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription,+mass+and+respiratory+activity.">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--&gt;G.">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A--&gt;G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases.">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146 (2013).</li><li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse.">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells:+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues.">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li><li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA(Lys)+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+(MERRF).">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR.">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li><li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA:+age,+fiber+type,+and+mutation-induced+changes.">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li><li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution.">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li><li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control.">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li><li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells.">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li><li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis.">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li><li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms.">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, 2369-2378 (2013).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions.">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li><li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation.">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression.">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li><li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases.">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet her, gælder på tværs af en lang række celletyper og arter ud over dem, der er diskuteret ovenfor, selvom omhyggelig optimering af nye analysedesign vil være nøglen til at sikre, at metodens nøjagtighed og repeterbarhed opretholdes, når man bevæger sig væk fra tidligere validerede primer / sondekombinationer. Når man arbejder med enkeltceller, er det vigtigt at sikre, at prøveindsamlingen udføres så nøjagtigt som muligt (f.eks. ved hjælp af strenge enkeltcelleparametre ved so...

Mammalian mitokondrie (mt) DNA er et lille (ca. 16,5 Kb), cirkulært DNA-genom, der befinder sig i mitokondriematrixen, der koder for 37 gener, der omfatter to rRNA'er, 22 tRNA'er og 13 proteinkodende gener1. I modsætning til det nukleare genom, som indeholder en (haploid) eller to (diploide) kopier af hvert gen pr. celle, er mtDNA til stede i flere kopier i mitokondrierne i hver celle, lige fra snesevis af kopier (f.eks. Modne spermatocytter) til hundredtusinder af kopier (f.eks. Oocytter)2,3. En konsekvens af denne multi-copy natur er, at mutationer i mtDNA-genomet, som kan eksistere som enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er), deletioner eller duplikationer, kan være til stede på forskellige niveauer i en given celle, der udgør alt fra 0% til 100% af cellens samlede mtDNA-population. Eksistensen af vildtype- og mutante mtDNA-genomer i samme celle kaldes heteroplasmatisk, og patogene heteroplasmatiske mtDNA-mutationer er en væsentlig årsag til mitokondriesygdom med flere almindelige neurologiske syndromer forbundet med underliggende heteroplasmatiske mtDNA-mutationer4.
To nøgleparametre, der bidrager til sandsynligheden for, at en heteroplasmisk mtDNA-mutation, der forårsager klinisk sygdom, er heteroplasminiveauet og mtDNA-kopinummeret. Mange heteroplasmatiske mutationer viser en tærskeleffekt, hvor biokemiske og kliniske fænotyper kun bliver synlige over et bestemt heteroplasminiveau, typisk omkring 80%5, og efterfølgende forværres, da heteroplasmi stiger yderligere4. Det er dog også vigtigt at overveje antallet af kopier af mtDNA, der er til stede i cellen, da dette vil påvirke antallet af vildtype (dvs. 'sunde') mtDNA-genomer, der er til stede på et givet heteroplasminiveau. Undersøgelser af patienter med mitokondrie har fremhævet vigtigheden af dette samspil mellem heteroplasma og kopi nummer5,6, og Filograna et al. rapporterede for nylig en stigning i mtDNA-kopinummer, der lindrer symptomer på trods af uændret heteroplasmi i en musemodel af mitokondriesygdom7.
Mens der i de senere år er gjort meget for at forbedre forståelsen af patogenese og overførsel af sygdomme forårsaget af mtDNA-heteroplasmi, er det meste af dette arbejde blevet udført på vævsniveau snarere end celler, sammenligning af gennemsnitlige vævs heteroplasmaniveauer og kopinummermålinger erhvervet fra bulkvævsbiopsier og blodprøver. Nogle veletablerede teknikker, såsom laserfangstmikrodissektion, giver mulighed for sådanne målinger på celleniveau 8,9; Den nylige eksplosion af enkeltcelleanalysemetoder med høj kapacitet eller såkaldt "Single-cell Omics"10 har imidlertid skabt et krav om metoder, der nøjagtigt kan måle disse afgørende mtDNA-parametre på enkeltcelleniveau.
Dråbegenerering PCR-metoden udnytter de seneste fremskridt inden for mikrofluidisk teknologi til at forbedre eksisterende metoder til kvantificering af ukendte DNA-koncentrationer via PCR-amplifikation af specifikke målampliconer i prøve-DNA'et11. I modsætning til qPCR, hvor prøve-DNA'et amplificeres i en enkelt reaktion, hvor den relative akkumuleringshastighed af PCR-produkt fungerer som udlæsning, opdeler denne metode den oprindelige prøve i tusindvis af individuelle dråber og opdeler således prøve-DNA-molekylerne i rumligt adskilte reaktioner12. Den efterfølgende PCR-reaktion fortsætter i hver enkelt dråbe, hvor PCR-produktet kun akkumuleres i dråber, der indeholder mål-DNA'et. Resultatet af denne reaktion er et digitalt output i form af en pulje af dråber, der enten indeholder en kopi af mål-DNA'et og forstærket PCR-produkt eller ikke indeholder mål-DNA. Ved hjælp af fluorescerende DNA-sonder eller et dobbeltstrenget (ds) DNA-bindende farvestof kan dråberne indeholdende amplificeret produkt tælles, og forholdet mellem 'positive' og 'negative' dråber kan bruges til at beregne det absolutte antal DNA-kopier, der var til stede i den oprindelige prøve. Denne absolutte måling, i modsætning til den relative måling erhvervet fra en qPCR-reaktion, er nøglefaktoren, der gør det muligt at bruge denne metode til nøjagtig måling af mtDNA-kopinummer og heteroplasmi i enkeltceller11, og flere nylige undersøgelser har allerede brugt dråbegenerering PCR-teknologi til dette formål13,14 . Denne artikel præsenterer en metode til måling af mtDNA-kopinummer og sletning heteroplasma i enkeltceller fra både humant og musevæv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

Pattedyrs mitokondrie-DNA (mt) er et lille, cirkulært, dobbeltstrenget, intra-mitokondrie-DNA-molekyle, der koder for 13 underenheder af elektrontransportkæden. I modsætning til det diploide nukleare genom indeholder de fleste celler mange flere kopier af mtDNA, der spænder fra mindre end 100 til over 200.000 kopier afhængigt af celletype. MtDNA-kopinummer bruges i stigende grad som biomarkør for en række aldersrelaterede degenerative tilstande og sygdomme, og dermed bliver nøjagtig måling af mtDNA-kopinummeret et nøgleværktøj i både forskning og diagnostiske indstillinger. Mutationer i mtDNA, der ofte forekommer som enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er) eller deletioner, kan enten eksistere i alle kopier af mtDNA i cellen (kaldet homoplasmati) eller som en blanding af muterede og WT mtDNA-kopier (kaldet heteroplasmatik). Heteroplasmatiske mtDNA-mutationer er en væsentlig årsag til klinisk mitokondriepatologi, enten i sjældne sygdomme eller i et stigende antal almindelige senfølgesygdomme som Parkinsons sygdom. Bestemmelse af niveauet af heteroplasma, der er til stede i celler, er et kritisk skridt i diagnosen af sjældne mitokondriesygdomme og i forskning, der sigter mod at forstå almindelige senindsættende lidelser, hvor mitokondrier kan spille en rolle. MtDNA-kopinummer og heteroplasmi er traditionelt blevet målt ved kvantitative (q) PCR-baserede assays eller dyb sekventering. Den nylige introduktion af ddPCR-teknologi har imidlertid givet en alternativ metode til måling af begge parametre. Det giver flere fordele i forhold til eksisterende metoder, herunder evnen til at måle absolut mtDNA-kopinummer og tilstrækkelig følsomhed til at foretage nøjagtige målinger fra enkeltceller selv ved lave kopinumre. Her præsenteres en detaljeret protokol, der beskriver målingen af mtDNA-kopinummer i enkeltceller ved hjælp af ddPCR, kaldet dråbegenerering PCR fremover, med mulighed for samtidig måling af heteroplasma i celler med mtDNA-deletioner. Muligheden for at udvide denne metode til at måle heteroplasma i celler med mtDNA SNP'er diskuteres også.

Efter dråbegenerering er et klart lag af uigennemsigtige dråber synligt, der flyder oven på oliefasen i hver brønd (figur 1B). Dråbedannelse kan påvirkes negativt af tilstedeværelsen af vaskemidler i inputlysatet, når der udføres forsøg på enkeltceller. Ved hjælp af lysisprotokollen beskrevet i punkt 2.1.2 opnås der rutinemæssigt dråbeudbytter over det anbefalede niveau på 10.000 på trods af tilstedeværelsen af en lille restmængde TWEEN-20 i den endelige prøve (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Her præsenterer vi en protokol til måling af absolut mitokondrie (mt) DNA-kopinummer og mtDNA-sletning heteroplasmaniveauer i enkeltceller.

Måling af enkeltcellet mitokondrie-DNA-kopinummer og heteroplasmi ved hjælp af digital dråbepolymerasekædereaktion

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Denne protokol kan bruges til nøjagtigt at måle antallet af kopier af mitokondrie-DNA, der er til stede i individuelle celler, og niveauet af visse typer mitokondrie-DNA-mutation. Tidligere metoder kan nøjagtigt foretage disse målinger i vævsprøver, der indeholder mange celler. Den største fordel ved denne teknik er, at vi kan foretage de samme målinger i enkeltceller.Denne metode er især nyttig for dem, der studerer mitokondrier og vil have brede anvendelser på dette område. Effektiv isolering og lysis af enkeltceller er nøglen til denne teknik. Tidligere erfaring med enkeltcellesortering ville være meget nyttig.Til at begynde med skal du forberede masterblandingen til PCR uden prøve-DNA på is, som beskrevet i teksten. Efter hvirvel kort fordeles det krævede volumen af den forberedte masterblanding til hver brønd i en dråbegenerering PCR 96-brøndplade og arrangerer prøverne i fulde kolonner. Føj derefter mastermixet til enhver tom brønd i ufuldstændige kolonner for at bruge dem som ikke-skabelonkontrolelementer.Tilføj derefter input-DNA'et til hver brønd for at gøre det samlede volumen af hver brønd 22 mikroliter. Forsegl pladen med en klæbepladeforsegling, og læg den på en ryster ved 2000 o / min i et minut. Centrifuger derefter pladen ved 1000 gange G i et minut ved fire grader Celsius, før den lægges på is.For dråbegenerering skal du først sikre dig, at dråbegeneratoren er tændt, og kontrollere, om en flaske dråbegenererende olie er indlæst til position E på instrumentdækket. Klik derefter på Konfigurer prøveplade på berøringsskærmen. Når du har valgt alle kolonner på prøvepladen, der indeholder prøverne eller emnerne, skal du klikke på Okay for at bekræfte pladekonfigurationen.Læg derefter dråbegeneratorpatronerne på position B på instrumentdækket, så alle lys bliver grønne, og placer et tomt affaldstrug i position C.Læg derefter filterspidsbokse med låg fjernet for at placere D på instrumenttrinnet, så alle lys bliver grønne. Fjern derefter klæbeforseglingen, inden prøvepladen lægges på instrumentdækkets position F, så lyset bliver grønt. Læg også en tom dråbeopsamling 96-brøndplade placeret i en kølig blok, forkølet ved minus 20 grader Celsius, ved position G, så lyset bliver grønt.Klik på Start dråbegenerering på instrumentets berøringsskærm, og dråbegeneratorlåget lukkes automatisk. Når dråbegenereringen er afsluttet, skal du kontrollere prøveopsamlingspladen visuelt for at bekræfte, at der er et dråbeemulsionslag til stede over oliefasen i hver brønd. Derefter tændes pladeforsegleren og indstiller temperaturen til 180 grader Celsius og forsegler tiden til fem sekunder.Lad maskinen nå driftstemperaturen. Placer derefter prøveopsamlingspladen på pladeholderen på pladeforsegleren, og læg en frisk folieforsegling på toppen af pladen med den røde linje opad. Når pladeforsegleren har nået sin driftstemperatur, skal du trykke på skub ud på instrumentets berøringsskærm.Når du har placeret pladeholderen i skuffen på pladeforsegleren, skal du trykke på forseglingen for at lukke skuffen. Når tætningen er afsluttet, åbnes skuffen automatisk. Fjern den forseglede plade og læg den på den kolde blok.Sluk derefter pladeforsegleren. For at køre PCR skal du placere den forseglede dråbeopsamlingsplade i en PCR-maskine med en 96 dyb brøndblok. Når PCR'en er færdig, skal du tænde for dråbelæseren og den tilsluttede computer.Læg pladen med post-PCR-prøverne i dråbelæserpladen. Mens du holder folielåget på prøvepladen, skal du placere dækslet på toppen af holderen og fastgøre det på plads med sorte låseclips. Tryk derefter på åbne/luk-knappen for at åbne dråbelæserlåget.Læg derefter dråbelæserpladeholderen med prøvepladen i læserkammeret, og placer den sikkert på magnetbasen. Tryk på åbne/luk-knappen igen for at lukke låget. Åbn analysesoftwaregrænsefladen.Vælg fanen Tilføj plade, klik på Tilføj plade og derefter Konfigurer plade. På fanen Pladeoplysninger skal du indtaste et pladenavn, vælge Supermix til Probes, Ingen DUTP i Supermix-rullemenuen og indtaste et filnavn under Gem datafil As.In fanen Valg af brønd, fremhæve de brønde, der skal analyseres, og klikke på Medtag valgte brønde. Vælg derefter de brønde, der skal kommenteres, på fanen Brøndoplysninger.Vælg Direkte kvantificering i rullemenuen Eksperimenttype. Udfyld derefter felterne eksempelbeskrivelse, eksempeltype og målnavn, og tilføj brøndnoter og/eller pladenoter efter behov. Klik derefter på Anvend.Når pladekonfigurationen er fuldført, skal du klikke på Start kørsel. For resultatanalyse skal du vælge fanen Dataanalyse og åbne den fil, der skal analyseres, i menuen Mine datafiler. Klik derefter på fanen 1D-amplitude for enkeltfarveeksperimenter eller fanen 2D-amplitude for tofarvede eksperimenter.Vælg derefter de brønde, der kræver tærskel. Brug værktøjet Tærskellinjetilstand til manuelt at anvende tærsklen i det klare rum mellem de positive og negative populationer på amplitudeplottet, hvilket sikrer, at trådkorset placeres således, at de fire dråbepopulationer er tydeligt adskilt. Når tærsklen er anvendt for alle prøver, skal du eksportere resultaterne som en csv-fil til yderligere analyse ved at klikke på fanen Datatabel, Import/eksport, og vælge Eksportér synlige data til CSV.Indtast et passende filnavn, og klik på Gem. PCR- og dråbelæsningsprocedurerne, der blev anvendt i denne protokol, viste tilstedeværelsen af klart adskilte populationer af positive og negative dråber, både i fam- og hex-kanalerne. Mitokondrie-DNA-populationer, der er positive for begge sonder, kunne også skelnes fra enkeltcellelysater.Denne metode viste også, at for prøver med deletioner i mitokondrie-DNA'et er der en blandet population af dobbeltpositive dråber og dråber, der kun er positive for den ikke-slettede del af DNA'et. Denne metode er med succes blevet brugt til at tælle mitokondrie-DNA-kopinummeret pr. celle i en række pattedyrceller, herunder museoocytter og primære museembryonale celler. Desuden viste det sig, at populationen positiv for en enkelt sonde i celler med høj deletionsheteroplasma var signifikant større end den dobbeltpositive population.I celler med heteroplasma med lav deletion var begge populationer imidlertid af samme størrelse. Så nøjagtige resultater sikrer altid, at dråbegenereringen har været vellykket, og at tærskelværdien er blevet anvendt korrekt ved hjælp af 1D- eller 2D-amplitudevisningen. Ubrugt lysat kan bruges til andre enkeltcelleassays, såsom pyrosequencing, som kan måle enkelt nukleotidpolymorfisme heteroplasma.Udviklingen af denne teknik har gjort det muligt for os at foretage nøjagtige målinger af mitokondrie-DNA-kopinummer og slette heteroplasma i individuelle celler, hvilket tidligere ikke var muligt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Måling Stigende Aorta Stivhed<em&gt; In Vivo</em&gt; I mus ved hjælp af ultralyd

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Evaluering af Stem Cell Properties i Human ovariekarcinomceller Brug Multi og enkelt celle-baserede Spheres Analyser

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: et redskab til måling<em&gt; In vivo</em&gt; Mitokondrie Oxidativ phosphorylering Kapacitet i human skeletmuskulatur

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Roman diagnostik Revision artroplastik: implantat ultralydbehandling og Multiplex Polymerase Chain Reaction

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

En blod-baseret Test til påvisning af ROS1 og RET Fusion udskrifter fra cirkulerende ribonukleinsyre ved hjælp af Digital Polymerase Chain Reaction

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

En Flow flowcytometri-baserede analyse til måling af membran potentiale i hjerte Myocytes efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimering af Neron nummer i hele nyrerne ved hjælp af Acid maceration metode

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Genotypning af enkeltnukleotidpolymorfier i mitokondriegenomet ved pyrosekventering

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Måling af membrantykkelse og funktion ved hjælp af ultralyd på plejestedet

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...