Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Merci au Dr L Bozhilova pour ses conseils sur l’analyse statistique des données de PCR de génération de gouttelettes. Merci au Dr H Zhang d’avoir fourni les ovocytes utilisés pour générer les données de la figure 3C et de la figure 4B. Ce travail a été réalisé par SPB à l’unité de biologie mitochondriale du Medical Research Council (MC_UU_00015/9) de l’Université de Cambridge et financé par une bourse de recherche principale du Wellcome Trust détenue par PFC (212219/Z/18/Z).

Toutes les expériences ont suivi les directives ARRIVE et ont été approuvées par l’organisme d’examen éthique du bien-être animal de l’Université de Cambridge (AWERB).
REMARQUE : Toutes les étapes de préparation des échantillons avant la génération de gouttelettes doivent être effectuées dans une aire de travail pré-PCR propre, idéalement dans une armoire stérilisée aux UV si possible. Le protocole décrit ici utilise un équipement de PCR spécifique de génération de...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. 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L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

Le protocole décrit ici est applicable à un large éventail de types de cellules et d’espèces en plus de ceux discutés ci-dessus, bien qu’une optimisation minutieuse des nouveaux modèles de dosage soit essentielle pour garantir que la précision et la répétabilité de la méthode sont maintenues lors de l’abandon des combinaisons amorce/sonde précédemment validées. Lorsque vous travaillez avec des cellules individuelles, il est essentiel de s’assurer que le prélèvement d’échantillons est effectué ...

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est un petit génome d’ADN circulaire (environ 16,5 Kb) résidant dans la matrice mitochondriale qui code pour 37 gènes, comprenant deux ARNr, 22 ARNt et 13 gènes codant pour des protéines1. Contrairement au génome nucléaire, qui contient une copie (haploïde) ou deux copies (diploïdes) de chaque gène par cellule, l’ADNmt est présent en plusieurs copies dans les mitochondries de chaque cellule, allant de dizaines de copies (par exemple, spermatocytes matures) à des centaines de milliers de copies (par exemple, des ovocytes)2,3. Une conséquence de cette nature multi-copie est que des mutations dans le génome de l’ADNmt, qui peuvent exister sous forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP), de délétions ou de duplications, peuvent être présentes à différents niveaux dans une cellule donnée, représentant de 0% à 100% de la population totale d’ADNmt de la cellule. L’existence de génomes d’ADNmt de type sauvage et mutant dans la même cellule est appelée hétéroplasmie, et les mutations hétéroplasmiques pathogènes de l’ADNmt sont une cause majeure de maladie mitochondriale, avec plusieurs syndromes neurologiques communs liés à des mutations hétéroplasmiques sous-jacentes de l’ADNmt4.
Deux paramètres clés qui contribuent à la probabilité qu’une mutation hétéroplasmique de l’ADNmt cause une maladie clinique sont le niveau d’hétéroplasmie et le nombre de copies d’ADNmt. De nombreuses mutations hétéroplasmiques présentent un effet de seuil, les phénotypes biochimiques et cliniques ne devenant apparents qu’au-dessus d’un certain niveau d’hétéroplasmie, généralement autour de 80%5, puis s’aggravant à mesure que l’hétéroplasmie augmente encore4. Cependant, il est également important de tenir compte du nombre de copies d’ADNmt présentes dans la cellule, car cela influencera le nombre de génomes d’ADNmt de type sauvage (c’est-à-dire « sains ») présents à un niveau d’hétéroplasmie donné. Des études chez des patients atteints de maladie mitochondriale ont mis en évidence l’importance de cette interaction entre l’hétéroplasmie et la copienuméro 5,6, et Filograna et al. ont récemment signalé une augmentation du nombre de copies d’ADNmt soulageant les symptômes malgré une hétéroplasmie inchangée dans un modèle murin de maladie mitochondriale7.
Bien que beaucoup ait été fait ces dernières années pour améliorer la compréhension de la pathogenèse et de la transmission des maladies causées par l’hétéroplasmie de l’ADNmt, la plupart de ces travaux ont été menés au niveau des tissus plutôt que des cellules, en comparant les niveaux moyens d’hétéroplasmie tissulaire et les mesures du nombre de copies acquises à partir de biopsies tissulaires en vrac et d’échantillons de sang. Certaines techniques bien établies, telles que la microdissection par capture laser, permettent de telles mesures au niveau cellulaire 8,9; Cependant, l’explosion récente des méthodes d’analyse monocellulaire à haut débit, ou appelées « omiques unicellulaires »10, a créé un besoin de méthodes capables de mesurer avec précision ces paramètres cruciaux de l’ADNmt au niveau de la cellule unique.
La méthode PCR de génération de gouttelettes tire parti des progrès récents de la technologie microfluidique pour améliorer les méthodes existantes de quantification des concentrations d’ADN inconnues par amplification par PCR d’amplicons cibles spécifiques dans l’échantillond’ADN 11. Contrairement à la qPCR, où l’ADN de l’échantillon est amplifié en une seule réaction, avec le taux relatif d’accumulation du produit PCR agissant comme lecture, cette méthode divise l’échantillon initial en milliers de gouttelettes individuelles, compartimentant ainsi les molécules d’ADN de l’échantillon en réactions spatialement séparées12. La réaction PCR suivante se déroule dans chaque gouttelette individuelle, le produit PCR ne s’accumulant que dans les gouttelettes contenant l’ADN cible. Le résultat de cette réaction est une sortie numérique sous la forme d’un pool de gouttelettes qui contiennent soit une copie de l’ADN cible et du produit PCR amplifié, soit ne contiennent pas d’ADN cible. À l’aide de sondes d’ADN fluorescentes ou d’un colorant de liaison à l’ADN double brin (ds), les gouttelettes contenant du produit amplifié peuvent être comptées et le rapport des gouttelettes « positives » et « négatives » peut être utilisé pour calculer le nombre absolu de copies d’ADN présentes dans l’échantillon initial. Cette mesure absolue, par opposition à la mesure relative acquise à partir d’une réaction qPCR, est le facteur clé qui permet d’utiliser cette méthodologie pour mesurer avec précision le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie dans des cellules individuelles11, et plusieurs études récentes ont déjà utilisé la technologie de PCR par génération de gouttelettes à cette fin13,14 . Cet article présente une méthode pour mesurer le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie de délétion dans des cellules individuelles de tissus humains et murins.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

L’ADN mitochondrial (mt) des mammifères est une petite molécule d’ADN intra-mitochondrial circulaire, double brin, codant pour 13 sous-unités de la chaîne de transport d’électrons. Contrairement au génome nucléaire diploïde, la plupart des cellules contiennent beaucoup plus de copies d’ADNmt, allant de moins de 100 à plus de 200 000 copies selon le type de cellule. Le nombre de copies d’ADNmt est de plus en plus utilisé comme biomarqueur pour un certain nombre de maladies et de maladies dégénératives liées à l’âge et, par conséquent, la mesure précise du nombre de copies d’ADNmt devient un outil clé dans les contextes de recherche et de diagnostic. Les mutations dans l’ADNmt, se produisant souvent sous forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) ou de délétions, peuvent exister dans toutes les copies de l’ADNmt dans la cellule (appelé homoplasmie) ou sous la forme d’un mélange de copies mutées et d’ADNmt WT (appelées hétéroplasmie). Les mutations hétéroplasmiques de l’ADNmt sont une cause majeure de pathologie mitochondriale clinique, que ce soit dans les maladies rares ou dans un nombre croissant de maladies courantes d’apparition tardive telles que la maladie de Parkinson. La détermination du niveau d’hétéroplasmie présente dans les cellules est une étape critique dans le diagnostic des maladies mitochondriales rares et dans la recherche visant à comprendre les troubles courants d’apparition tardive où les mitochondries peuvent jouer un rôle. Le nombre de copies d’ADNmt et l’hétéroplasmie ont traditionnellement été mesurés par des tests quantitatifs basés sur la (q)PCR ou le séquençage profond. Cependant, l’introduction récente de la technologie ddPCR a fourni une méthode alternative pour mesurer les deux paramètres. Il offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes existantes, y compris la capacité de mesurer le nombre absolu de copies d’ADNmt et une sensibilité suffisante pour effectuer des mesures précises à partir de cellules individuelles, même à un faible nombre de copies. Présenté ici est un protocole détaillé décrivant la mesure du nombre de copies d’ADNmt dans des cellules individuelles à l’aide de ddPCR, appelée PCR de génération de gouttelettes dorénavant, avec l’option de mesure simultanée de l’hétéroplasmie dans les cellules présentant des délétions d’ADNmt. La possibilité d’étendre cette méthode pour mesurer l’hétéroplasmie dans les cellules avec des SNP d’ADNmt est également discutée.

Après la génération de gouttelettes, une couche transparente de gouttelettes opaques est visible flottant au-dessus de la phase pétrolière dans chaque puits (Figure 1B). La formation de gouttelettes peut être affectée négativement par la présence de détergents dans le lysat d’entrée lors de la réalisation d’expériences sur des cellules individuelles. En utilisant le protocole de lyse décrit au point 2.1.2., des rendements en gouttelettes supérieurs au niveau recommandé de...

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Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Ce protocole peut être utilisé pour mesurer avec précision le nombre de copies d’ADN mitochondrial présentes dans les cellules individuelles et le niveau de certains types de mutation de l’ADN mitochondrial. Les méthodes précédentes peuvent effectuer avec précision ces mesures dans des échantillons de tissus contenant de nombreuses cellules. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons effectuer les mêmes mesures dans des cellules individuelles.Cette méthode est particulièrement utile pour ceux qui étudient les mitochondries et aura de nombreuses applications dans ce domaine. L’isolement et la lyse efficaces des cellules individuelles sont la clé de cette technique. Une expérience antérieure avec le tri unicellulaire serait très utile.Pour commencer, préparez le mélange principal pour la PCR sans l’échantillon d’ADN sur la glace, comme décrit dans le texte. Après avoir vortex brièvement, distribuer le volume requis du mélange maître préparé dans chaque puits d’une plaque PCR 96 puits de génération de gouttelettes, en organisant les échantillons en colonnes complètes. Ensuite, ajoutez le mélange principal à tout puits vide dans des colonnes incomplètes pour les utiliser comme contrôles sans modèle.Ajoutez ensuite l’ADN d’entrée à chaque puits pour faire le volume total de chaque puits 22 microlitres. Scellez la plaque avec un joint adhésif et placez-la sur un shaker à 2000 tr / min pendant une minute. Ensuite, centrifugez la plaque à 1000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius avant de la placer sur de la glace.Pour la génération de gouttelettes, assurez-vous d’abord que le générateur de gouttelettes est allumé et vérifiez si une bouteille d’huile génératrice de gouttelettes est chargée à la position E du pont d’instruments. Cliquez ensuite sur Configurer la plaque d’échantillonnage sur l’écran tactile. Après avoir sélectionné toutes les colonnes de la plaque d’échantillonnage contenant les échantillons ou les blancs, cliquez sur OK pour confirmer la configuration de la plaque.Ensuite, chargez les cartouches du générateur de gouttelettes à la position B sur le pont des instruments de sorte que tous les voyants deviennent verts et placez une auge à déchets vide en position C.Ensuite, chargez les boîtes d’embouts filtrantes avec les couvercles retirés à la position D sur la scène d’instruments afin que tous les voyants deviennent verts. Ensuite, retirez le joint adhésif avant de charger la plaque d’échantillon à la position F du pont d’instruments afin que le voyant passe au vert. Chargez également une plaque vide de collecte de gouttelettes à 96 puits placée dans un bloc froid, pré-refroidi à moins 20 degrés Celsius, à la position G afin que le feu passe au vert.Cliquez sur Start Droplet Generation (Démarrer la génération de gouttelettes) sur l’écran tactile de l’instrument et le couvercle du générateur de gouttelettes se fermera automatiquement. Une fois la génération de gouttelettes terminée, vérifiez visuellement la plaque de prélèvement de l’échantillon pour confirmer qu’une couche d’émulsion de gouttelettes est présente au-dessus de la phase huileuse dans chaque puits. Ensuite, allumez le scellant à plaques et réglez la température à 180 degrés Celsius et le temps de scellement à cinq secondes.Laissez la machine atteindre la température de fonctionnement. Placez ensuite la plaque de prélèvement d’échantillons sur le porte-plaque du scellant à plaques et placez un nouveau joint en aluminium sur le dessus de la plaque avec la ligne rouge tournée vers le haut. Lorsque le scellant à plaques a atteint sa température de fonctionnement, appuyez sur l’option Éjecter sur l’écran tactile de l’instrument.Après avoir placé le porte-plaque dans le tiroir du scellant à plaques, appuyez sur le sceau pour fermer le tiroir. Une fois le scellage terminé, le tiroir s’ouvrira automatiquement. Retirez la plaque scellée et placez-la sur le bloc froid.Éteignez ensuite le scellant à plaques. Pour exécuter la PCR, placez la plaque de collecte de gouttelettes scellée dans une machine de PCR avec un bloc de puits profond 96. Une fois la PCR terminée, mettez sous tension le lecteur de gouttelettes et l’ordinateur connecté.Chargez la plaque avec les échantillons post-PCR dans le support de plaque du lecteur de gouttelettes. Tout en gardant le couvercle en aluminium sur la plaque d’échantillonnage, placez le couvercle sur le dessus du support et fixez-le en place avec des clips de verrouillage noirs. Ensuite, pour ouvrir le couvercle du lecteur de gouttelettes, appuyez sur le bouton d’ouverture/fermeture.Ensuite, chargez le porte-plaque de lecteur de gouttelettes avec la plaque d’échantillon dans la chambre de lecture et placez-le solidement sur la base magnétique. Appuyez à nouveau sur le bouton d’ouverture/fermeture pour fermer le couvercle. Ouvrez l’interface du logiciel d’analyse.Sélectionnez l’onglet Ajouter une plaque, cliquez sur Ajouter une plaque, puis sur Configurer une plaque. Dans l’onglet Informations sur la plaque, entrez un nom de plaque, sélectionnez Supermix for Probes, No DUTP dans le menu déroulant Supermix (Supermix) et entrez un nom de fichier sous Save Data File As.In l’onglet Well Selection (Sélection des puits), mettez en surbrillance les puits à analyser et cliquez sur Include Selected Wells (Inclure les puits sélectionnés). Ensuite, dans l’onglet Informations sur le puits, sélectionnez les puits à annoter.Sélectionnez Quantification directe dans le menu déroulant Type d’expérience. Remplissez ensuite les zones de description de l’échantillon, de type d’échantillon et de nom de cible, puis ajoutez des notes de puits et/ou des notes de plaque si nécessaire. Cliquez ensuite sur Appliquer.Une fois la configuration de la plaque terminée, cliquez sur Démarrer l’exécution. Pour l’analyse des résultats, sélectionnez l’onglet Analyse des données et ouvrez le fichier à analyser dans le menu Mes fichiers de données. Cliquez ensuite sur l’onglet Amplitude 1D pour les expériences monocolores ou sur l’onglet Amplitude 2D pour les expériences bicolores.Ensuite, sélectionnez les puits qui nécessitent un seuillage. Utilisez l’outil Mode ligne de seuil pour appliquer manuellement le seuil dans l’espace libre entre les populations positives et négatives sur le diagramme d’amplitude, en veillant à ce que le réticule soit placé de manière à ce que les quatre populations de gouttelettes soient clairement séparées. Une fois le seuil appliqué à tous les échantillons, exportez les résultats sous forme de fichier csv pour une analyse plus approfondie en cliquant sur l’onglet Tableau de données, Importer/Exporter, puis en sélectionnant Exporter les données visibles au format CSV.Entrez un nom de fichier approprié et cliquez sur Enregistrer. Les procédures de PCR et de lecture des gouttelettes utilisées dans ce protocole ont démontré la présence de populations clairement séparées de gouttelettes positives et négatives, à la fois dans les canaux fam et hexadécimal. Les populations d’ADN mitochondrial positives pour les deux sondes ont également pu être distinguées des lysats unicellulaires.Cette méthode a également montré que pour les échantillons avec des délétions dans l’ADN mitochondrial, une population mixte de gouttelettes doublement positives et de gouttelettes positives pour la partie non supprimée de l’ADN est présente. Cette méthode a été utilisée avec succès pour compter le nombre de copies d’ADN mitochondrial par cellule dans une variété de cellules de mammifères, y compris les ovocytes de souris et les cellules embryonnaires primaires de souris. De plus, dans les cellules présentant une hétéroplasie à délétion élevée, la population positive pour une seule sonde s’est avérée significativement plus grande que la population doublement positive.Cependant, dans les cellules à faible hétéroplasmie, les deux populations étaient de taille similaire. Ainsi, des résultats précis garantissent toujours que la génération de gouttelettes a été réussie et que le seuillage a été appliqué de manière appropriée à l’aide de la vue d’amplitude 1D ou 2D. Le lysat inutilisé peut être utilisé pour d’autres tests unicellulaires, tels que le pyroséquençage, qui peut mesurer l’hétéroplasie du polymorphisme mononucléotidique.Le développement de cette technique nous a permis de faire des mesures précises du nombre de copies d’ADN mitochondrial et de l’hétéroplasmie de délétion dans des cellules individuelles, ce qui n’était pas possible auparavant.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

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Mesure aortique ascendant Rigidité<em&gt; In Vivo</em&gt; Chez la souris en utilisant des ultrasons

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Recherche

Médecine

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Evaluation des propriétés de cellules souches en cellules humaines de l&#39;ovaire Carcinome utilisant MULTI et simples à base de cellules Sphères dosages

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphore-31 Spectroscopie par résonance magnétique: un outil de mesure<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacité mitochondrial phosphorylation oxydative dans le muscle squelettique humain

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Nouveaux Diagnostics dans l’arthroplastie de révision : l’Implant Sonication et PCR Multiplex

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Un sang à base d’essai pour la détection des ROS1 et RET transcrits de Fusion de circuler l’acide ribonucléique Using Digital Polymerase Chain Reaction

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimation du nombre de néphron dans le rein entier à l’aide de la méthode de macération acide

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Génotypage de polymorphismes mononucléotidiques dans le génome mitochondrial par pyroséquençage

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Mesure de l’épaisseur et de la fonction du diaphragme à l’aide d’ultrasons au point d’intervention

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...

Enhancing Stroke Rehabilitation with Virtual Reality-Based Occupational Training

Cognitive Function and Upper Limb Rehabilitation Training Post-Stroke Using a Digital Occupational Training System

Author Spotlight: Rehabilitation of Stroke Patients With a Digital Occupational Training System

Entraînement de la fonction cognitive et de la rééducation des membres supérieurs après un AVC à l’aide d’un système numérique d’entraînement professionnel