Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
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Vielen Dank an Dr. L Bozhilova für die Beratung zur statistischen Analyse von PCR-Daten zur Tröpfchenerzeugung. Vielen Dank an Dr. H Zhang für die Bereitstellung der Eizellen, die zur Generierung von Daten in Abbildung 3C und Abbildung 4B verwendet wurden. Diese Arbeit wurde von SPB an der Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9) der University of Cambridge durchgeführt und durch ein Wellcome Trust Principal Research Fellowship von PFC (212219 / Z / 18 / Z) finanziert.

Alle Experimente folgten den ARRIVE-Richtlinien und wurden vom University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB) genehmigt.
HINWEIS: Alle Probenvorbereitungsschritte vor der Tröpfchenerzeugung müssen in einem sauberen Pre-PCR-Arbeitsbereich durchgeführt werden, idealerweise nach Möglichkeit in einem UV-sterilisierten Schrank. Das hier beschriebene Protokoll verwendet spezifische PCR-Geräte zur Tröpfchenerzeugung (siehe Materialtabelle), und obwohl die al...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. 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L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. 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Das hier beschriebene Protokoll ist zusätzlich zu den oben beschriebenen auf eine Vielzahl von Zelltypen und -spezies anwendbar, obwohl eine sorgfältige Optimierung neuer Assay-Designs von entscheidender Bedeutung sein wird, um sicherzustellen, dass Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Methode erhalten bleiben, wenn man sich von zuvor validierten Primer/Sonden-Kombinationen entfernt. Bei der Arbeit mit Einzelzellen ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Probenentnahme so genau wie möglich durchgeführt wird (z. B. ...

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines (ca. 16,5 Kb), zirkuläres DNA-Genom, das sich in der mitochondrialen Matrix befindet und 37 Gene kodiert, bestehend aus zwei rRNAs, 22 tRNAs und 13 proteinkodierendenGenen 1. Im Gegensatz zum Kerngenom, das eine (haploide) oder zwei (diploide) Kopien jedes Gens pro Zelle enthält, ist mtDNA in mehreren Kopien in den Mitochondrien jeder Zelle vorhanden, die von Dutzenden von Kopien (z. B. reife Spermatozyten) bis zu Hunderttausenden von Kopien (z. B. Eizellen) reichen2,3. Eine Folge dieser Multi-Copy-Natur ist, dass Mutationen im mtDNA-Genom, die als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), Deletionen oder Duplikationen existieren können, in einer bestimmten Zelle auf unterschiedlichen Ebenen vorhanden sein können und zwischen 0% und 100% der gesamten mtDNA-Population der Zelle ausmachen. Die Existenz von Wildtyp- und mutierten mtDNA-Genomen in derselben Zelle wird als Heteroplasmie bezeichnet, und pathogene heteroplasmatische mtDNA-Mutationen sind eine Hauptursache für mitochondriale Erkrankungen, wobei mehrere häufige neurologische Syndrome mit zugrunde liegenden heteroplasmatischen mtDNA-Mutationen verbunden sind4.
Zwei Schlüsselparameter, die zur Wahrscheinlichkeit beitragen, dass eine heteroplasmatische mtDNA-Mutation eine klinische Erkrankung verursacht, sind die Heteroplasmieebene und die mtDNA-Kopienzahl. Viele heteroplasmatische Mutationen zeigen einen Schwelleneffekt, wobei biochemische und klinische Phänotypen erst oberhalb eines bestimmten Heteroplasmaspiegels, typischerweise um 80%5, sichtbar werden und sich anschließend mit zunehmender Heteroplasmie verschlechtern4. Es ist jedoch auch wichtig, die Anzahl der in der Zelle vorhandenen Kopien von mtDNA zu berücksichtigen, da dies die Anzahl der Wildtyp-mtDNA-Genome beeinflusst, die auf einem bestimmten heteroplasmatischen Niveau vorhanden sind. Studien an Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen haben die Bedeutung dieses Zusammenspiels zwischen Heteroplasmie und Kopienzahl5,6 hervorgehoben, und Filograna et al. berichteten kürzlich über einen Anstieg der mtDNA-Kopienzahl, der die Symptome trotz unveränderter Heteroplasmie in einem Mausmodell der mitochondrialen Erkrankung lindert7.
Während in den letzten Jahren viel getan wurde, um das Verständnis der Pathogenese und Übertragung von Krankheiten, die durch mtDNA-Heteroplasmie verursacht werden, zu verbessern, wurden die meisten dieser Arbeiten auf der Ebene von Geweben und nicht auf der Ebene von Zellen durchgeführt, wobei mittlere Gewebeheteroplasmiespiegel und Kopienzahlmessungen aus Massengewebebiopsien und Blutproben verglichen wurden. Einige etablierte Techniken, wie die Laser-Capture-Mikrodissektion, ermöglichen solche Messungen auf zellulärer Ebene 8,9; Die jüngste Explosion von Hochdurchsatz-Einzelzellanalysemethoden oder sogenannten "Single-cell Omics"10 hat jedoch einen Bedarf an Methoden geschaffen, die diese entscheidenden mtDNA-Parameter auf Einzelzellebene genau messen können.
Die Tröpfchenerzeugungs-PCR-Methode nutzt die jüngsten Fortschritte in der mikrofluidischen Technologie, um bestehende Methoden zur Quantifizierung unbekannter DNA-Konzentrationen durch PCR-Amplifikation spezifischer Zielamplicons in der Proben-DNAzu verbessern 11. Im Gegensatz zur qPCR, bei der die Proben-DNA in einer einzigen Reaktion amplifiziert wird, wobei die relative Akkumulationsrate des PCR-Produkts als Auslesung dient, teilt diese Methode die ursprüngliche Probe in Tausende von einzelnen Tröpfchen auf, wodurch die DNA-Moleküle der Probe in räumlich getrennte Reaktionen unterteiltwerden 12. Die anschließende PCR-Reaktion läuft in jedem einzelnen Tröpfchen ab, wobei sich das PCR-Produkt nur in Tröpfchen anreichert, die die Ziel-DNA enthalten. Das Ergebnis dieser Reaktion ist ein digitaler Ausgang in Form eines Pools von Tröpfchen, die entweder eine Kopie der Ziel-DNA und des amplifizierten PCR-Produkts enthalten oder keine Ziel-DNA enthalten. Mit fluoreszierenden DNA-Sonden oder einem doppelsträngigen (ds) DNA-bindenden Farbstoff können die Tröpfchen, die ein amplifiziertes Produkt enthalten, gezählt werden, und das Verhältnis von "positiven" zu "negativen" Tröpfchen kann verwendet werden, um die absolute Anzahl der DNA-Kopien zu berechnen, die in der ursprünglichen Probe vorhanden waren. Diese absolute Messung ist im Gegensatz zu der relativen Messung, die aus einer qPCR-Reaktion gewonnen wird, der Schlüsselfaktor, der es ermöglicht, diese Methodik für die genaue Messung der mtDNA-Kopienzahl und der Heteroplasmie in Einzelzellen zu verwenden11, und mehrere neuere Studien haben bereits die PCR-Technologie zur Tröpfchenerzeugung für diesen Zweck verwendet13,14 . Dieser Artikel stellt eine Methode zur Messung der mtDNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen aus menschlichem und Mausgewebe vor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

Die mitochondriale (mt)DNA von Säugetieren ist ein kleines, zirkuläres, doppelsträngiges, intramitochondriales DNA-Molekül, das 13 Untereinheiten der Elektronentransportkette kodiert. Im Gegensatz zum diploiden Kerngenom enthalten die meisten Zellen viel mehr Kopien der mtDNA, die je nach Zelltyp von weniger als 100 bis über 200.000 Kopien reichen. Die MtDNA-Kopienzahl wird zunehmend als Biomarker für eine Reihe von altersbedingten degenerativen Erkrankungen und Krankheiten verwendet, und daher wird die genaue Messung der mtDNA-Kopienzahl zu einem Schlüsselinstrument sowohl in der Forschung als auch in der Diagnose. Mutationen in der mtDNA, die oft als Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Deletionen auftreten, können entweder in allen Kopien der mtDNA innerhalb der Zelle (Homoplasmie genannt) oder als Mischung aus mutierten und WT-mtDNA-Kopien (Heteroplasmie genannt) existieren. Heteroplasmatische mtDNA-Mutationen sind eine Hauptursache für klinische mitochondriale Pathologie, entweder bei seltenen Krankheiten oder bei einer wachsenden Anzahl von häufigen spät einsetzenden Krankheiten wie der Parkinson-Krankheit. Die Bestimmung des Grades der Heteroplasmie in Zellen ist ein kritischer Schritt bei der Diagnose seltener mitochondrialer Erkrankungen und in der Forschung, die darauf abzielt, häufige spät einsetzende Störungen zu verstehen, bei denen Mitochondrien eine Rolle spielen können. MtDNA-Kopienzahl und Heteroplasmie wurden traditionell durch quantitative (q)PCR-basierte Assays oder Tiefensequenzierung gemessen. Die jüngste Einführung der ddPCR-Technologie hat jedoch eine alternative Methode zur Messung beider Parameter bereitgestellt. Es bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Methoden, einschließlich der Möglichkeit, die absolute mtDNA-Kopienzahl zu messen, und einer ausreichenden Empfindlichkeit, um auch bei niedrigen Kopienzahlen genaue Messungen von einzelnen Zellen durchzuführen. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Messung der mtDNA-Kopienzahl in einzelnen Zellen mittels ddPCR beschreibt, im Folgenden als Tröpfchenerzeugungs-PCR bezeichnet, mit der Option zur gleichzeitigen Messung der Heteroplasmie in Zellen mit mtDNA-Deletionen. Die Möglichkeit, diese Methode zur Messung von Heteroplasmen in Zellen mit mtDNA-SNPs zu erweitern, wird ebenfalls diskutiert.

Nach der Tröpfchenerzeugung ist eine klare Schicht undurchsichtiger Tröpfchen sichtbar, die auf der Ölphase in jedem Bohrloch schwimmt (Abbildung 1B). Die Tröpfchenbildung kann durch das Vorhandensein von Detergenzien im Eingangslysat bei Experimenten an einzelnen Zellen beeinträchtigt werden. Unter Verwendung des in Abschnitt 2.1.2 beschriebenen Lyseprotokolls werden trotz des Vorhandenseins einer geringen Restmenge von TWEEN-20 in der Endprobe routinemäßig Tröpfchenausbeuten über ...

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Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Anzahl der Kopien der mitochondrialen DNA in einzelnen Zellen und das Niveau bestimmter Arten von mitochondrialen DNA-Mutationen genau zu messen. Bisherige Methoden können diese Messungen in Gewebeproben, die viele Zellen enthalten, genau durchführen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir die gleichen Messungen in einzelnen Zellen durchführen können.Diese Methode ist besonders nützlich für diejenigen, die Mitochondrien studieren und wird breite Anwendungen in diesem Bereich haben. Die effektive Isolierung und Lyse einzelner Zellen ist der Schlüssel zu dieser Technik. Vorherige Erfahrungen mit der Einzelzellsortierung wären sehr hilfreich.Um zu beginnen, bereiten Sie den Mastermix für die PCR ohne die Proben-DNA auf Eis vor, wie im Text beschrieben. Nach dem kurzen Durchtexen verteilen Sie das erforderliche Volumen der vorbereiteten Mastermischung auf jede Vertiefung einer PCR 96-Well-Platte zur Tröpfchenerzeugung und ordnen die Proben in vollen Spalten an. Fügen Sie als Nächstes die Mastermischung jedem leeren Feld in unvollständigen Spalten hinzu, um sie als Nicht-Vorlagensteuerelemente zu verwenden.Fügen Sie dann die Eingangs-DNA zu jeder Vertiefung hinzu, um das Gesamtvolumen jedes Bohrlochs auf 22 Mikroliter zu erhöhen. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebeplattendichtung und legen Sie sie eine Minute lang bei 2000 U/min auf einen Shaker. Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 1000 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius, bevor Sie sie auf Eis legen.Stellen Sie bei der Tröpfchenerzeugung zunächst sicher, dass der Tröpfchengenerator eingeschaltet ist, und prüfen Sie, ob eine Flasche tröpfchenerzeugendes Öl an Position E des Instrumentendecks geladen ist. Klicken Sie dann auf dem Touchscreen auf Configure Sample Plate. Nachdem Sie alle Spalten auf der Probenplatte mit den Proben oder Leerproben ausgewählt haben, klicken Sie auf OK, um die Plattenkonfiguration zu bestätigen.Als nächstes laden Sie die Tröpfchengeneratorpatronen auf Position B auf dem Instrumentendeck, so dass alle Lichter grün werden, und legen Sie einen leeren Kippmülltrog in Position C.Laden Sie dann Filterspitzenboxen mit entfernten Deckeln auf Position D auf dem Instrumententisch, so dass alle Lichter grün werden. Als nächstes entfernen Sie die Klebedichtung, bevor Sie die Probenplatte an Position F des Instrumentendecks laden, so dass das Licht grün wird. Laden Sie auch eine leere 96-Well-Platte, die in einen kühlen Block gelegt wird, der bei minus 20 Grad Celsius an Position G vorgekühlt ist, so dass das Licht grün wird.Klicken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Tröpfchengenerierung starten, und der Deckel des Tröpfchengenerators schließt sich automatisch. Sobald die Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Probenentnahmeplatte visuell, um zu bestätigen, dass in jedem Bohrloch eine Tröpfchenemulsionsschicht über der Ölphase vorhanden ist. Als nächstes schalten Sie die Plattenversiegelung ein und stellen die Temperatur auf 180 Grad Celsius und die Versiegelungszeit auf fünf Sekunden ein.Lassen Sie die Maschine die Betriebstemperatur erreichen. Legen Sie dann die Probenentnahmeplatte auf den Plattenhalter des Plattenversiegelers und legen Sie eine frische Foliendichtung mit der roten Linie nach oben auf die Platte. Wenn die Plattenversiegelung ihre Betriebstemperatur erreicht hat, drücken Sie auf dem Touchscreen des Instruments auf Auswurf.Nachdem Sie den Plattenhalter in die Schublade der Plattenversiegelung gelegt haben, drücken Sie das Siegel, um die Schublade zu schließen. Sobald die Versiegelung abgeschlossen ist, öffnet sich die Schublade automatisch. Entfernen Sie die versiegelte Platte und legen Sie sie auf den kalten Block.Schalten Sie dann die Plattenversiegelung aus. Um die PCR auszuführen, legen Sie die versiegelte Tröpfchensammelplatte in ein PCR-Gerät mit einem 96-Tiefbrunnenblock. Schalten Sie nach Abschluss der PCR den Tröpfchenleser und den angeschlossenen Computer ein.Laden Sie die Platte mit den Post-PCR-Proben in den Plattenhalter des Tröpfchenlesers. Während Sie den Foliendeckel auf der Probenplatte halten, legen Sie die Abdeckung auf die Oberseite der Halterung und sichern Sie sie mit schwarzen Verriegelungsclips. Um den Deckel des Tröpfchenlesers zu öffnen, drücken Sie anschließend die Öffnungs-/Schließtaste.Laden Sie dann den Tröpfchen-Reader-Plattenhalter mit der Probenplatte in die Lesekammer und legen Sie ihn sicher auf den Magnetfuß. Drücken Sie erneut die Öffnungs-/Schließtaste, um den Deckel zu schließen. Öffnen Sie die Schnittstelle der Analysesoftware.Wählen Sie die Registerkarte Platte hinzufügen aus, klicken Sie auf Platte hinzufügen, und klicken Sie dann auf Platte konfigurieren. Geben Sie auf der Registerkarte Platteninformationen einen Plattennamen ein, wählen Sie Supermix für Sonden, Kein DUTP aus dem Dropdown-Menü Supermix aus, und geben Sie einen Dateinamen unter Datendatei speichern As.In der Registerkarte Bohrlochauswahl ein, markieren Sie die zu analysierenden Vertiefungen und klicken Sie auf Ausgewählte Vertiefungen einschließen. Wählen Sie dann auf der Registerkarte Bohrlochinformationen die Bohrlöcher aus, die mit Anmerkungen versehen werden sollen.Wählen Sie im Dropdown-Menü Experimenttyp die Option Direkte Quantifizierung aus. Füllen Sie dann die Felder Probenbeschreibung, Probentyp und Zielname aus, und fügen Sie bei Bedarf Bohrlochnotizen und/oder Plattennotizen hinzu. Klicken Sie dann auf Übernehmen.Sobald die Plattenkonfiguration abgeschlossen ist, klicken Sie auf Start Run. Wählen Sie für die Ergebnisanalyse die Registerkarte Datenanalyse und öffnen Sie die zu analysierende Datei im Menü Meine Datendateien. Klicken Sie dann auf die Registerkarte 1D-Amplitude für einfarbige Experimente oder die Registerkarte 2D-Amplitude für zweifarbige Experimente.Wählen Sie als Nächstes die Vertiefungen aus, für die ein Schwellenwert erforderlich ist. Verwenden Sie das Werkzeug Schwellenwertlinienmodus, um den Schwellenwert manuell in den freien Raum zwischen den positiven und negativen Grundgesamtheiten im Amplitudendiagramm anzuwenden, und stellen Sie sicher, dass das Fadenkreuz so platziert wird, dass die vier Tröpfchenpopulationen deutlich voneinander getrennt sind. Sobald der Schwellenwert für alle Proben angewendet wurde, exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren Analyse als CSV-Datei, indem Sie auf die Registerkarte Datentabelle, Importieren/Exportieren, klicken und Sichtbare Daten in CSV exportieren auswählen.Geben Sie einen geeigneten Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Die in diesem Protokoll verwendeten PCR- und Tröpfchenleseverfahren zeigten das Vorhandensein klar getrennter Populationen positiver und negativer Tröpfchen, sowohl im Fam- als auch im Hex-Kanal. Mitochondriale DNA-Populationen, die für beide Sonden positiv waren, konnten auch von Einzelzelllysaten unterschieden werden.Diese Methode zeigte auch, dass für Proben mit Deletionen in der mitochondrialen DNA eine gemischte Population von doppelt positiven Tröpfchen und Tröpfchen vorhanden ist, die nur für den nicht gelöschten Teil der DNA positiv sind. Diese Methode wurde erfolgreich verwendet, um die mitochondriale DNA-Kopienzahl pro Zelle in einer Vielzahl von Säugetierzellen, einschließlich Mauseizellen und primären embryonalen Zellen der Maus, zu zählen. Darüber hinaus wurde in Zellen mit hoher Deletionsheteroplasmie festgestellt, dass die Population, die für eine einzelne Sonde positiv war, signifikant größer war als die doppelt positive Population.In Zellen mit Heteroplasmatik mit niedriger Deletion waren beide Populationen jedoch von ähnlicher Größe. Daher stellen genaue Ergebnisse immer sicher, dass die Tröpfchenerzeugung erfolgreich war und dass der Schwellenwert mithilfe der 1D- oder 2D-Amplitudenansicht entsprechend angewendet wurde. Unverwendetes Lysat kann für andere Einzelzellassays wie Pyrosequenzierung verwendet werden, die Einzelnukleotid-Polymorphismus-Heteroplasmen messen können.Die Entwicklung dieser Technik hat es uns ermöglicht, genaue Messungen der mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen durchzuführen, was bisher nicht möglich war.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Mess aufsteigende Aorta Steifigkeit<em&gt; In-vivo-</em&gt; In Mäuse Mit Ultraschall

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Forschung

Medizin

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Neuartige Diagnostik in der Revision Endoprothetik: Implantat-Beschallung und Multiplex Polymerase-Kettenreaktion

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Schätzung der Nephron-Zahl in Ganznierstein mit der Acid-Maeration-Methode

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Messung der Membrandicke und -funktion mittels Point-of-Care-Ultraschall

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...