Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
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液滴生成PCRデータの統計解析に関するアドバイスをくださったL Bozhilova博士に感謝します。図 3C および 図4Bのデータを生成するために使用される卵母細胞を提供してくれたH.Zhang博士に感謝します。この研究は、ケンブリッジ大学の医学研究評議会ミトコンドリア生物学ユニット(MC_UU_00015/9)のSPBによって実施され、PFCが保有するウェルカムトラストプリンシパルリサーチフェローシップ(212219 / Z / 18 / Z)によって資金提供されました。

すべての実験はARRIVEガイドラインに従い、ケンブリッジ大学動物福祉倫理審査機関(AWERB)によって承認されました。
注:液滴生成前のすべてのサンプル調製ステップは、清潔なプレPCR作業エリア、理想的には可能な限りUV滅菌キャビネットで実行する必要があります。ここで説明するプロトコルは、特定の液滴生成PCR装置( 材料の表を参照)を使用しており、一?...

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	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription,+mass+and+respiratory+activity.">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. 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Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li><li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution.">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li><li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control.">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li><li>Krishnan, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression.">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li><li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases.">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、上記以外にも幅広い細胞タイプおよび種に適用できますが、以前に検証されたプライマー/プローブの組み合わせから離れる際にメソッドの精度と再現性を維持するには、新しいアッセイデザインの慎重な最適化が重要です。単一細胞を扱う場合、得られた結果が個々の細胞の結果を真に反映していることを確認するために、サンプル収集が可能な限り正確に実...

哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、ミトコンドリアマトリックスに存在する小さな(約16.5 Kb)環状DNAゲノムであり、2つのrRNA、22のtRNA、および13のタンパク質コード遺伝子で構成される37の遺伝子をコードしています1。細胞ごとに各遺伝子のコピーが1つ(一倍体)または2つ(二倍体)含まれる核ゲノムとは異なり、mtDNAは各細胞のミトコンドリアに複数のコピーとして存在し、数十コピー(成熟精母細胞など)から数十万コピー(卵母細胞など)の範囲で存在します2,3。このマルチコピーの性質の結果、一塩基多型(SNP)、欠失、または重複として存在する可能性のあるmtDNAゲノムの変異が、任意の細胞にさまざまなレベルで存在し、細胞の総mtDNA集団の0%から100%を占める可能性があります。同じ細胞内に野生型および変異型mtDNAゲノムが存在することはヘテロプラスミーと呼ばれ、病原性ヘテロプラズマmtDNA変異はミトコンドリア病の主な原因であり、いくつかの一般的な神経学的症候群が根底にあるヘテロプラスミックmtDNA変異に関連しています4。
ヘテロプラズマmtDNA変異が臨床疾患を引き起こす可能性に寄与する2つの重要なパラメータは、ヘテロプラスミーレベルとmtDNAコピー数です。多くのヘテロプラスミック変異は閾値効果を示し、生化学的および臨床的表現型は特定のヘテロプラスミーレベル(通常は約80%5)を超えてのみ明らかになり、その後、ヘテロプラスミーがさらに増加するにつれて悪化します4。ただし、細胞内に存在するmtDNAのコピー数は、特定のヘテロプラスミーレベルで存在する野生型(つまり「正常」)mtDNAゲノムの数に影響を与えるため、考慮することも重要です。ミトコンドリア病患者を対象とした研究では、ヘテロプラスミーとコピー数5,6の間のこの相互作用の重要性が強調されており、Filogranaらは最近、ミトコンドリア病のマウスモデルで異形質変化にもかかわらず症状を緩和するmtDNAコピー数の増加を報告しました7。
近年、mtDNAヘテロプラスミーによって引き起こされる疾患の病因と伝染の理解を深めるために多くのことが行われていますが、この研究のほとんどは細胞ではなく組織のレベルで行われており、バルク組織生検と血液サンプルから得られた平均組織ヘテロプラスミーレベルとコピー数測定値を比較しています。レーザーキャプチャマイクロダイセクションなどのいくつかの確立された技術は、細胞レベルでのそのような測定を可能にします8,9;しかし、近年のハイスループットシングルセル解析法、いわゆる「シングルセルオミクス」10の爆発的な増加により、これらの重要なmtDNAパラメータをシングルセルレベルで正確に測定できる方法が求められています。
液滴生成PCR法は、マイクロ流体技術の最近の進歩を利用して、サンプルDNA中の特異的標的アンプリコンのPCR増幅を介して未知のDNA濃度を定量する既存の方法を改良する11。サンプルDNAが単一の反応で増幅され、PCR産物の相対蓄積速度が読み出しとして機能するqPCRとは異なり、この方法は最初のサンプルを数千の個々の液滴に分割し、サンプルDNA分子を空間的に分離した反応に区画化します12。その後のPCR反応は個々の液滴で進行し、PCR産物は標的DNAを含む液滴にのみ蓄積します。この反応の結果は、標的DNAおよび増幅PCR産物のコピーを含むか、または標的DNAを含まない液滴のプールの形でデジタル出力される。蛍光DNAプローブまたは二本鎖(ds)DNA結合色素を使用して、増幅産物を含む液滴をカウントし、「陽性」液滴と「陰性」液滴の比率を使用して、初期サンプルに存在したDNAコピーの絶対数を計算できます。qPCR反応から得られる相対的な測定値とは対照的に、この絶対測定は、この方法論を単一細胞のmtDNAコピー数とヘテロプラスミーの正確な測定に使用できる重要な要素であり11、最近のいくつかの研究はすでにこの目的のために液滴生成PCR技術を利用しています13,14.この記事では、ヒトとマウスの両方の組織からの単一細胞におけるmtDNAコピー数と欠失ヘテロプラスミーを測定する方法を紹介します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

哺乳類のミトコンドリア(mt)DNAは、電子伝達鎖の13サブユニットをコードする、小さな環状の二本鎖ミトコンドリア内DNA分子です。二倍体核ゲノムとは異なり、ほとんどの細胞にはmtDNAのコピーが多く含まれており、細胞の種類に応じて100コピー未満から200,000コピーを超える範囲です。MtDNAコピー数は、多くの加齢に伴う変性状態や疾患のバイオマーカーとしてますます使用されているため、mtDNAコピー数の正確な測定は、研究と診断の両方の設定において重要なツールになりつつあります。mtDNAの変異は、一塩基多型(SNP)または欠失として発生することが多く、細胞内のmtDNAのすべてのコピーに存在するか(ホモプラスミーと呼ばれる)、変異したmtDNAコピーとWTmtDNAコピーの混合物として存在する可能性があります(ヘテロプラスミーと呼ばれます)。ヘテロプラズマmtDNA変異は、希少疾患またはパーキンソン病などの一般的な遅発性疾患の増加のいずれかにおいて、臨床ミトコンドリア病理の主な原因です。細胞内に存在するヘテロプラスミーのレベルを決定することは、まれなミトコンドリア病の診断およびミトコンドリアが役割を果たす可能性のある一般的な遅発性疾患を理解することを目的とした研究において重要なステップです。MtDNAコピー数とヘテロプラスミーは、従来、定量的(q)PCRベースのアッセイまたはディープシーケンシングによって測定されてきました。しかし、ddPCR技術の最近の導入は、両方のパラメータを測定するための代替方法を提供しました。絶対mtDNAコピー数を測定する能力や、低いコピー数でも単一細胞から正確な測定を行うのに十分な感度など、既存の方法に比べていくつかの利点があります。ここでは、ddPCRを使用した単一細胞のmtDNAコピー数の測定を説明する詳細なプロトコル(以下、液滴生成PCRと呼びます)と、mtDNA欠失のある細胞のヘテロプラスミーを同時に測定するオプションを紹介します。mtDNA SNPを有する細胞のヘテロプラスミーを測定するためにこの方法を拡張する可能性についても議論されています。

液滴の生成後、各ウェルの油相の上に透明な液滴の透明な層が浮かんでいるのが見えます(図1B)。液滴形成は、単一細胞で実験を行う際の投入ライセート中の界面活性剤の存在によって悪影響を受ける可能性があります。2.1.2.に記載されている溶解プロトコルを使用すると、最終サンプルに少量のTWEEN-20が残っているにもかかわらず、推奨レベルの10,000を超える液滴収率?...

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Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

ここでは、単一細胞における絶対ミトコンドリア(mt)DNAコピー数とmtDNA欠失ヘテロプラスミーレベルを測定するためのプロトコルを紹介します。

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

このプロトコルは、個々の細胞に存在するミトコンドリアDNAのコピー数と特定のタイプのミトコンドリアDNA変異のレベルを正確に測定するために使用できます。以前の方法では、多くの細胞を含む組織サンプルでこれらの測定を正確に行うことができました。この手法の主な利点は、単一セルで同じ測定を行うことができることです。この方法は、ミトコンドリアを研究する人に特に有用であり、この分野で幅広い用途があります。単一細胞の効果的な単離と溶解は、この技術の鍵です。シングルセルソーティングの経験は非常に役立ちます。まず、本文に記載されているように、氷上でサンプルDNAを使用せずにPCR用のマスターミックスを準備します。短時間ボルテックスした後、調製したマスターミックスの必要量を液滴生成PCR96ウェルプレートの各ウェルに分配し、サンプルをフルカラムに配置する。次に、マスターミックスを不完全な列の空のウェルに追加して、テンプレート以外のコントロールとして使用します。次に、入力DNAを各ウェルに追加して、各ウェルの総容量を22マイクロリットルにします。プレートを粘着プレートシールで密封し、2000RPMで1分間シェーカーに置きます。次に、プレートを摂氏4度で1分間1000倍Gで遠心分離してから、氷上に置きます。液滴を生成するには、まず液滴発生器の電源がオンになっていることを確認し、液滴発生オイルのボトルが計器デッキの位置Eにロードされているかどうかを確認します。次に、タッチスクリーンの[サンプルプレートの構成]をクリックします。サンプルまたはブランクを含むサンプルプレートのすべての列を選択したら、[OK]をクリックしてプレートの構成を確認します。次に、液滴発生器カートリッジを計器デッキのBの位置Bにロードして、すべてのライトが緑色に変わるようにし、空のチップ廃棄物トラフを位置Cに配置します。次に、サンプルプレートを計器デッキの位置Fにロードする前に粘着シールを取り外して、ライトが緑色に変わるようにします。また、空の液滴コレクション96ウェルプレートを、摂氏マイナス20度で予め冷却された位置Gのクールブロックに入れ、ライトが緑色に変わるようにロードします。機器のタッチスクリーンで[液滴生成の開始]をクリックすると、液滴発生器の蓋が自動的に閉じます。液滴の生成が完了したら、サンプル収集プレートを目視で確認して、液滴エマルジョン層が各ウェルの油相の上に存在することを確認します。次に、プレートシーラーの電源を入れ、温度を摂氏180度に設定し、シール時間を5秒に設定します。機械が動作温度に達するまで待ちます。次に、サンプル収集プレートをプレートシーラーのプレートホルダーに置き、赤い線を上に向けてプレートの上部に新しいホイルシールを置きます。プレートシーラーが動作温度に達したら、機器のタッチスクリーンでイジェクトを押します。プレートホルダーをプレートシーラーの引き出しに入れた後、シールを押して引き出しを閉じます。シーリングが完了すると、引き出しが自動的に開きます。密封されたプレートを取り外し、コールドブロックの上に置きます。次に、プレートシーラーをオフにします。PCRを実行するには、密封された液滴収集プレートを96ディープウェルブロックを備えたPCRマシンに入れます。PCRが完了したら、ドロップレットリーダーと接続されているコンピューターの電源を入れます。PCR後のサンプルを含むプレートをドロップレットリーダープレートホルダーにロードします。サンプルプレートのホイル蓋をしたまま、カバーをホルダーの上部に置き、黒いロッククリップで所定の位置に固定します。次に、ドロップレットリーダーの蓋を開くには、開閉ボタンを押します。次に、サンプルプレート付きのドロップレットリーダープレートホルダーをリーダーチャンバーにロードし、磁気ベースにしっかりと置きます。もう一度開閉ボタンを押して蓋を閉じます。解析ソフトウェアインターフェースを開きます。[プレートの追加] タブを選択し、[プレートの追加]、[プレートの構成] の順にクリックします。[プレート情報]タブで、プレート名を入力し、[Supermix]ドロップダウンメニューから[プローブ用Supermix]、[DUTPなし]を選択し、[ウェル選択]タブ As.In[データファイルの保存]にファイル名を入力し、分析するウェルをハイライト表示して、[選択したウェルを含める]をクリックします。次に、[井戸情報]タブで、注釈を付ける井戸を選択します。[実験タイプ]ドロップダウンメニューから[直接定量]を選択します。次に、サンプルの説明、サンプルタイプ、ターゲット名ボックスに入力し、必要に応じてウェルノートやプレートノートを追加します。次に、[適用] をクリックします。プレートの構成が完了したら、[実行の開始] をクリックします。結果分析を行うには、[データ分析]タブを選択し、[マイデータファイル]メニューから分析するファイルを開きます。次に、単色実験の場合は「1D 振幅」タブ、2 色実験の場合は「2D 振幅」タブをクリックします。次に、閾値化が必要なウェルを選択します。しきい値ラインモードツールを使用して、振幅プロット上の正と負の集団の間の空きスペースにしきい値を手動で適用し、4つの液滴集団が明確に分離されるように十字線が配置されるようにします。すべてのサンプルにしきい値が適用されたら、[データ テーブル] タブの [インポート/エクスポート] をクリックし、[表示データを CSV にエクスポート] を選択して、結果を csv ファイルとしてエクスポートし、さらに分析します。適切なファイル名を入力し、[保存] をクリックします。このプロトコルで使用されたPCRおよび液滴読み取り手順は、ファムチャネルとヘキサチャネルの両方で、陽性および陰性の液滴の明確に分離された集団の存在を示しました。両方のプローブに対して陽性のミトコンドリアDNA集団も、単一細胞溶解物と区別することができた。この方法はまた、ミトコンドリアDNAに欠失を有する試料について、二重陽性の液滴およびDNAの非欠失部分のみについて陽性の液滴の混合集団が存在することを示した。この方法は、マウス卵母細胞や初代マウス胚細胞を含むさまざまな哺乳類細胞の細胞あたりのミトコンドリアDNAコピー数をカウントするために成功裏に使用されています。さらに、高欠失ヘテロプラスミーを有する細胞では、単一プローブに対して陽性の集団は、二重陽性集団よりも有意に大きいことがわかった。しかし、低欠失ヘテロプラスミーを有する細胞では、両方の集団は同様のサイズであった。したがって、正確な結果は、液滴の生成が成功し、1Dまたは2D振幅ビューを使用して閾値が適切に適用されていることを常に保証します。未使用のライセートは、一塩基多型ヘテロプラスミーを測定できるパイロシークエンシングなどの他のシングルセルアッセイに使用できます。この技術の開発により、これまで不可能だった個々の細胞のミトコンドリアDNAコピー数と欠失ヘテロプラスミーを正確に測定できるようになりました。

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

昇順大動脈剛性の測定<em&gt;インビボ</em&gt;超音波​​を使用したマウスにおける

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em&gt;インビボ</emヒト骨格筋における&gt;ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

リビジョン人工で新規診断: 超音波処理と多重ポリメラーゼの連鎖反応のインプラント

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

血液ベース ROS1 の検出のためのテストし、デジタル ポリメラーゼ連鎖反応を使用してリボ核酸を循環から融合の成績証明書を RET

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

低酸素/再酸素化後心筋細胞におけるミトコンドリア膜電位を測定するためのフロー フローサイトメトリーを用いたアッセイ

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

酸性揉捻法を用いた全腎ネフロン数の推定

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

ポイントオブケア超音波を用いたダイアフラムの厚さと機能の測定

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...