Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

액적 생성 PCR 데이터의 통계 분석에 대한 조언을 해주신 L Bozhilova 박사에게 감사드립니다. 그림 3C 및 그림 4B에서 데이터를 생성하는 데 사용되는 난모세포를 제공한 H Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 캠브리지 대학의 의학 연구위원회 미토콘드리아 생물학 단위 (MC_UU_00015 / 9)의 SPB에 의해 수행되었으며 PFC (212219 / Z / 18 / Z)가 보유한 Wellcome Trust Principal Research Fellowship의 자금 지원을 받았습니다.

모든 실험은 REACH 지침을 따랐으며 캠브리지 대학 동물 복지 윤리 검토 기관 (AWERB)의 승인을 받았습니다.
알림: 액적 생성 전 모든 샘플 준비 단계는 깨끗한 사전 PCR 작업 영역, 가능하면 UV 멸균 캐비닛에서 수행해야 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 액적 생성 PCR 장비( 재료 표 참조)를 사용하며, 일반적인 방법은 다른 시스템에도 적용할 수 있어야 하지만 ?...

<ol>
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여기에 설명된 프로토콜은 위에서 논의한 것 외에도 광범위한 세포 유형 및 종에 적용할 수 있지만, 이전에 검증된 프라이머/프로브 조합에서 벗어날 때 분석법의 정확성과 반복성이 유지되도록 하려면 새로운 분석 설계의 신중한 최적화가 중요합니다. 단일 세포로 작업할 때 샘플 수집이 가능한 한 정확하게 수행되도록 하고(예: FACS로 세포를 분류할 때 엄격한 단일 세포 파라미터 사용) 얻은 결?...

포유류 미토콘드리아(mt)DNA는 2개의 rRNA, 22개의 tRNA 및 13개의 단백질 코딩 유전자로 구성된 37개의 유전자를 암호화하는 미토콘드리아 매트릭스에 상주하는 작은(약 16.5Kb) 원형 DNA게놈입니다. 세포당 각 유전자의 사본이 하나(반수체) 또는 두 개(이배체) 복제를 포함하는 핵 게놈과 달리 mtDNA는 각 세포의 미토콘드리아에 수십 개의 사본(예: 성숙한 정자세포)에서 수십만 개의 사본(예: 난모세포)에 이르기까지 여러 사본으로 존재합니다2,3. 이러한 다중 복제 특성의 결과는 단일 염기 다형성(SNP), 결실 또는 복제로 존재할 수 있는 mtDNA 게놈의 돌연변이가 주어진 세포에서 다양한 수준으로 존재할 수 있으며 세포의 전체 mtDNA 집단의 0%에서 100%까지 구성할 수 있다는 것입니다. 동일한 세포에 야생형 및 돌연변이 mtDNA 게놈이 존재하는 것을 이형질이라고 하며, 병원성 이형질 mtDNA 돌연변이는 미토콘드리아 질환의 주요 원인이며, 몇 가지 일반적인 신경 증후군이 근본적인 이형질 mtDNA 돌연변이와관련이 있습니다4.
임상 질환을 유발하는 이형질 mtDNA 돌연변이의 가능성에 기여하는 두 가지 주요 매개 변수는 이형질 수준과 mtDNA 복제 수입니다. 많은 이형질 돌연변이는 역치 효과를 나타내며, 생화학 적 및 임상 적 표현형은 특정 이형질 수준 (일반적으로 약 80 % 5) 이상에서만 분명 해지고 이형질이 더 증가함에 따라 악화됩니다4. 그러나 세포에 존재하는 mtDNA의 사본 수를 고려하는 것도 중요한데, 이는 주어진 이형질 수준에 존재하는 야생형(즉, '건강한') mtDNA 게놈의 수에 영향을 미치기 때문입니다. 미토콘드리아 질환 환자에 대한 연구는 이형질과 복제 번호5,6 사이의 이러한 상호 작용의 중요성을 강조했으며, Filograna et al.은 최근 미토콘드리아 질환7의 마우스 모델에서 변하지 않은 이형질에도 불구하고 증상을 완화시키는 mtDNA 복제 수의 증가를보고했습니다.
최근 몇 년 동안 mtDNA 이종질로 인한 질병의 발병 기전 및 전염에 대한 이해를 향상시키기 위해 많은 작업이 수행되었지만, 이 작업의 대부분은 세포가 아닌 조직 수준에서 수행되어 평균 조직 이형질 수준과 대량 조직 생검 및 혈액 샘플에서 얻은 복제 수 측정을 비교합니다. 레이저 포획 미세 해부와 같은 일부 잘 정립 된 기술은 세포 수준 8,9에서 이러한 측정을 허용합니다. 그러나 최근 고처리량 단일 세포 분석 방법 또는 소위 "단일 세포 오믹스"10의 폭발적인 증가로 인해 단일 세포 수준에서 이러한 중요한 mtDNA 파라미터를 정확하게 측정할 수 있는 방법에 대한 요구가 생겼습니다.
액적 생성 PCR 방법은 샘플DNA 11에서 특정 표적 앰플리콘의 PCR 증폭을 통해 알려지지 않은 DNA 농도를 정량하는 기존 방법을 개선하기 위해 미세 유체 기술의 최근 발전을 이용합니다. 샘플 DNA가 단일 반응으로 증폭되는 qPCR과 달리 PCR 산물의 상대적 축적 속도가 판독값으로 작용하여 이 방법은 초기 샘플을 수천 개의 개별 방울로 분할하여 샘플 DNA 분자를 공간적으로 분리된 반응으로 구획화합니다12. 후속 PCR 반응은 각 개별 액적에서 진행되며 PCR 산물은 표적 DNA를 포함하는 액적에만 축적됩니다. 이 반응의 결과는 표적 DNA 및 증폭 된 PCR 산물의 사본을 포함하거나 표적 DNA를 포함하지 않는 물방울 풀 형태의 디지털 출력입니다. 형광 DNA 프로브 또는 이중 가닥(ds)DNA 결합 염료를 사용하여 증폭된 산물을 포함하는 액적을 계수할 수 있으며 '양성' 대 '음성' 방울의 비율을 사용하여 초기 샘플에 존재했던 DNA 사본의 절대 수를 계산할 수 있습니다. qPCR 반응에서 얻은 상대적 측정과 반대되는 이 절대 측정은 이 방법론을 단일 세포에서 mtDNA 복제 수 및 이형질의 정확한 측정에 사용할 수 있게 하는 핵심 요소이며11, 최근의 여러 연구에서 이미 이러한 목적으로 액적 생성 PCR 기술을 활용했습니다.13,14 . 이 기사는 인간과 마우스 조직 모두에서 단일 세포에서 mtDNA 복제 수와 결실 이형질을 측정하는 방법을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

포유류 미토콘드리아 (mt) DNA는 전자 수송 사슬의 13 개 서브 유닛을 암호화하는 작고 원형의 이중 가닥 미토콘드리아 내 DNA 분자입니다. 이배체 핵 게놈과 달리 대부분의 세포에는 세포 유형에 따라 100개 미만에서 200,000개 이상의 사본에 이르는 mtDNA 사본이 더 많이 포함되어 있습니다. MtDNA 복제 수는 여러 연령 관련 퇴행성 질환 및 질병에 대한 바이오마커로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 따라서 mtDNA 복제 수의 정확한 측정은 연구 및 진단 환경 모두에서 핵심 도구가 되고 있습니다. 종종 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 또는 결실로 발생하는 mtDNA의 돌연변이는 세포 내 mtDNA의 모든 사본 (동형 플라즘이라고 함) 또는 돌연변이 및 WT mtDNA 사본의 혼합물 (이종 플라스미라고 함)로 존재할 수 있습니다. 이종질 mtDNA 돌연변이는 희귀 질환 또는 파킨슨병과 같은 점점 더 많은 일반적인 후기 발병 질환에서 임상 미토콘드리아 병리의 주요 원인입니다. 세포에 존재하는 이형질의 수준을 결정하는 것은 희귀 미토콘드리아 질환의 진단과 미토콘드리아가 역할을 할 수있는 일반적인 후기 발병 장애를 이해하기위한 연구에서 중요한 단계입니다. MtDNA 복제 수 및 이형질은 전통적으로 정량적 (q) PCR 기반 분석 또는 심층 시퀀싱에 의해 측정되었습니다. 그러나 최근 도입된 ddPCR 기술은 두 파라미터를 모두 측정하기 위한 대체 방법을 제공했습니다. 절대 mtDNA 복제 수를 측정할 수 있는 기능과 낮은 복제 수에서도 단일 세포에서 정확한 측정을 수행할 수 있는 충분한 감도를 포함하여 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 ddPCR을 사용하여 단일 세포에서 mtDNA 복제 수의 측정을 설명하는 자세한 프로토콜이며, 이후 액적 생성 PCR이라고 하며, mtDNA가 결실된 세포에서 이형질을 동시에 측정하는 옵션이 있습니다. mtDNA SNP를 가진 세포에서 이형질을 측정하기 위해이 방법을 확장 할 가능성도 논의된다.

액적 생성 후 불투명한 액적의 투명한 층이 각 웰의 오일 상 위에 떠 있는 것을 볼 수 있습니다(그림 1B). 액적 형성은 단일 세포에 대한 실험을 수행할 때 투입 용해물에 세제가 존재함으로써 악영향을 받을 수 있습니다. 2.1.2.에 설명된 용해 프로토콜을 사용하면 최종 샘플에 소량의 TWEEN-20이 존재함에도 불구하고 권장 수준인 10,000 이상의 액적 수율이 일상적으로 달성됩니다...

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Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

이 프로토콜은 개별 세포에 존재하는 미토콘드리아 DNA의 사본 수와 특정 유형의 미토콘드리아 DNA 돌연변이 수준을 정확하게 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 방법은 많은 세포를 포함하는 조직 샘플에서 이러한 측정을 정확하게 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 셀에서 동일한 측정을 수행 할 수 있다는 것입니다.이 방법은 특히 미토콘드리아를 연구하는 사람들에게 사용되며 이 분야에서 광범위하게 적용될 것입니다. 단일 세포의 효과적인 분리 및 용해가 이 기술의 핵심입니다. 단일 셀 정렬에 대한 이전 경험은 매우 도움이 될 것입니다.시작하려면 텍스트에 설명된 대로 얼음에 샘플 DNA가 없는 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 간단히 볼텍싱한 후, 제조된 마스터 믹스의 필요한 부피를 액적 생성 PCR 96-웰 플레이트의 각 웰에 분배하고, 샘플을 전체 컬럼에 배열한다. 다음으로, 마스터 믹스를 불완전한 열의 빈 우물에 추가하여 템플릿이 아닌 컨트롤로 사용합니다.그런 다음 각 웰에 입력 DNA를 추가하여 각 웰의 총 부피를 22 마이크로 리터로 만듭니다. 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 2000RPM의 셰이커에 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 접시를 섭씨 4도에서 1분 동안 1000배 G로 원심분리한 후 얼음 위에 놓습니다.액적 생성의 경우 먼저 액적 발생기의 전원이 켜져 있는지 확인하고 액적 생성 오일 병이 계기 데크의 E 위치에 로드되었는지 확인하십시오. 그런 다음 터치 스크린에서 샘플 플레이트 구성을 클릭합니다. 샘플 또는 블랭크가 포함된 샘플 플레이트의 모든 컬럼을 선택한 후 확인을 클릭하여 플레이트 구성을 확인합니다.그런 다음 액적 발생기 카트리지를 계기판 데크의 B 위치에 로드하여 모든 표시등이 녹색으로 바뀌고 빈 팁 폐기물통을 C 위치에 놓습니다.그런 다음 뚜껑을 제거한 필터 팁 상자를 계기 스테이지의 D 위치로 로드하여 모든 표시등이 녹색으로 바뀌도록 합니다. 다음으로, 표시등이 녹색으로 바뀌도록 계기판의 F 위치에 샘플 플레이트를 로드하기 전에 접착 씰을 제거합니다. 또한 빈 액적 수집 96웰 플레이트를 냉각 블록에 넣고 섭씨 영하 20도에서 미리 냉각하여 표시등이 녹색으로 바뀌도록 G 위치에 놓습니다.기기 터치 스크린에서 액적 생성 시작을 클릭하면 액적 발생기 덮개가 자동으로 닫힙니다. 액적 생성이 완료되면 샘플 수집 플레이트를 육안으로 확인하여 각 웰의 오일 상 위에 액적 에멀젼 층이 존재하는지 확인합니다. 그런 다음 플레이트 실러의 전원을 켜고 온도를 섭씨 180도로 설정하고 밀봉 시간을 5초로 설정합니다.기계가 작동 온도에 도달하도록 합니다. 그런 다음 샘플 수집 플레이트를 플레이트 실러의 플레이트 홀더에 놓고 빨간색 선이 위쪽을 향하도록 플레이트 상단에 새 호일 씰을 놓습니다. 플레이트 실러가 작동 온도에 도달하면 기기 터치 스크린에서 꺼내기를 누릅니다.플레이트 홀더를 플레이트 실러의 서랍에 넣은 후 씰을 눌러 서랍을 닫습니다. 밀봉이 완료되면 서랍이 자동으로 열립니다. 밀봉 된 판을 제거하고 콜드 블록에 놓습니다.그런 다음 플레이트 실러를 끕니다. PCR을 실행하려면 밀봉된 액적 수집 플레이트를 96 딥웰 블록이 있는 PCR 기계에 놓습니다. PCR이 완료되면 액적 판독기와 연결된 컴퓨터의 전원을 켭니다.PCR 후 샘플이 있는 플레이트를 액적 판독기 플레이트 홀더에 로드합니다. 샘플 플레이트에 호일 뚜껑을 유지하면서 덮개를 홀더 상단에 놓고 검은색 잠금 클립으로 제자리에 고정합니다. 그런 다음 액적 판독기 덮개를 열려면 열기/닫기 버튼을 누릅니다.그런 다음 샘플 플레이트와 함께 액적 판독기 플레이트 홀더를 판독기 챔버에 로드하고 마그네틱 베이스에 단단히 놓습니다. 열기/닫기 버튼을 다시 눌러 덮개를 닫습니다. 분석 소프트웨어 인터페이스를 엽니다.Add Plate(플레이트 추가) 탭을 선택하고 Add Plate(플레이트 추가)를 클릭한 다음 Plate 구성을 클릭합니다. 플레이트 정보 탭에서 플레이트 이름을 입력하고 Supermix 드롭다운 메뉴에서 프로브용 Supermix, DUTP 없음을 선택하고 웰 선택 탭 As.In 데이터 파일 저장 아래에 파일 이름을 입력하고 분석할 웰을 강조 표시한 다음 선택한 웰 포함을 클릭합니다. 그런 다음 웰 정보 탭에서 주석을 달 웰을 선택합니다.실험 유형 드롭다운 메뉴에서 직접 정량화를 선택합니다. 그런 다음 샘플 설명, 샘플 유형 및 대상 이름 상자를 채우고 필요에 따라 웰 노트 및/또는 플레이트 노트를 추가합니다. 그런 다음 적용을 클릭합니다.플레이트 구성이 완료되면 실행 시작을 클릭합니다. 결과 분석을 위해 데이터 분석 탭을 선택하고 내 데이터 파일 메뉴에서 분석할 파일을 엽니다. 그런 다음 단색 실험의 경우 1D 진폭 탭을 클릭하고 2색 실험의 경우 2D 진폭 탭을 클릭합니다.다음으로 임계 값이 필요한 우물을 선택하십시오. 임계값 선 모드 도구를 사용하여 진폭 플롯에서 양수 집단과 음수 집단 사이의 빈 공간에 임계값을 수동으로 적용하여 4개의 액적 모집단이 명확하게 분리되도록 십자선이 배치되도록 합니다. 모든 샘플에 임계값이 적용되면 데이터 테이블 탭, 가져오기/내보내기를 클릭하고 표시되는 데이터를 CSV로 내보내기를 선택하여 추가 분석을 위해 결과를 csv 파일로 내보냅니다.적절한 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다. 이 프로토콜에 사용된 PCR 및 액적 판독 절차는 fam 및 hex 채널 모두에서 양성 및 음성 비말의 명확하게 분리된 집단의 존재를 입증했습니다. 두 프로브 모두에 대해 양성인 미토콘드리아 DNA 집단은 또한 단일 세포 용해물과 구별될 수 있었다.이 방법은 또한 미토콘드리아 DNA에서 결실 된 샘플의 경우, 이중 양성 방울과 DNA의 결실되지 않은 부분에만 양성인 물방울의 혼합 집단이 존재한다는 것을 보여주었습니다. 이 방법은 마우스 난모세포 및 일차 마우스 배아 세포를 포함한 다양한 포유류 세포에서 세포당 미토콘드리아 DNA 복제 수를 계수하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 더욱이, 결실이 높은 이종질을 갖는 세포에서, 단일 프로브에 대해 양성인 집단은 이중 양성 집단보다 유의하게 더 큰 것으로 밝혀졌다.그러나, 낮은 결실 이종 plasmy를 갖는 세포에서, 두 집단은 비슷한 크기였다. 따라서 정확한 결과는 항상 액적 생성이 성공하고 1D 또는 2D 진폭 보기를 사용하여 임계값이 적절하게 적용되었는지 확인합니다. 사용되지 않은 용해물은 단일 뉴클레오티드 다형성 이형질을 측정할 수 있는 파이로시퀀싱과 같은 다른 단일 세포 분석에 사용할 수 있습니다.이 기술의 개발로 이전에는 불가능했던 개별 세포에서 미토콘드리아 DNA 복제 수와 결실 이형질을 정확하게 측정 할 수있었습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

오름차순 대동맥 강성 측정<em&gt; 생체</em&gt; 초음파를 사용하여 마우스의

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

연구

의학

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

인-31 자기 공명 분광학 : 측정을위한 도구<em&gt; 생체</em인간의 골격 근육에&gt; 미토콘드리아 산화 적 인산화 능력

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

개정 공동 교체에 새로운 진단: 쥡니다 및 다중 연쇄 반응 임 플 란 트

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

혈액 기반 ROS1의 검출을 위한 테스트 및 RET Ribonucleic 산 디지털 연쇄 반응을 사용 하 여 순환에서 퓨전 성적표

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

산 성 침 용 법을 사용 하 여 전체 신장의 네 프 론의 수 추정

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

현장 진료 초음파를 사용한 다이어프램 두께 및 기능 측정

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...