Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Takk til Dr. L Bozhilova for råd om statistisk analyse av dråpegenerering PCR-data. Takk til Dr. H Zhang for å gi oocytter som brukes til å generere data i figur 3C og figur 4B. Dette arbeidet ble utført av SPB ved Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, og finansiert av et Wellcome Trust Principal Research Fellowship holdt av PFC (212219 / Z / 18 / Z).

Alle forsøkene fulgte ARRIVE-retningslinjene og ble godkjent av University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).
MERK: Alle prøveprepareringstrinn før dråpegenerering må utføres i et rent arbeidsområde før PCR, ideelt i et UV-sterilisert skap der det er mulig. Protokollen som er beskrevet her, bruker spesifikt PCR-utstyr for dråpegenerering (se materialfortegnelse), og selv om den generelle metoden skal gjelde for andre systemer, anbefales det å ko...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription,+mass+and+respiratory+activity.">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--&gt;G.">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A--&gt;G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases.">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146 (2013).</li><li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse.">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells:+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues.">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li><li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA(Lys)+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+(MERRF).">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR.">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li><li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA:+age,+fiber+type,+and+mutation-induced+changes.">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li><li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution.">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li><li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control.">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li><li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells.">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li><li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis.">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li><li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms.">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, 2369-2378 (2013).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions.">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li><li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation.">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression.">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li><li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases.">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

Protokollen beskrevet her er anvendelig over et bredt spekter av celletyper og arter i tillegg til de som er diskutert ovenfor, selv om nøye optimalisering av nye analysedesign vil være nøkkelen for å sikre at nøyaktigheten og repeterbarheten av metoden opprettholdes når du beveger deg bort fra tidligere validerte primer / sondekombinasjoner. Når du arbeider med enkeltceller, er det viktig å sikre at prøveinnsamlingen utføres så nøyaktig som mulig (f.eks. Ved bruk av strenge enkeltcelleparametere ved sorterin...

Pattedyrs mitokondrielle (mt) DNA er et lite (ca. 16,5 Kb), sirkulært DNA-genom som ligger i mitokondriell matrise som koder for 37 gener, bestående av to rRNA, 22 tRNA og 13 proteinkodende gener1. I motsetning til det nukleære genomet, som inneholder en (haploid) eller to (diploide) kopier av hvert gen per celle, er mtDNA tilstede i flere kopier i mitokondriene til hver celle, alt fra titalls kopier (f.eks. Modne spermatocytter) til hundretusener av kopier (f.eks. Oocytter)2,3. En konsekvens av denne multikopi-naturen er at mutasjoner i mtDNA-genomet, som kan eksistere som enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP), delesjoner eller dupliseringer, kan være tilstede på varierende nivåer i en gitt celle, og utgjør alt fra 0% til 100% av cellens totale mtDNA-populasjon. Eksistensen av villtype og mutante mtDNA-genomer i samme celle kalles heteroplasmi, og patogene heteroplasmatiske mtDNA-mutasjoner er en viktig årsak til mitokondriell sykdom, med flere vanlige nevrologiske syndromer knyttet til underliggende heteroplasmatiske mtDNA-mutasjoner4.
To viktige parametere som bidrar til sannsynligheten for at en heteroplasmatisk mtDNA-mutasjon forårsaker klinisk sykdom er heteroplasminivået og mtDNA-kopinummeret. Mange heteroplasmatiske mutasjoner viser en terskeleffekt, med biokjemiske og kliniske fenotyper som bare blir tydelige over et visst heteroplasminivå, vanligvis rundt 80%5, og deretter forverres når heteroplasma øker ytterligere4. Det er imidlertid også viktig å vurdere antall kopier av mtDNA tilstede i cellen, da dette vil påvirke antall villtype (dvs. "sunne") mtDNA-genomer som er tilstede på et gitt heteroplasminivå. Studier hos mitokondriesykdomspasienter har fremhevet viktigheten av dette samspillet mellom heteroplasmi og kopi nummer5,6, og Filograna og medarbeidere rapporterte nylig en økning i mtDNA-kopinummer som lindrer symptomer til tross for uendret heteroplasmi i en musemodell av mitokondriell sykdom7.
Mens mye har blitt gjort de siste årene for å forbedre forståelsen av patogenesen og overføringen av sykdommer forårsaket av mtDNA heteroplasmi, har det meste av dette arbeidet blitt utført på vevsnivå i stedet for celler, sammenligning av gjennomsnittlige vev heteroplasmy nivåer og kopi antall målinger hentet fra bulk vevsbiopsier og blodprøver. Noen veletablerte teknikker, for eksempel laserfangstmikrodisseksjon, tillater slike målinger på mobilnivå 8,9; Den nylige eksplosjonen av høykapasitets enkeltcelleanalysemetoder, eller såkalte "Single-cell Omics"10, har imidlertid skapt et krav til metoder som nøyaktig kan måle disse viktige mtDNA-parametrene på enkeltcellenivå.
Dråpegenerasjonens PCR-metode utnytter nylige fremskritt innen mikrofluidisk teknologi for å forbedre eksisterende metoder for kvantifisering av ukjente DNA-konsentrasjoner via PCR-amplifisering av spesifikke målamplikoner i prøven DNA11. I motsetning til qPCR, hvor prøve-DNA forsterkes i en enkelt reaksjon, med den relative akkumuleringshastigheten av PCR-produkt som fungerer som avlesning, deler denne metoden den første prøven i tusenvis av individuelle dråper, og derved fordeler prøve-DNA-molekylene i romlig separate reaksjoner12. Den påfølgende PCR-reaksjonen fortsetter i hver enkelt dråpe, med PCR-produktet som bare akkumuleres i dråper som inneholder mål-DNA. Resultatet av denne reaksjonen er en digital utgang i form av et basseng av dråper som enten inneholder en kopi av mål-DNA og forsterket PCR-produkt, eller ikke inneholder mål-DNA. Ved hjelp av fluorescerende DNA-sonder eller et dobbeltstrenget (ds) DNA-bindende fargestoff, kan dråpene som inneholder forsterket produkt telles, og forholdet mellom "positive" og "negative" dråper kan brukes til å beregne det absolutte antall DNA-kopier som var tilstede i den første prøven. Denne absolutte målingen, i motsetning til den relative målingen oppnådd fra en qPCR-reaksjon, er nøkkelfaktoren som gjør at denne metoden kan brukes til nøyaktig måling av mtDNA-kopinummer og heteroplasmi i enkeltceller11, og flere nyere studier har allerede benyttet dråpegenerasjons PCR-teknologi til dette formålet13,14 . Denne artikkelen presenterer en metode for måling av mtDNA-kopinummer og delesjonsheteroplasmi i enkeltceller fra både menneske- og musevev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

Pattedyrets mitokondrielle (mt) DNA er et lite, sirkulært, dobbeltstrenget, intra-mitokondrielt DNA-molekyl, som koder for 13 underenheter av elektrontransportkjeden. I motsetning til det diploide nukleære genomet inneholder de fleste celler mange flere kopier av mtDNA, alt fra mindre enn 100 til over 200 000 kopier, avhengig av celletype. MtDNA-kopinummer brukes i økende grad som biomarkør for en rekke aldersrelaterte degenerative tilstander og sykdommer, og dermed blir nøyaktig måling av mtDNA-kopinummeret et sentralt verktøy i både forsknings- og diagnostiske innstillinger. Mutasjoner i mtDNA, som ofte forekommer som enkeltnukleotidpolymorfismer (SNPs) eller delesjoner, kan enten eksistere i alle kopier av mtDNA i cellen (betegnet homoplasmi) eller som en blanding av muterte og WT mtDNA-kopier (kalt heteroplasmi). Heteroplasmatiske mtDNA-mutasjoner er en viktig årsak til klinisk mitokondriell patologi, enten i sjeldne sykdommer eller i et økende antall vanlige sent debuterende sykdommer som Parkinsons sykdom. Å bestemme nivået av heteroplasmi tilstede i celler er et kritisk skritt i diagnosen sjeldne mitokondrielle sykdommer og i forskning som tar sikte på å forstå vanlige senstartsforstyrrelser der mitokondrier kan spille en rolle. MtDNA-kopinummer og heteroplasmi har tradisjonelt blitt målt ved kvantitative (q) PCR-baserte analyser eller dypsekvensering. Den nylige introduksjonen av ddPCR-teknologi har imidlertid gitt en alternativ metode for å måle begge parametrene. Det gir flere fordeler i forhold til eksisterende metoder, inkludert muligheten til å måle absolutt mtDNA-kopinummer og tilstrekkelig følsomhet for å gjøre nøyaktige målinger fra enkeltceller selv ved lave kopinumre. Her presenteres en detaljert protokoll som beskriver måling av mtDNA-kopinummer i enkeltceller ved bruk av ddPCR, referert til som dråpegenerering PCR fremover, med mulighet for samtidig måling av heteroplasmi i celler med mtDNA-delesjoner. Muligheten for å utvide denne metoden for å måle heteroplasmi i celler med mtDNA SNPs diskuteres også.

Etter dråpegenerering er det synlig et klart lag med ugjennomsiktige dråper som flyter oppå oljefasen i hver brønn (figur 1B). Dråpedannelse kan påvirkes negativt av tilstedeværelsen av vaskemidler i inngangslysatet når man utfører eksperimenter på enkeltceller. Ved bruk av lysisprotokollen beskrevet i 2.1.2., oppnås rutinemessig dråpeutbytter over anbefalt nivå på 10 000, til tross for at det foreligger en liten restmengde TWEEN-20 i den endelige prøven (...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Her presenterer vi en protokoll for måling av absolutt mitokondrielt (mt)DNA-kopinummer og mtDNA-sletting heteroplasminivå i enkeltceller.

Måling av enkeltcellet mitokondrielt DNA-kopinummer og heteroplasmi ved bruk av digital dråpepolymerasekjedereaksjon

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Denne protokollen kan brukes til å nøyaktig måle antall kopier av mitokondrielt DNA tilstede i individuelle celler og nivået av visse typer mitokondriell DNA-mutasjon. Tidligere metoder kan nøyaktig gjøre disse målingene i vevsprøver som inneholder mange celler. Den største fordelen med denne teknikken er at vi kan gjøre de samme målingene i enkeltceller.Denne metoden er spesielt nyttig for de som studerer mitokondrier og vil ha bred anvendelse på dette feltet. Effektiv isolasjon og lyse av enkeltceller er nøkkelen til denne teknikken. Tidligere erfaring med enkeltcellesortering ville være svært nyttig.For å begynne, klargjør masterblandingen for PCR uten prøve-DNA på is, som beskrevet i teksten. Etter å ha virvlet kort, distribuer det nødvendige volumet av den tilberedte masterblandingen til hver brønn i en dråpegenerasjon PCR 96-brønnplate, og ordne prøvene i fulle kolonner. Deretter legger du til hovedblandingen i en tom brønn i ufullstendige kolonner for å bruke dem som ikke-malkontroller.Legg deretter inngangs-DNA til hver brønn for å gjøre det totale volumet av hver brønn 22 mikroliter. Forsegl platen med en selvklebende platetetning og legg den på en shaker ved 2000 o / min i ett minutt. Sentrifuger deretter platen ved 1000 ganger G i ett minutt ved fire grader Celsius før den legges på is.For dråpegenerering må du først sørge for at dråpegeneratoren er slått på og kontrollere om en flaske dråpegenererende olje er lastet i posisjon E på instrumentdekket. Klikk deretter på Konfigurer prøveplate på berøringsskjermen. Etter å ha valgt alle kolonnene på prøveplaten som inneholder prøvene eller emnene, klikker du på OK for å bekrefte platekonfigurasjonen.Deretter laster du dråpegeneratorpatronene til posisjon B på instrumentdekket slik at alle lysene blir grønne og plasserer et tomt spissavfallstrau på plass C.Last deretter filterspissbokser med lokk fjernet for å plassere D på instrumenttrinnet slik at alle lysene blir grønne. Fjern deretter limforseglingen før du legger prøveplaten i posisjon F på instrumentdekket slik at lyset blir grønt. Legg også en tom dråpesamling 96-brønnplate plassert i en kjølig blokk, forkjølt ved minus 20 grader Celsius, i posisjon G slik at lyset blir grønt.Klikk Start dråpegenerering på instrumentets berøringsskjerm, og lokket på dråpegeneratoren lukkes automatisk. Når dråpegenereringen er fullført, kontroller prøveoppsamlingsplaten visuelt for å bekrefte at et dråpeemulsjonslag er tilstede over oljefasen i hver brønn. Deretter slår du på plateforsegleren og setter temperaturen til 180 grader Celsius og tetningstiden til fem sekunder.La maskinen nå driftstemperaturen. Plasser deretter prøveoppsamlingsplaten på plateholderen på plateforsegleren og legg en ny folieforsegling på toppen av platen med den røde linjen vendt oppover. Når plateforseglingen har nådd driftstemperaturen, trykker du på utløseren på instrumentets berøringsskjerm.Etter å ha plassert plateholderen i skuffen til plateforseglingen, trykk på tetningen for å lukke skuffen. Når forseglingen er fullført, åpnes skuffen automatisk. Fjern den forseglede platen og legg den på kuldeblokken.Slå deretter av plateforsegleren. For å kjøre PCR, plasser den forseglede dråpeoppsamlingsplaten i en PCR-maskin med en 96 dypbrønnblokk. Når PCR-en er fullført, slår du på slippverktøyleseren og den tilkoblede datamaskinen.Legg platen med post-PCR-prøvene i dråpeleserplateholderen. Mens du holder folielokket på prøveplaten, plasser dekselet på toppen av holderen og fest det på plass med svarte låseklips. Deretter, for å åpne dråpeleserlokket, trykk på åpne / lukk-knappen.Legg deretter dråpeleserplateholderen med prøveplaten inn i leserkammeret og plasser den sikkert på magnetbasen. Trykk på åpne/lukk-knappen igjen for å lukke lokket. Åpne grensesnittet for analyseprogramvare.Velg Legg til plate-fanen, klikk Legg til plate, og konfigurer deretter Plate. I plateinformasjonsfanen skriver du inn et platenavn, velger Supermix for sonder, Ingen DUTP fra rullegardinmenyen Supermix og skriver inn et filnavn under Lagre datafil As.In brønnvalgfanen, markerer brønnene som skal analyseres og klikker på Inkluder valgte brønner. I kategorien Brønninformasjon velger du deretter brønnene som skal kommenteres.Velg Direkte kvantifisering fra rullegardinmenyen Eksperimenttype. Fyll deretter ut boksene for eksempelbeskrivelse, eksempeltype og målnavn, og legg til brønnnotater og/eller platenotater etter behov. Klikk deretter Bruk.Når platekonfigurasjonen er fullført, klikker du Start kjøring. For resultatanalyse velger du kategorien Dataanalyse og åpner filen som skal analyseres, fra Mine datafiler-menyen. Klikk deretter kategorien 1D-amplitude for eksperimenter i én farge, eller kategorien 2D-amplitude for eksperimenter med to farger.Velg deretter brønnene som krever terskel. Bruk verktøyet for terskellinjemodus til å manuelt bruke terskelen i det klare rommet mellom de positive og negative populasjonene på amplitudeplottet, slik at trådkorset er plassert slik at de fire dråpepopulasjonene er tydelig atskilt. Når terskelen er brukt for alle prøver, eksporterer du resultatene som en csv-fil for videre analyse ved å klikke på Datatabell-fanen, Importer/eksporter, og velg Eksporter synlige data til CSV.Skriv inn et passende filnavn og klikk Lagre. PCR- og dråpeavlesningsprosedyrene som ble brukt i denne protokollen, viste tilstedeværelsen av tydelig adskilte populasjoner av positive og negative dråper, både i fam- og hex-kanalene. Mitokondrielle DNA-populasjoner som er positive for begge probene, kan også skilles fra enkeltcellelysater.Denne metoden viste også at for prøver med delesjoner i mitokondrielt DNA er en blandet populasjon av dobbeltpositive dråper og dråper positive for bare den ikke-slettede delen av DNA tilstede. Denne metoden har blitt brukt til å telle mitokondriell DNA-kopinummer per celle i en rekke pattedyrceller, inkludert mus oocytter og primære mus embryonale celler. Videre, i celler med høy delesjon heteroplasmy, ble populasjonen positiv for en enkelt sonde funnet å være betydelig større enn den dobbeltpositive befolkningen.I celler med heteroplasma med lav delesjon var imidlertid begge populasjonene av tilsvarende størrelse. Så nøyaktige resultater sikrer alltid at dråpegenereringen har vært vellykket, og at terskelverdien er brukt riktig ved hjelp av 1D- eller 2D-amplitudevisningen. Ubrukt lysat kan brukes til andre enkeltcelleanalyser, for eksempel pyrosekvensering, som kan måle heteroplasmi av enkeltnukleotidpolymorfisme.Utviklingen av denne teknikken har gjort det mulig for oss å gjøre nøyaktige målinger av mitokondrielt DNA-kopinummer og sletting heteroplasmi i individuelle celler, noe som tidligere ikke var mulig.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Måling Stigende aortic Stivhet<em&gt; I Vivo</em&gt; I Mus hjelp av ultralyd

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Evaluering av stamcelleegenskaper i menneske ovariecarcinoma Cells Bruke Multi og enkelt celle-basert Spheres Analyser

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Magnetic Resonance spektroskopi: Et verktøy for måling<em&gt; I Vivo</em&gt; Mitokondriell oksidativ fosforylering Kapasitet i Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Romanen diagnostikk i revisjon kirurgi: implantat Sonication og Multiplex polymerasekjedereaksjons

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

En blod-basert Test for påvisning av ROS1 og RET Fusion transkripsjoner sirkulere ribonukleinsyre bruker Digital polymerasekjedereaksjons

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

En flyt cytometri-baserte analysen for å måle mitokondrie membran potensial i hjerte myocytter etter hypoksi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimering av Nephron nummer i hele nyrene ved hjelp av acid maserasjon Method

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Genotyping av enkeltnukleotidpolymorfismer i mitokondriegenomet ved pyrosekvensering

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Måling av membrantykkelse og funksjon ved hjelp av pasientnær ultralyd

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...