Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
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Obrigado ao Dr. L Bozhilova por conselhos sobre a análise estatística de dados de PCR de geração de gotículas. Obrigado ao Dr. H Zhang por fornecer os ovócitos usados para gerar dados na Figura 3C e na Figura 4B. Este trabalho foi realizado pela SPB na Unidade de Biologia Mitocondrial do Conselho de Pesquisa Médica (MC_UU_00015/9), Universidade de Cambridge, e financiado por uma bolsa de pesquisa principal da Wellcome Trust realizada pela PFC (212219/Z/18/Z).

Todos os experimentos seguiram as diretrizes do ARRIVE e foram aprovados pelo Corpo de Revisão Ética do Bem-Estar Animal da Universidade de Cambridge (AWERB).
NOTA: Todas as etapas de preparação da amostra antes da geração de gotículas devem ser realizadas em uma área de trabalho pré-PCR limpa, idealmente em um gabinete esterilizado por UV, sempre que possível. O protocolo descrito aqui usa equipamentos específicos de PCR de geração de gotículas (consulte Tabela de Materi...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription,+mass+and+respiratory+activity.">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--&gt;G.">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A--&gt;G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases.">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146 (2013).</li><li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse.">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells:+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues.">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li><li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA(Lys)+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+(MERRF).">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR.">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li><li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA:+age,+fiber+type,+and+mutation-induced+changes.">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li><li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution.">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li><li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control.">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li><li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells.">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li><li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis.">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li><li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms.">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, 2369-2378 (2013).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions.">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li><li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation.">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression.">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li><li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases.">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

O protocolo descrito aqui é aplicável em uma ampla gama de tipos de células e espécies, além dos discutidos acima, embora a otimização cuidadosa de novos projetos de ensaio seja fundamental para garantir que a precisão e a repetibilidade do método sejam mantidas ao se afastar das combinações de primer/sonda previamente validadas. Ao trabalhar com células individuais, é vital garantir que a coleta de amostras seja realizada com a maior precisão possível (por exemplo, usando parâmetros rigorosos de célula ...

O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é um genoma de DNA circular pequeno (aprox. 16,5 Kb) que reside na matriz mitocondrial que codifica 37 genes, compreendendo dois rRNAs, 22 tRNAs e 13 genes codificadores de proteínas1. Ao contrário do genoma nuclear, que contém uma (haploide) ou duas cópias (diploide) de cada gene por célula, o mtDNA está presente em múltiplas cópias nas mitocôndrias de cada célula, variando de dezenas de cópias (por exemplo, espermatócitos maduros) a centenas de milhares de cópias (por exemplo, ovócitos)2,3. Uma consequência dessa natureza multi-cópia é que mutações no genoma do mtDNA, que podem existir como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), deleções ou duplicações, podem estar presentes em níveis variados em qualquer célula, compondo de 0% a 100% da população total de mtDNA da célula. A existência de genomas de mtDNA do tipo selvagem e mutante na mesma célula é denominada heteroplasmia, e mutações patogênicas heteroplasmáticas de mtDNA são uma das principais causas de doença mitocondrial, com várias síndromes neurológicas comuns ligadas a mutações heteroplasmáticas de mtDNA subjacentes4.
Dois parâmetros-chave que contribuem para a probabilidade de uma mutação heteroplasmática do mtDNA causar doença clínica são o nível de heteroplasmia e o número de cópias do mtDNA. Muitas mutações heteroplasmáticas apresentam um efeito limiar, com fenótipos bioquímicos e clínicos apenas se tornando aparentes acima de um certo nível de heteroplasmia, tipicamente em torno de 80%5, e subsequentemente piorando à medida que a heteroplasmia aumenta ainda mais4. No entanto, também é importante considerar o número de cópias de mtDNA presentes na célula, pois isso influenciará o número de genomas de mtDNA do tipo selvagem (ou seja, "saudáveis") que estão presentes em um determinado nível de heteroplasmia. Estudos em pacientes com doença mitocondrial destacaram a importância dessa interação entre heteroplasmia e número de cópia5,6, e Filograna et al. relataram recentemente um aumento no número de cópias de mtDNA aliviando os sintomas, apesar da heteroplasmia inalterada em um modelo de camundongo de doença mitocondrial7.
Embora muito tenha sido feito nos últimos anos para melhorar a compreensão da patogênese e transmissão de doenças causadas pela heteroplasmia do mtDNA, a maior parte deste trabalho foi conduzida no nível de tecidos e não de células, comparando os níveis médios de heteroplasmia tecidual e as medições do número de cópias adquiridas a partir de biópsias de tecido a granel e amostras de sangue. Algumas técnicas bem estabelecidas, como a microdissecção por captura a laser, permitem tais medidas em nível celular 8,9; no entanto, a recente explosão de métodos de análise de célula única de alto rendimento, ou os chamados "Umics de célula única"10, criou um requisito para métodos que possam medir com precisão esses parâmetros cruciais do mtDNA no nível de célula única.
O método de PCR de geração de gotículas aproveita os recentes avanços na tecnologia microfluídica para melhorar os métodos existentes de quantificação de concentrações de DNA desconhecidas por meio da amplificação por PCR de amplificadores alvo específicos no DNA da amostra11. Ao contrário da qPCR, em que o DNA da amostra é amplificado em uma única reação, com a taxa relativa de acumulação do produto da PCR atuando como a leitura, esse método divide a amostra inicial em milhares de gotículas individuais, compartimentando assim as moléculas de DNA da amostra em reações espacialmente separadas12. A reação de PCR subsequente prossegue em cada gota individual, com o produto de PCR se acumulando apenas em gotículas que contêm o DNA alvo. O resultado dessa reação é uma saída digital na forma de um conjunto de gotículas que contêm uma cópia do DNA alvo e do produto de PCR amplificado ou não contêm o DNA alvo. Usando sondas de DNA fluorescentes ou um corante de ligação de DNA de fita dupla (ds), as gotículas contendo produto amplificado podem ser contadas, e a proporção de gotículas "positivas" para "negativas" pode ser usada para calcular o número absoluto de cópias de DNA que estavam presentes na amostra inicial. Essa medida absoluta, em oposição à medida relativa adquirida a partir de uma reação de qPCR, é o fator-chave que permite que essa metodologia seja utilizada para a mensuração precisa do número de cópias de mtDNA e da heteroplasmia em células isoladas11, e vários estudos recentes já utilizaram a tecnologia de PCR de geração de gotículas para esse fim13,14 . Este artigo apresenta um método para medir o número de cópias de mtDNA e a heteroplasmia de deleção em células individuais de tecidos humanos e de camundongos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é uma molécula de DNA intramitocondrial pequena, circular, de fita dupla, que codifica 13 subunidades da cadeia de transporte de elétrons. Ao contrário do genoma nuclear diploide, a maioria das células contém muito mais cópias de mtDNA, variando de menos de 100 a mais de 200.000 cópias, dependendo do tipo de célula. O número de cópias do mtDNA é cada vez mais usado como um biomarcador para uma série de condições degenerativas e doenças relacionadas à idade e, portanto, a medição precisa do número de cópias do mtDNA está se tornando uma ferramenta fundamental em ambientes de pesquisa e diagnóstico. Mutações no mtDNA, muitas vezes ocorrendo como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou deleções, podem existir em todas as cópias do mtDNA dentro da célula (denominada homoplasmia) ou como uma mistura de cópias de mtDNA mutadas e WT (denominadas heteroplasmia). As mutações heteroplasmáticas do mtDNA são uma das principais causas de patologia mitocondrial clínica, seja em doenças raras ou em um número crescente de doenças comuns de início tardio, como a doença de Parkinson. Determinar o nível de heteroplasmia presente nas células é um passo crítico no diagnóstico de doenças mitocondriais raras e em pesquisas destinadas a entender distúrbios comuns de início tardio em que as mitocôndrias podem desempenhar um papel. O número de cópias de mtDNA e a heteroplasmia têm sido tradicionalmente medidos por ensaios quantitativos baseados em (q)PCR ou sequenciamento profundo. No entanto, a recente introdução da tecnologia ddPCR forneceu um método alternativo para medir ambos os parâmetros. Ele oferece várias vantagens em relação aos métodos existentes, incluindo a capacidade de medir o número absoluto de cópias de mtDNA e sensibilidade suficiente para fazer medições precisas de células individuais, mesmo com números de cópia baixos. Apresentamos aqui um protocolo detalhado que descreve a medição do número de cópias de mtDNA em células individuais usando ddPCR, referido como PCR de geração de gotículas doravante, com a opção de medição simultânea de heteroplasmia em células com deleções de mtDNA. A possibilidade de expandir este método para medir a heteroplasmia em células com SNPs de mtDNA também é discutida.

Após a geração de gotículas, uma camada clara de gotículas opacas é visível flutuando sobre a fase de óleo em cada poço (Figura 1B). A formação de gotículas pode ser afetada negativamente pela presença de detergentes no lisado de entrada ao realizar experimentos em células individuais. Utilizando o protocolo de lise descrito em 2.1.2., rendimentos de gotículas acima do nível recomendado de 10.000 são rotineiramente alcançados, apesar da presença de uma pequena quantidade r...

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Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.

Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Este protocolo pode ser usado para medir com precisão o número de cópias de DNA mitocondrial presentes em células individuais e o nível de certos tipos de mutação do DNA mitocondrial. Métodos anteriores podem fazer com precisão essas medições em amostras de tecido contendo muitas células. A principal vantagem desta técnica é que podemos fazer as mesmas medições em células individuais.Este método é particularmente útil para aqueles que estudam mitocôndrias e terá amplas aplicações neste campo. O isolamento eficaz e a lise de células individuais são fundamentais para esta técnica. A experiência anterior com a classificação de célula única seria muito útil.Para começar, prepare a mistura mestra para a PCR sem o DNA da amostra no gelo, conforme descrito no texto. Após o vórtice brevemente, distribua o volume necessário da mistura mestra preparada para cada poço de uma placa de 96 poços de geração de gotículas, organizando as amostras em colunas completas. Em seguida, adicione a mistura mestre a qualquer poço vazio em colunas incompletas para usá-las como controles que não sejam de modelo.Em seguida, adicione o DNA de entrada a cada poço para fazer o volume total de cada poço 22 microlitros. Sele a placa com uma vedação de placa adesiva e coloque-a em um agitador a 2000 RPM por um minuto. Em seguida, centrifugar a placa a 1000 vezes G por um minuto a quatro graus Celsius antes de colocá-la no gelo.Para a geração de gotículas, primeiro certifique-se de que o gerador de gotículas esteja ligado e verifique se uma garrafa de óleo gerador de gotículas está carregada para posicionar E do convés de instrumentos. Em seguida, clique em Configurar placa de amostra na tela sensível ao toque. Depois de selecionar todas as colunas na placa de amostra contendo as amostras ou espaços em branco, clique em OK para confirmar a configuração da placa.Em seguida, carregue os cartuchos do gerador de gotículas na posição B no convés de instrumentos para que todas as luzes fiquem verdes e coloque uma calha de resíduos de ponta vazia na posição C.Em seguida, carregue as caixas de ponta do filtro com tampas removidas para a posição D no palco do instrumento para que todas as luzes fiquem verdes. Em seguida, remova o selo adesivo antes de carregar a placa de amostra para posicionar F do convés de instrumentos para que a luz fique verde. Carregue também uma placa vazia de coleta de gotículas de 96 poços colocada em um bloco frio, pré-resfriada a menos 20 graus Celsius, na posição G para que a luz fique verde.Clique em Iniciar geração de gotículas na tela sensível ao toque do instrumento e a tampa do gerador de gotas será fechada automaticamente. Quando a geração de gotículas estiver concluída, verifique visualmente a placa de coleta de amostras para confirmar que uma camada de emulsão de gotículas está presente acima da fase de óleo em cada poço. Em seguida, ligue o selador de placas e defina a temperatura para 180 graus Celsius e o tempo de vedação para cinco segundos.Permita que a máquina atinja a temperatura de funcionamento. Em seguida, coloque a placa de coleta de amostras no suporte da placa do selador de placas e coloque uma nova vedação de folha na parte superior da placa com a linha vermelha voltada para cima. Quando o selador de placas atingir sua temperatura de operação, pressione ejetar na tela sensível ao toque do instrumento.Depois de colocar o suporte da placa na gaveta do selador de placas, pressione o selo para fechar a gaveta. Quando a vedação estiver concluída, a gaveta será aberta automaticamente. Retire a placa selada e coloque-a no bloco frio.Em seguida, desligue o selador de placas. Para executar a PCR, coloque a placa de coleta de gotículas selada em uma máquina de PCR com um bloco de poço profundo de 96. Após a conclusão da PCR, ligue o leitor de gotas e o computador conectado.Carregue a placa com as amostras pós-PCR no suporte da placa leitora de gotículas. Mantendo a tampa da folha na placa de amostra, coloque a tampa na parte superior do suporte e prenda-a no lugar com clipes de bloqueio pretos. Em seguida, para abrir a tampa do leitor de gotículas, pressione o botão abrir/fechar.Em seguida, carregue o suporte da placa leitora de gotículas com a placa de amostra na câmara do leitor e coloque-a firmemente na base magnética. Pressione o botão abrir/fechar novamente para fechar a tampa. Abra a interface do software de análise.Selecione a guia Adicionar placa, clique em Adicionar placa e, em seguida, em Configurar placa. Na guia Informações da placa, insira um nome de placa, selecione Supermix para Sondas, Sem DUTP no menu suspenso Supermix e insira um nome de arquivo em Salvar arquivo de dados As.In guia Seleção de poços, realce os poços a serem analisados e clique em Incluir poços selecionados. Em seguida, na guia Informações do poço, selecione os poços a serem anotados.Selecione Quantificação direta no menu suspenso Tipo de experimento. Em seguida, preencha as caixas de descrição da amostra, tipo de amostra e nome de destino e adicione notas de poço e/ou notas de chapa, conforme necessário. Em seguida, clique em Aplicar.Quando a configuração da placa estiver concluída, clique em Iniciar Execução. Para a análise de resultados, selecione a guia Análise de Dados e abra o arquivo a ser analisado no menu Meus Arquivos de Dados. Em seguida, clique na guia Amplitude 1D para experimentos de cor única ou na guia Amplitude 2D para experimentos de duas cores.Em seguida, selecione os poços que exigem limites. Use a ferramenta Modo de Linha de Limiar para aplicar manualmente o limite no espaço livre entre as populações positivas e negativas no gráfico de amplitude, garantindo que a mira seja colocada de tal forma que as quatro populações de gotículas sejam claramente separadas. Depois que o limite for aplicado a todas as amostras, exporte os resultados como um arquivo csv para análise posterior, clicando na guia Tabela de Dados, Importar/Exportar e selecionando Exportar Dados Visíveis para CSV.Insira um nome de arquivo adequado e clique em Salvar. Os procedimentos de PCR e leitura de gotículas utilizados neste protocolo demonstraram a presença de populações claramente separadas de gotículas positivas e negativas, tanto no canal fam quanto no hexadecimal. Populações de DNA mitocondrial positivas para ambas as sondas também podem ser distinguidas de lisatos unicelulares.Este método também mostrou que, para amostras com deleções no DNA mitocondrial, uma população mista de gotículas duplamente positivas e gotículas positivas apenas para a porção não excluída do DNA está presente. Este método tem sido usado com sucesso para contar o número de cópias de DNA mitocondrial por célula em uma variedade de células de mamíferos, incluindo oócitos de camundongos e células embrionárias primárias de camundongos. Além disso, em células com alta heteroplasmia de deleção, a população positiva para uma única sonda foi significativamente maior do que a população duplamente positiva.No entanto, em células com heteroplasmia de baixa deleção, ambas as populações eram de tamanho semelhante. Portanto, resultados precisos sempre garantem que a geração de gotículas tenha sido bem-sucedida e que o limiar tenha sido aplicado adequadamente usando a visualização de amplitude 1D ou 2D. O lisado não utilizado pode ser usado para outros ensaios de célula única, como o pirosequenciamento, que pode medir a heteroplasmia do polimorfismo de nucleotídeo único.O desenvolvimento desta técnica nos permitiu fazer medições precisas do número de cópias de DNA mitocondrial e da heteroplasmia de deleção em células individuais, o que anteriormente não era possível.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Medição da aorta ascendente Rigidez<em&gt; In Vivo</em&gt; Em ratos usando ultra-som

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Medicina

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Avaliação das Propriedades Stem Cell em carcinomas de células do ovário humano utilizar multi e individuais baseados em células Esferas Ensaios

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fósforo-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: uma ferramenta para medir<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacidade mitocondrial fosforilação oxidativo no músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Diagnóstico de romance em artroplastia de revisão: implante Sonication e reação em cadeia da polimerase Multiplex

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Um sangue com base em teste para a detecção de ROS1 e RET transcrições de fusão do ácido ribonucleico, usando a reação em cadeia da polimerase Digital de circulação

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Um ensaio de baseados em citometria de fluxo para medir o potencial de membrana mitocondrial em miócitos após hipóxia/reoxigenação

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimativa do número de néfron em rim inteiro usando o método de maceração ácida

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Medindo a espessura e a função do diafragma usando ultrassom no ponto de atendimento

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...

Enhancing Stroke Rehabilitation with Virtual Reality-Based Occupational Training

Cognitive Function and Upper Limb Rehabilitation Training Post-Stroke Using a Digital Occupational Training System

Author Spotlight: Rehabilitation of Stroke Patients With a Digital Occupational Training System

Função cognitiva e treinamento de reabilitação do membro superior pós-acidente vascular cerebral utilizando um sistema de treinamento ocupacional digital