Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Благодарим доктора Л. Божилову за советы по статистическому анализу данных ПЦР капельной генерации. Спасибо доктору Х. Чжану за предоставление ооцитов, используемых для генерации данных на рисунках 3C и 4B. Эта работа была выполнена SPB в Отделе митохондриальной биологии Совета по медицинским исследованиям (MC_UU_00015/9 Кембриджского университета и финансировалась Главной исследовательской стипендией Wellcome Trust, проводимой PFC (212219/ Z / 18 / Z).

Все эксперименты соответствовали рекомендациям ARRIVE и были одобрены Этическим обзорным органом благосостояния животных Кембриджского университета (AWERB).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы пробоподготовки до образования капель должны выполняться в чистой рабочей зоне перед ПЦР, в ид...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription,+mass+and+respiratory+activity.">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--&gt;G.">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A--&gt;G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases.">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146 (2013).</li><li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse.">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells:+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues.">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li><li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA(Lys)+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+(MERRF).">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR.">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li><li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA:+age,+fiber+type,+and+mutation-induced+changes.">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li><li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution.">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li><li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control.">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li><li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells.">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li><li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis.">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li><li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms.">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, 2369-2378 (2013).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions.">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li><li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation.">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression.">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li><li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases.">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

Протокол, описанный здесь, применим к широкому кругу типов клеток и видов в дополнение к тем, которые обсуждались выше, хотя тщательная оптимизация новых конструкций анализов будет иметь ключевое значение для обеспечения точности и повторяемости метода при отходе от ранее проверенных...

Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшой (около 16,5 Кб) круговой геном ДНК, находящийся в митохондриальной матрице, которая кодирует 37 генов, включающих две рРНК, 22 тРНК и 13 генов, кодирующих белки1. В отличие от ядерного генома, который содержит одну (гаплоидную) или две (диплоидные) копии каждого гена на клетку, мтДНК присутствует в нескольких копиях в митохондриях каждой клетки, начиная от десятков копий (например, зрелых сперматоцитов) до сотен тысяч копий (например, ооцитов)2,3. Следствием этой многокопийной природы является то, что мутации в геноме мтДНК, которые могут существовать в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), делеций или дупликации, могут присутствовать на различных уровнях в любой данной клетке, составляя от 0% до 100% от общей популяции мтДНК клетки. Существование геномов мтДНК дикого типа и мутантных в одной и той же клетке называется гетероплазмой, а патогенные гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной митохондриальных заболеваний, с несколькими распространенными неврологическими синдромами, связанными с основными гетероплазматическими мутациями мтДНК4.
Двумя ключевыми параметрами, которые способствуют вероятности гетероплазматической мутации мтДНК, вызывающей клиническое заболевание, являются уровень гетероплазмы и число копий мтДНК. Многие гетероплазматические мутации проявляют пороговый эффект, при этом биохимические и клинические фенотипы становятся очевидными только выше определенного уровня гетероплазмы, обычно около 80%5, и впоследствии ухудшаются по мере увеличения гетероплазмы еще4. Однако также важно учитывать количество копий мтДНК, присутствующих в клетке, поскольку это будет влиять на количество геномов мтДНК дикого типа (то есть «здоровых»), которые присутствуют на данном уровне гетероплазмы. Исследования у пациентов с митохондриальными заболеваниями подчеркнули важность этого взаимодействия между гетероплазмой и номером копии 5,6, а Filograna et al. недавно сообщили об увеличении числа копий мтДНК, облегчающих симптомы, несмотря на неизменную гетероплазму в мышиной модели митохондриального заболевания7.
Хотя в последние годы многое было сделано для улучшения понимания патогенеза и передачи заболеваний, вызванных гетероплазмой мтДНК, большая часть этой работы была проведена на уровне тканей, а не клеток, сравнивая средние уровни гетероплазмы тканей и измерения числа копий, полученные из объемных биопсий тканей и образцов крови. Некоторые хорошо зарекомендовавшие себя методы, такие, как микродиссекция лазерного захвата, позволяют проводить такие измерения на клеточном уровне 8,9; однако недавний взрыв высокопроизводительных одноклеточных методов анализа, или так называемой «одноклеточной омики»10, создал потребность в методах, которые могут точно измерять эти важнейшие параметры мтДНК на уровне одной клетки.
Метод ПЦР капельной генерации использует преимущества последних достижений в области микрофлюидной технологии для улучшения существующих методов количественного определения неизвестных концентраций ДНК с помощью ПЦР-амплификации конкретных целевых ампликонов в образце ДНК11. В отличие от qPCR, где образец ДНК амплифицируется в одной реакции, при этом относительная скорость накопления продукта ПЦР выступает в качестве считывания, этот метод разделяет исходный образец на тысячи отдельных капель, тем самым разделяя молекулы ДНК образца на пространственно разделенные реакции12. Последующая реакция ПЦР протекает в каждой отдельной капле, при этом продукт ПЦР накапливается только в каплях, которые содержат целевую ДНК. Результатом этой реакции является цифровой выход в виде пула капель, которые либо содержат копию целевой ДНК и амплифицированный продукт ПЦР, либо не содержат целевой ДНК. Используя флуоресцентные ДНК-зонды или двухцепочечный (ds)ДНК-связывающий краситель, капли, содержащие амплифицированный продукт, могут быть подсчитаны, а соотношение «положительных» и «отрицательных» капель может быть использовано для расчета абсолютного числа копий ДНК, которые присутствовали в исходном образце. Это абсолютное измерение, в отличие от относительного измерения, полученного в результате реакции qPCR, является ключевым фактором, который позволяет использовать эту методологию для точного измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы в отдельных клетках11, и в нескольких недавних исследованиях уже использовалась технология ПЦР капельной генерации для этой цели13,14 . В этой статье представлен метод измерения числа копий мтДНК и гетероплазмы делеции в отдельных клетках как из ткани человека, так и из мыши.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

Митохондриальная (мт)ДНК млекопитающих представляет собой небольшую, круглую, двухцепочечную, внутримитохондриальную молекулу ДНК, кодирующую 13 субъединиц электронной транспортной цепи. В отличие от диплоидного ядерного генома, большинство клеток содержат гораздо больше копий мтДНК, от менее 100 до более чем 200 000 копий в зависимости от типа клетки. Число копий мтДНК все чаще используется в качестве биомаркера для ряда возрастных дегенеративных состояний и заболеваний, и, таким образом, точное измерение числа копий мтДНК становится ключевым инструментом как в исследовательских, так и в диагностических условиях. Мутации в мтДНК, часто встречающиеся в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или делеций, могут либо существовать во всех копиях мтДНК в клетке (называемые гомоплазмой), либо в виде смеси мутированных и WT-копий мтДНК (называемых гетероплазмой). Гетероплазматические мутации мтДНК являются основной причиной клинической митохондриальной патологии, либо при редких заболеваниях, либо при растущем числе распространенных заболеваний с поздним началом, таких как болезнь Паркинсона. Определение уровня гетероплазмы, присутствующей в клетках, является критическим шагом в диагностике редких митохондриальных заболеваний и в исследованиях, направленных на понимание распространенных поздних расстройств, где митохондрии могут играть определенную роль. Число копий мтДНК и гетероплазма традиционно измерялись с помощью количественных (q)ПЦР-анализов или глубокого секвенирования. Однако недавнее внедрение технологии ddPCR обеспечило альтернативный метод измерения обоих параметров. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами, включая возможность измерения абсолютного числа копий мтДНК и достаточную чувствительность для проведения точных измерений из отдельных ячеек даже при низких числах копий. Здесь представлен подробный протокол, описывающий измерение числа копий мтДНК в отдельных клетках с использованием ddPCR, впредь называемой ПЦР капельной генерации, с возможностью одновременного измерения гетероплазмы в клетках с делециями мтДНК. Также обсуждается возможность расширения этого метода для измерения гетероплазмы в клетках с мтДНК SNP.

После генерации капель виден прозрачный слой непрозрачных капель, плавающих поверх нефтяной фазы в каждой скважине (рисунок 1B). На образование капель может негативно повлиять наличие моющих средств во входном лизате при проведении экспериментов на одиночных клетках. И...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Здесь мы представляем протокол измерения абсолютного числа копий митохондриальной (мт)ДНК и уровней гетероплазмы делеции мтДНК в отдельных клетках.

Измерение количества копий одноклеточной митохондриальной ДНК и гетероплазмы с помощью цифровой капельно-полимеразной цепной реакции

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Этот протокол может быть использован для точного измерения количества копий митохондриальной ДНК, присутствующих в отдельных клетках, и уровня определенных типов мутаций митохондриальной ДНК. Предыдущие методы могут точно проводить эти измерения в образцах тканей, содержащих много клеток. Основным преимуществом этой методики является то, что мы можем производить одинаковые измерения в отдельных клетках.Этот метод особенно полезен для тех, кто изучает митохондрии, и будет иметь широкое применение в этой области. Эффективное выделение и лизис отдельных клеток является ключом к этой технике. Предыдущий опыт сортировки одной ячейки был бы очень полезен.Для начала подготовьте мастер-микс для ПЦР без образца ДНК на льду, как описано в тексте. После кратковременного вихря распределите необходимый объем приготовленной мастер-смеси на каждую лунку капельной генерации ПЦР-96-луночной пластины, расположив образцы в полные колонки. Затем добавьте основное сочетание в любую пустую ячейку в неполных столбцах для использования в качестве элементов управления, не относящихся к шаблонам.Затем добавьте входную ДНК к каждой скважине, чтобы сделать общий объем каждой лунки 22 микролитра. Запечатайте пластину клейким уплотнением и поместите ее на шейкер при 2000 об/мин в течение одной минуты. Затем центрифугируйте пластину в 1000 раз G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия, прежде чем поместить ее на лед.Для генерации капель сначала убедитесь, что генератор капель включен, и проверьте, загружена ли бутылка капельного масла в положение E на палубе прибора. Затем нажмите «Настроить образец пластины» на сенсорном экране. После выбора всех столбцов на табличке с образцом, содержащей образцы или заготовки, нажмите кнопку ОК, чтобы подтвердить конфигурацию пластины.Затем загрузите картриджи генератора капель в положение B на палубе прибора, чтобы все огни стали зелеными, и поместите пустой желоб для отходов наконечника в положение C. Затем загрузите коробки с наконечниками фильтра со снятыми крышками, чтобы позиционировать D на сцене прибора, чтобы все огни стали зелеными. Затем снимите клейкое уплотнение перед загрузкой пластины образца в положение F приборной палубы так, чтобы свет стал зеленым. Также загрузите пустую капельную коллекционную 96-луночную пластину, помещенную в холодный блок, предварительно охлажденный при минус 20 градусах Цельсия, в положении G так, чтобы свет стал зеленым.Нажмите «Начать генерацию капель» на сенсорном экране прибора, и крышка генератора капель автоматически закроется. После завершения генерации капель визуально проверьте пластину сбора проб, чтобы подтвердить, что слой капельной эмульсии присутствует над масляной фазой в каждой скважине. Далее включите герметик пластины и установите температуру на 180 градусов цельсия и время уплотнения до пяти секунд.Дайте машине достичь рабочей температуры. Затем поместите пластину для сбора проб на держатель пластины герметика пластины и поместите уплотнение из свежей фольги на верхнюю часть пластины с красной линией, обращенной вверх. Когда уплотнитель пластины достигнет своей рабочей температуры, нажмите кнопку извлечения на сенсорном экране прибора.После размещения держателя пластины в ящике герметика пластин нажмите на уплотнение, чтобы закрыть ящик. Как только уплотнение будет завершено, ящик автоматически откроется. Снимите герметичную пластину и поместите ее на холодный блок.Затем выключите герметик пластины. Для проведения ПЦР поместите герметичную пластину для сбора капель в ПЦР-машину с блоком 96 глубоких скважин. После завершения ПЦР включите устройство считывания капель и подключенный компьютер.Загрузите пластину с образцами после ПЦР в держатель пластины капельного считывателя. Удерживая крышку фольги на пластине для образцов, поместите крышку на верхнюю часть держателя и закрепите ее на месте с помощью черных зажимов. Далее, чтобы открыть крышку капельного считывателя, нажмите кнопку открытия/закрытия.Затем загрузите держатель пластины капельного считывателя с пластиной образца в камеру считывателя и надежно поместите его на магнитное основание. Нажмите кнопку открытия/закрытия еще раз, чтобы закрыть крышку. Откройте интерфейс аналитического программного обеспечения.Перейдите на вкладку Добавить пластину, нажмите кнопку Добавить пластину, а затем Настроить пластину. На вкладке Информация о пластине введите имя пластины, выберите Супермикс для зондов, No DUTP в раскрывающемся меню Supermix и введите имя файла в разделе Сохранить файл данных As.In вкладке Выбор скважины, выделите анализируемые скважины и нажмите включить выбранные скважины. Затем на вкладке Информация о скважине выберите скважины для аннотирования.Выберите Прямая количественная оценка в раскрывающемся меню Тип эксперимента. Затем заполните поля описание образца, тип образца и имя целевого объекта, а также при необходимости добавьте примечания к колодцам и/или заметки на пластине. Затем нажмите кнопку Применить.После завершения настройки пластины нажмите кнопку Начать запуск. Для анализа результатов выберите вкладку Анализ данных и откройте файл для анализа в меню Мои файлы данных. Затем перейдите на вкладку «Амплитуда 1D» для одноцветных экспериментов или вкладку «Амплитуда 2D» для двухцветных экспериментов.Далее выбираем скважины, требующие пороговых значений. Используйте инструмент Threshold Line Mode, чтобы вручную применить пороговое значение в свободном пространстве между положительной и отрицательной популяциями на амплитудном графике, гарантируя, что перекрестие расположено таким образом, что четыре популяции капель четко разделены. После применения порогового значения ко всем образцам экспортируйте результаты в виде CSV-файла для дальнейшего анализа, щелкнув вкладку Таблица данных Импорт/экспорт и выбрав Экспорт видимых данных в CSV.Введите подходящее имя файла и нажмите кнопку Сохранить. Процедуры ПЦР и считывания капель, используемые в этом протоколе, продемонстрировали наличие четко разделенных популяций положительных и отрицательных капель, как в fam, так и в шестнадцатеричных каналах. Популяции митохондриальной ДНК, положительные для обоих зондов, также можно отличить от одноклеточных лизатов.Этот метод также показал, что для образцов с делециями в митохондриальной ДНК присутствует смешанная популяция двойных положительных капель и капель, положительных только на неудаленную часть ДНК. Этот метод был успешно использован для подсчета числа копий митохондриальной ДНК на клетку в различных клетках млекопитающих, включая мышиные ооциты и первичные эмбриональные клетки мыши. Кроме того, в клетках с высокой делецией гетероплазмы популяция, положительная для одного зонда, была значительно больше, чем двойная положительная популяция.Однако в клетках с гетероплазмой с низкой делецией обе популяции были одинакового размера. Таким образом, точные результаты всегда гарантируют, что генерация капель была успешной и что пороговое значение было соответствующим образом применено с использованием 1D или 2D амплитудного вида. Неиспользуемый лизат может быть использован для других одноклеточных анализов, таких как пиросеквенирование, которое может измерять гетероплазму однонуклеотидного полиморфизма.Развитие этой методики позволило провести точные измерения числа копий митохондриальной ДНК и делеции гетероплазмы в отдельных клетках, что ранее было невозможно.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Измерение восходящей аорты жесткость<em&gt; В Vivo</em&gt; У мышей с помощью ультразвука

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Оценка стволовых клеток Недвижимость в человека рака яичников клеток с использованием много- и отдельных клеток на основе сферах Анализы

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Фосфор-31 спектроскопии магнитного резонанса: Прибор для измерения<em&gt; В Vivo</em&gt; Митохондриальной окислительное фосфорилирование потенциала в скелетных мышцах человека

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Роман диагностики в Ревизионное эндопротезирование: имплантата Sonication и мультиплексной полимеразной цепной реакции

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

На основе крови тест для обнаружения ROS1 и ОТСТАВКЕ стенограммы Fusion от циркулирующих рибонуклеиновой кислоты с использованием цифровой полимеразной цепной реакции

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Потока на основе цитометрии Assay для измерения митохондриальных мембранный потенциал в культивировании после гипоксии/реоксигенацию

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Оценка числа нефрона в целом почки использованием кислоты метод мацерации

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов в митохондриальном геноме методом пиросеквенирования

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Измерение толщины и функции диафрагмы с помощью ультразвука в месте оказания медицинской помощи

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...