Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
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Gracias al Dr. L Bozhilova por su asesoramiento sobre el análisis estadístico de los datos de PCR de generación de gotas. Gracias al Dr. H Zhang por proporcionar los ovocitos utilizados para generar datos en la Figura 3C y la Figura 4B. Este trabajo fue llevado a cabo por SPB en la Unidad de Biología Mitocondrial del Consejo de Investigación Médica (MC_UU_00015/9), Universidad de Cambridge, y financiado por una beca de investigación principal de Wellcome Trust en poder de PFC (212219 / Z / 18 / Z).

Todos los experimentos siguieron las pautas de ARRIVE y fueron aprobados por el Organismo de Revisión Ética de Bienestar Animal de la Universidad de Cambridge (AWERB).
NOTA: Todos los pasos de preparación de la muestra antes de la generación de gotitas deben realizarse en un área de trabajo limpia antes de la PCR, idealmente en un gabinete esterilizado por UV siempre que sea posible. El protocolo descrito aquí utiliza equipos específicos de PCR de generación de gotas (ver Tabla...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. 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L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. 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El protocolo descrito aquí es aplicable a una amplia gama de tipos de células y especies, además de los discutidos anteriormente, aunque la optimización cuidadosa de los nuevos diseños de ensayo será clave para garantizar que la precisión y la repetibilidad del método se mantengan cuando se aleje de las combinaciones de cebador / sonda previamente validadas. Cuando se trabaja con células individuales, es vital garantizar que la recolección de muestras se realice con la mayor precisión posible (por ejemplo, uti...

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es un pequeño (aprox. 16,5 Kb) genoma circular de ADN que reside en la matriz mitocondrial que codifica 37 genes, que comprende dos ARNr, 22 ARNt y 13 genes codificadores de proteínas1. A diferencia del genoma nuclear, que contiene una (haploide) o dos copias (diploides) de cada gen por célula, el ADNmt está presente en múltiples copias en las mitocondrias de cada célula, que van desde decenas de copias (por ejemplo, espermatocitos maduros) hasta cientos de miles de copias (por ejemplo, ovocitos)2,3. Una consecuencia de esta naturaleza de múltiples copias es que las mutaciones en el genoma del ADNmt, que pueden existir como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), deleciones o duplicaciones, pueden estar presentes en niveles variables en cualquier célula dada, lo que representa entre el 0% y el 100% de la población total de ADNmt de la célula. La existencia de genomas de ADNmt de tipo salvaje y mutantes en la misma célula se denomina heteroplasmia, y las mutaciones heteroplásmicas patógenas de ADNmt son una causa importante de enfermedad mitocondrial, con varios síndromes neurológicos comunes relacionados con mutaciones de ADNmt heteroplásmicas subyacentes4.
Dos parámetros clave que contribuyen a la probabilidad de que una mutación heteroplásmica del ADNmt cause enfermedad clínica son el nivel de heteroplasmia y el número de copias de ADNmt. Muchas mutaciones heteroplásmicas muestran un efecto umbral, con fenotipos bioquímicos y clínicos que solo se manifiestan por encima de un cierto nivel de heteroplasmia, típicamente alrededor del 80%5, y posteriormente empeoran a medida que la heteroplasmia aumenta aún más4. Sin embargo, también es importante considerar el número de copias de ADNmt presentes en la célula, ya que esto influirá en el número de genomas de ADNmt de tipo salvaje (es decir, "sanos") que están presentes en un nivel de heteroplasmia dado. Estudios en pacientes con enfermedad mitocondrial han destacado la importancia de esta interacción entre la heteroplasmia y el número de copias5,6, y Filograna et al. informaron recientemente un aumento en el número de copias de ADNmt aliviando los síntomas a pesar de la heteroplasmia inalterada en un modelo de ratón de enfermedad mitocondrial7.
Si bien se ha hecho mucho en los últimos años para mejorar la comprensión de la patogénesis y la transmisión de enfermedades causadas por la heteroplasmia de ADNmt, la mayor parte de este trabajo se ha realizado a nivel de tejidos en lugar de células, comparando los niveles medios de heteroplasmia tisular y las mediciones del número de copias adquiridas a partir de biopsias de tejido a granel y muestras de sangre. Algunas técnicas bien establecidas, como la microdisección por captura láser, permiten tales mediciones a nivel celular 8,9; sin embargo, la reciente explosión de métodos de análisis de células individuales de alto rendimiento, o los llamados "Single-cell Omics"10, ha creado un requisito para métodos que puedan medir con precisión estos parámetros cruciales de ADNmt a nivel de una sola célula.
El método de PCR de generación de gotas aprovecha los avances recientes en la tecnología microfluídica para mejorar los métodos existentes de cuantificación de concentraciones desconocidas de ADN a través de la amplificación por PCR de amplicones diana específicos en la muestrade ADN 11. A diferencia de la qPCR, donde el ADN de la muestra se amplifica en una sola reacción, con la tasa relativa de acumulación del producto de PCR actuando como lectura, este método divide la muestra inicial en miles de gotitas individuales, compartimentando así las moléculas de ADN de la muestra en reacciones espacialmente separadas12. La reacción de PCR posterior procede en cada gota individual, y el producto de PCR solo se acumula en gotitas que contienen el ADN objetivo. El resultado de esta reacción es una salida digital en forma de un conjunto de gotitas que contienen una copia del ADN objetivo y el producto de PCR amplificado, o no contienen ADN objetivo. Usando sondas de ADN fluorescente o un tinte de unión de ADN de doble cadena (ds), se pueden contar las gotas que contienen producto amplificado, y la proporción de gotas "positivas" a "negativas" se puede usar para calcular el número absoluto de copias de ADN que estaban presentes en la muestra inicial. Esta medición absoluta, a diferencia de la medición relativa adquirida de una reacción de qPCR, es el factor clave que permite utilizar esta metodología para la medición precisa del número de copias de ADNmt y la heteroplasmia en células individuales11, y varios estudios recientes ya han utilizado la tecnología de PCR de generación de gotas para este propósito13,14 . Este artículo presenta un método para medir el número de copias de ADNmt y la heteroplasmia de deleción en células individuales de tejido humano y de ratón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

El ADN mitocondrial (mt) de mamíferos es una molécula de ADN intramitocondrial pequeña, circular, de doble cadena, que codifica 13 subunidades de la cadena de transporte de electrones. A diferencia del genoma nuclear diploide, la mayoría de las células contienen muchas más copias de ADNmt, que van desde menos de 100 a más de 200.000 copias dependiendo del tipo de célula. El número de copias de ADNmt se utiliza cada vez más como biomarcador para una serie de afecciones y enfermedades degenerativas relacionadas con la edad y, por lo tanto, la medición precisa del número de copias de ADNmt se está convirtiendo en una herramienta clave tanto en entornos de investigación como de diagnóstico. Las mutaciones en el ADNmt, que a menudo ocurren como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o deleciones, pueden existir en todas las copias del ADNmt dentro de la célula (denominada homoplasmia) o como una mezcla de copias mutadas y WT de ADNmt (denominadas heteroplasmia). Las mutaciones heteroplásmicas de ADNmt son una causa importante de patología mitocondrial clínica, ya sea en enfermedades raras o en un número creciente de enfermedades comunes de aparición tardía, como la enfermedad de Parkinson. La determinación del nivel de heteroplasmia presente en las células es un paso crítico en el diagnóstico de enfermedades mitocondriales raras y en la investigación dirigida a comprender los trastornos comunes de aparición tardía donde las mitocondrias pueden desempeñar un papel. El número de copias de ADNmt y la heteroplasmia se han medido tradicionalmente mediante ensayos cuantitativos (q)PCR o secuenciación profunda. Sin embargo, la reciente introducción de la tecnología ddPCR ha proporcionado un método alternativo para medir ambos parámetros. Ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes, incluida la capacidad de medir el número absoluto de copias de ADNmt y la sensibilidad suficiente para realizar mediciones precisas de células individuales incluso con números bajos de copias. Aquí se presenta un protocolo detallado que describe la medición del número de copias de ADNmt en células individuales utilizando ddPCR, denominado PCR de generación de gotas en adelante, con la opción de medición simultánea de heteroplasmia en células con deleciones de ADNmt. También se discute la posibilidad de ampliar este método para medir la heteroplasmia en células con SNP de ADNmt.

Después de la generación de gotas, una capa transparente de gotas opacas es visible flotando sobre la fase petrolera en cada pozo (Figura 1B). La formación de gotitas puede verse afectada negativamente por la presencia de detergentes en el lisado de entrada cuando se realizan experimentos en células individuales. Utilizando el protocolo de lisis descrito en 2.1.2., se alcanzan rutinariamente rendimientos de gotitas por encima del nivel recomendado de 10.000, a pesar de la presencia de un...

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Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Este protocolo se puede utilizar para medir con precisión el número de copias de ADN mitocondrial presentes en células individuales y el nivel de ciertos tipos de mutación del ADN mitocondrial. Los métodos anteriores pueden realizar con precisión estas mediciones en muestras de tejido que contienen muchas células. La principal ventaja de esta técnica es que podemos hacer las mismas mediciones en células individuales.Este método es particularmente útil para aquellos que estudian las mitocondrias y tendrá amplias aplicaciones en este campo. El aislamiento efectivo y la lisis de células individuales es clave para esta técnica. La experiencia previa con la clasificación de células individuales sería muy útil.Para comenzar, prepare la mezcla maestra para la PCR sin la muestra de ADN en hielo, como se describe en el texto. Después del vórtice brevemente, distribuya el volumen requerido de la mezcla maestra preparada a cada pocillo de una placa de 96 pocillos PCR de generación de gotas, organizando las muestras en columnas completas. A continuación, agregue la mezcla maestra a cualquier pozo vacío en columnas incompletas para usarlas como controles que no sean de plantilla.Luego agregue el ADN de entrada a cada pozo para hacer que el volumen total de cada pozo sea de 22 microlitros. Selle la placa con un sello adhesivo y colóquela en un agitador a 2000 RPM durante un minuto. Luego centrifugar la placa a 1000 veces G durante un minuto a cuatro grados centígrados antes de colocarla en hielo.Para la generación de gotas, primero asegúrese de que el generador de gotas esté encendido y verifique si una botella de aceite generador de gotas está cargada en la posición E de la plataforma de instrumentos. A continuación, haga clic en Configurar placa de muestra en la pantalla táctil. Después de seleccionar todas las columnas de la placa de muestra que contienen las muestras o espacios en blanco, haga clic en Aceptar para confirmar la configuración de la placa.A continuación, cargue los cartuchos del generador de gotas en la posición B en la plataforma de instrumentos para que todas las luces se vuelvan verdes y coloque un canal de residuos de punta vacío en la posición C. Luego cargue las cajas de puntas del filtro con las tapas retiradas para colocar D en el escenario de instrumentos para que todas las luces se vuelvan verdes. A continuación, retire el sello adhesivo antes de cargar la placa de muestra para colocar F de la plataforma de instrumentos para que la luz se vuelva verde. También cargue una placa vacía de recolección de gotas de 96 pocillos colocada en un bloque frío, preenfriada a menos 20 grados centígrados, en la posición G para que la luz se vuelva verde.Haga clic en Iniciar generación de gotas en la pantalla táctil del instrumento y la tapa del generador de gotas se cerrará automáticamente. Una vez que se complete la generación de gotas, verifique visualmente la placa de recolección de muestras para confirmar que hay una capa de emulsión de gotas por encima de la fase de aceite en cada pozo. A continuación, encienda el sellador de placas y ajuste la temperatura a 180 grados centígrados y el tiempo de sellado a cinco segundos.Permita que la máquina alcance la temperatura de funcionamiento. Luego coloque la placa de recolección de muestras en el soporte de la placa del sellador de placas y coloque un sello de aluminio nuevo en la parte superior de la placa con la línea roja hacia arriba. Cuando el sellador de placas haya alcanzado su temperatura de funcionamiento, pulse expulsar en la pantalla táctil del instrumento.Después de colocar el soporte de la placa en el cajón del sellador de placas, presione el sello para cerrar el cajón. Una vez que se complete el sellado, el cajón se abrirá automáticamente. Retire la placa sellada y colóquela sobre el bloque frío.Luego apague el sellador de placas. Para ejecutar la PCR, coloque la placa de recolección de gotas sellada en una máquina de PCR con un bloque de pozo profundo de 96. Una vez completada la PCR, encienda el lector de gotas y la computadora conectada.Cargue la placa con las muestras post-PCR en el soporte de la placa del lector de gotas. Mientras mantiene la tapa de aluminio en la placa de muestra, coloque la cubierta en la parte superior del soporte y asegúrela en su lugar con clips de bloqueo negros. A continuación, para abrir la tapa del lector de gotas, presione el botón de abrir/cerrar.Luego cargue el soporte de la placa del lector de gotas con la placa de muestra en la cámara del lector y colóquela de forma segura sobre la base magnética. Vuelva a pulsar el botón de apertura/cierre para cerrar la tapa. Abra la interfaz del software de análisis.Seleccione la pestaña Agregar placa, haga clic en Agregar placa y, a continuación, en Configurar placa. En la pestaña Información de placa, ingrese un nombre de placa, seleccione Supermix for Probes, No DUTP en el menú desplegable Supermix e ingrese un nombre de archivo en Save Data File As.In la pestaña Well Selection (Selección de pozos), resalte los pozos que se analizarán y haga clic en Include Selected Wells (Incluir pozos seleccionados). Luego, en la pestaña Información del pozo, seleccione los pozos que desea anotar.Seleccione Cuantificación directa en el menú desplegable Tipo de experimento. A continuación, rellene los cuadros Descripción de muestra, Tipo de muestra y Nombre de destino, y agregue notas de pozo o notas de placa según sea necesario. A continuación, haga clic en Aplicar.Una vez completada la configuración de la placa, haga clic en Iniciar ejecución. Para el análisis de resultados, seleccione la ficha Análisis de datos y abra el archivo que se va a analizar en el menú Mis archivos de datos. A continuación, haga clic en la ficha Amplitud 1D para experimentos de un solo color o en la ficha Amplitud 2D para experimentos de dos colores.A continuación, seleccione los pozos que requieren umbral. Utilice la herramienta Modo de línea de umbral para aplicar manualmente el umbral en el espacio libre entre las poblaciones positiva y negativa en la gráfica de amplitud, asegurándose de que la cruz se coloque de tal manera que las cuatro poblaciones de gotas estén claramente separadas. Una vez aplicado el umbral para todas las muestras, exporte los resultados como un archivo csv para su posterior análisis haciendo clic en la pestaña Tabla de datos, Importar/Exportar y seleccionando Exportar datos visibles a CSV.Introduzca un nombre de archivo adecuado y haga clic en Guardar. Los procedimientos de PCR y lectura de gotitas utilizados en este protocolo demostraron la presencia de poblaciones claramente separadas de gotitas positivas y negativas, tanto en los canales fam como hexadecimal. Las poblaciones de ADN mitocondrial positivas para ambas sondas también podrían distinguirse de los lisados unicelulares.Este método también mostró que para las muestras con deleciones en el ADN mitocondrial, está presente una población mixta de gotitas doblemente positivas y gotitas positivas solo para la porción no eliminada del ADN. Este método se ha utilizado con éxito para contar el número de copias de ADN mitocondrial por célula en una variedad de células de mamíferos, incluidos ovocitos de ratón y células embrionarias primarias de ratón. Además, en células con heteroplasmia de alta deleción, se encontró que la población positiva para una sola sonda era significativamente mayor que la población doble positiva.Sin embargo, en células con heteroplasmia de baja deleción, ambas poblaciones eran de tamaño similar. Por lo tanto, los resultados precisos siempre aseguran que la generación de gotas haya sido exitosa y que el umbral se haya aplicado adecuadamente utilizando la vista de amplitud 1D o 2D. El lisado no utilizado se puede usar para otros ensayos de células individuales, como la pirosecuenciación, que puede medir la heteroplasmia de polimorfismo de nucleótido único.El desarrollo de esta técnica nos ha permitido realizar mediciones precisas del número de copias de ADN mitocondrial y la heteroplasmia de deleción en células individuales, lo que antes no era posible.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Medición ascendente aórtica Rigidez<em&gt; En Vivo</em&gt; En ratones usando ultrasonido

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Investigación

Medicina

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Evaluación de las propiedades de células madre en células de carcinoma de ovario humano utilizando multi e individuales basados ​​en células Esferas ensayos

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir<em&gt; En Vivo</em&gt; Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Nuevos diagnósticos en artroplastia de revisión: reacción en cadena múltiplex de polimerasa y sonicación del implante

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Una base de sangre de prueba para la detección de ROS1 y RET transcripciones de la fusión de circulación de ácido ribonucleico con reacción en cadena de polimerasa Digital

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Un análisis basado en la citometría de flujo para medir el potencial de membrana mitocondrial en miocitos cardiacos después de hipoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Estimación del número de Nefrona en riñón entera utilizando el método de maceración ácida

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Genotipado de polimorfismos de nucleótido único en el genoma mitocondrial mediante pirosecuenciación

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Medición del grosor y la función del diafragma mediante ultrasonido en el punto de atención

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...

Enhancing Stroke Rehabilitation with Virtual Reality-Based Occupational Training

Cognitive Function and Upper Limb Rehabilitation Training Post-Stroke Using a Digital Occupational Training System

Author Spotlight: Rehabilitation of Stroke Patients With a Digital Occupational Training System

Entrenamiento de la función cognitiva y la rehabilitación de las extremidades superiores después de un accidente cerebrovascular mediante un sistema de entrenamiento ocupacional digital