Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Tack till Dr. L Bozhilova för råd om statistisk analys av droppgenerering PCR-data. Tack till Dr. H Zhang för att tillhandahålla de oocyter som används för att generera data i figur 3C och figur 4B. Detta arbete utfördes av SPB vid Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), University of Cambridge, och finansierades av ett Wellcome Trust Principal Research Fellowship som innehas av PFC (212219/Z/18/Z).

Alla experiment följde ARRIVE-riktlinjerna och godkändes av University of Cambridge Animal Welfare Ethical Review Body (AWERB).
OBS: Alla provberedningssteg före droppgenerering måste utföras i ett rent arbetsområde före PCR, helst i ett UV-steriliserat skåp där det är möjligt. Protokollet som beskrivs här använder specifik PCR-utrustning för droppgenerering (se materialförteckning), och även om den allmänna metoden bör vara tillämplig på andra system, reko...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription,+mass+and+respiratory+activity.">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--&gt;G.">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A--&gt;G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases.">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146 (2013).</li><li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse.">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells:+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues.">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li><li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA(Lys)+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+(MERRF).">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR.">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li><li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA:+age,+fiber+type,+and+mutation-induced+changes.">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li><li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution.">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li><li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control.">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li><li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells.">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li><li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis.">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li><li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms.">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, 2369-2378 (2013).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions.">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li><li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation.">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression.">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li><li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases.">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här är tillämpligt på ett brett spektrum av celltyper och arter utöver de som diskuterats ovan, även om noggrann optimering av nya analysdesigner kommer att vara nyckeln till att säkerställa att metodens noggrannhet och repeterbarhet bibehålls när man går bort från tidigare validerade primer / sondkombinationer. Vid arbete med enstaka celler är det viktigt att se till att provtagningen utförs så exakt som möjligt (t.ex. med hjälp av stränga encellsparametrar vid sortering av cel...

Mitokondriellt (mt) DNA från däggdjur är ett litet (ca 16,5 Kb), cirkulärt DNA-genom som finns i mitokondriell matris som kodar för 37 gener, bestående av två rRNA, 22 tRNA och 13 proteinkodande gener1. Till skillnad från kärngenomet, som innehåller en (haploid) eller två (diploida) kopior av varje gen per cell, finns mtDNA i flera kopior i mitokondrierna i varje cell, allt från tiotals kopior (t.ex. mogna spermatocyter) till hundratusentals kopior (t.ex. oocyter)2,3. En konsekvens av denna multi-copy natur är att mutationer i mtDNA-genomet, som kan existera som en-nukleotidpolymorfismer (SNP), deletioner eller duplikationer, kan vara närvarande på olika nivåer i en given cell, som utgör allt från 0% till 100% av cellens totala mtDNA-population. Förekomsten av vilda och mutanta mtDNA-genom i samma cell kallas heteroplasmi, och patogena heteroplasmiska mtDNA-mutationer är en viktig orsak till mitokondriell sjukdom, med flera vanliga neurologiska syndrom kopplade till underliggande heteroplasmiska mtDNA-mutationer4.
Två viktiga parametrar som bidrar till sannolikheten för att en heteroplasmisk mtDNA-mutation orsakar klinisk sjukdom är heteroplasminivån och mtDNA-kopieringsnumret. Många heteroplasmiska mutationer uppvisar en tröskeleffekt, där biokemiska och kliniska fenotyper bara blir uppenbara över en viss heteroplasminivå, vanligtvis cirka 80%5, och därefter förvärras när heteroplasmin ökar ytterligare4. Det är dock också viktigt att överväga antalet kopior av mtDNA som finns i cellen, eftersom detta kommer att påverka antalet vilda (dvs. "friska") mtDNA-genom som finns på en given heteroplasminivå. Studier på patienter med mitokondriell sjukdom har belyst vikten av detta samspel mellan heteroplasmi och kopia nummer5,6, och Filograna et al. rapporterade nyligen en ökning av mtDNA-kopieringsantalet som lindrar symtomen trots oförändrad heteroplasmi i en musmodell av mitokondriell sjukdom7.
Även om mycket har gjorts under de senaste åren för att förbättra förståelsen för patogenesen och överföringen av sjukdomar orsakade av mtDNA-heteroplasmi, har det mesta av detta arbete utförts på vävnadsnivå snarare än celler, genom att jämföra genomsnittliga vävnadsheteroplasminivåer och kopieringsnummermätningar som förvärvats från bulkvävnadsbiopsier och blodprover. Vissa väletablerade tekniker, såsom laserfångande mikrodissektion, möjliggör sådana mätningar på cellnivå 8,9; Den senaste explosionen av encellsanalysmetoder med hög genomströmning, eller så kallad "Single-cell Omics"10, har dock skapat ett krav på metoder som exakt kan mäta dessa avgörande mtDNA-parametrar på encellsnivå.
Droppgenereringen PCR-metoden utnyttjar de senaste framstegen inom mikrofluidisk teknik för att förbättra befintliga metoder för att kvantifiera okända DNA-koncentrationer via PCR-förstärkning av specifika målamplikoner i prov-DNA11. Till skillnad från qPCR, där prov-DNA förstärks i en enda reaktion, med den relativa ackumuleringshastigheten för PCR-produkt som fungerar som avläsning, delar denna metod det ursprungliga provet i tusentals enskilda droppar och delar därmed upp prov-DNA-molekylerna i rumsligt separata reaktioner12. Den efterföljande PCR-reaktionen fortsätter i varje enskild droppe, med PCR-produkten som endast ackumuleras i droppar som innehåller mål-DNA. Resultatet av denna reaktion är en digital utgång i form av en pool av droppar som antingen innehåller en kopia av mål-DNA och förstärkt PCR-produkt eller inte innehåller mål-DNA. Med hjälp av fluorescerande DNA-sonder eller ett dubbelsträngat (ds) DNA-bindande färgämne kan dropparna som innehåller förstärkt produkt räknas, och förhållandet mellan "positiva" och "negativa" droppar kan användas för att beräkna det absoluta antalet DNA-kopior som fanns i det ursprungliga provet. Denna absoluta mätning, i motsats till den relativa mätningen som erhållits från en qPCR-reaktion, är nyckelfaktorn som gör att denna metod kan användas för noggrann mätning av mtDNA-kopieringsnummer och heteroplasmi i enstaka celler11, och flera nyligen genomförda studier har redan använt droppgenerering PCR-teknik för detta ändamål13,14 . Denna artikel presenterar en metod för att mäta mtDNA-kopieringsnummer och deletionsheteroplasmi i enskilda celler från både mänsklig och musvävnad.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

Däggdjurens mitokondriella (mt) DNA är en liten, cirkulär, dubbelsträngad, intra-mitokondriell DNA-molekyl som kodar för 13 underenheter i elektrontransportkedjan. Till skillnad från det diploida kärngenomet innehåller de flesta celler många fler kopior av mtDNA, allt från mindre än 100 till över 200 000 kopior beroende på celltyp. MtDNA-kopieringsnummer används alltmer som en biomarkör för ett antal åldersrelaterade degenerativa tillstånd och sjukdomar, och därmed blir noggrann mätning av mtDNA-kopieringsnumret ett viktigt verktyg i både forsknings- och diagnostikinställningar. Mutationer i mtDNA, som ofta förekommer som enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP) eller deletioner, kan antingen existera i alla kopior av mtDNA i cellen (kallad homoplasmi) eller som en blandning av muterade och WT mtDNA-kopior (kallad heteroplasmi). Heteroplasmiska mtDNA-mutationer är en viktig orsak till klinisk mitokondriell patologi, antingen i sällsynta sjukdomar eller i ett växande antal vanliga sena sjukdomar som Parkinsons sjukdom. Att bestämma nivån av heteroplasmi som finns i celler är ett kritiskt steg i diagnosen av sällsynta mitokondriella sjukdomar och i forskning som syftar till att förstå vanliga sena störningar där mitokondrier kan spela en roll. MtDNA-kopieringsnummer och heteroplasmi har traditionellt mätts med kvantitativa (q) PCR-baserade analyser eller djup sekvensering. Den senaste introduktionen av ddPCR-teknik har dock gett en alternativ metod för att mäta båda parametrarna. Det erbjuder flera fördelar jämfört med befintliga metoder, inklusive möjligheten att mäta absolut mtDNA-kopieringsnummer och tillräcklig känslighet för att göra exakta mätningar från enskilda celler även vid låga kopieringsnummer. Här presenteras ett detaljerat protokoll som beskriver mätningen av mtDNA-kopieringsnummer i enskilda celler med ddPCR, hädanefter kallad droppgenerering PCR, med möjlighet till samtidig mätning av heteroplasmi i celler med mtDNA-deletioner. Möjligheten att utvidga denna metod för att mäta heteroplasmi i celler med mtDNA SNP diskuteras också.

Efter droppgenerering syns ett tydligt lager av ogenomskinliga droppar flyta ovanpå oljefasen i varje brunn (figur 1B). Droppbildning kan påverkas negativt av närvaron av tvättmedel i ingångslysatet vid experiment på enstaka celler. Med hjälp av lysprotokollet som beskrivs i 2.1.2 uppnås dropputbyten över den rekommenderade nivån på 10 000 rutinmässigt, trots att det finns en liten restmängd av TWEEN-20 i det slutliga provet (figur 1C). Men med andr...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Här presenterar vi ett protokoll för mätning av absolut mitokondriellt (mt)DNA-kopieringsnummer och mtDNA-deletion heteroplasminivåer i enskilda celler.

Mätning av encells mitokondriellt DNA-kopieringsnummer och heteroplasmi med hjälp av digital dropppolymeraskedjereaktion

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Detta protokoll kan användas för att noggrant mäta antalet kopior av mitokondriellt DNA som finns i enskilda celler och nivån på vissa typer av mitokondriell DNA-mutation. Tidigare metoder kan exakt göra dessa mätningar i vävnadsprover som innehåller många celler. Den största fördelen med denna teknik är att vi kan göra samma mätningar i enskilda celler.Denna metod är särskilt användbar för dem som studerar mitokondrier och kommer att ha breda tillämpningar inom detta område. Effektiv isolering och lys av enskilda celler är nyckeln till denna teknik. Tidigare erfarenhet av encellssortering skulle vara till stor hjälp.För att börja, förbered masterblandningen för PCR utan prov-DNA på is, som beskrivs i texten. Efter virvelning kort, fördela den erforderliga volymen av den beredda huvudblandningen till varje brunn i en droppgenerering PCR 96-brunnsplatta och ordna proverna i hela kolumner. Lägg sedan till huvudmixen i en tom brunn i ofullständiga kolumner för att använda dem som icke-mallkontroller.Tillsätt sedan ingångs-DNA till varje brunn för att göra den totala volymen för varje brunn 22 mikroliter. Försegla plattan med en självhäftande platttätning och placera den på en shaker vid 2000 rpm i en minut. Centrifugera sedan plattan vid 1000 gånger G i en minut vid fyra grader Celsius innan den placeras på is.För droppgenerering, se först till att droppgeneratorn är påslagen och kontrollera om en flaska droppgenererande olja är laddad till position E på instrumentdäcket. Klicka sedan på Konfigurera provplatta på pekskärmen. När du har valt alla kolumner på provplattan som innehåller proverna eller ämnena klickar du på Okej för att bekräfta plattkonfigurationen.Ladda sedan droppgeneratorpatronerna för att placera B på instrumentdäcket så att alla lampor blir gröna och placera ett tomt spetsavfallstråg i läge C.Ladda sedan filterspetslådor med lock borttagna till läge D på instrumentsteget så att alla lampor blir gröna. Ta sedan bort den självhäftande tätningen innan du laddar provplattan till läge F på instrumentdäcket så att ljuset blir grönt. Ladda också en tom droppuppsamling 96-brunnsplatta placerad i ett kallt block, förkylt vid minus 20 grader Celsius, vid läge G så att ljuset blir grönt.Klicka på Starta droppgenerering på instrumentets pekskärm så stängs droppgeneratorns lock automatiskt. När droppgenereringen är klar, kontrollera provuppsamlingsplattan visuellt för att bekräfta att ett droppemulsionsskikt finns ovanför oljefasen i varje brunn. Slå sedan på plattförseglaren och ställ in temperaturen på 180 grader Celsius och försegla tiden till fem sekunder.Låt maskinen nå driftstemperaturen. Placera sedan provuppsamlingsplattan på plåthållaren på plåtförseglaren och placera en ny folietätning på toppen av plattan med den röda linjen uppåt. När plattförseglaren har nått sin driftstemperatur, tryck på mata ut på instrumentets pekskärm.När du har placerat platthållaren i lådan på plattförseglaren, tryck på förseglingen för att stänga lådan. När tätningen är klar öppnas lådan automatiskt. Ta bort den förseglade plattan och placera den på det kalla blocket.Stäng sedan av plattförseglaren. För att köra PCR, placera den förseglade droppuppsamlingsplattan i en PCR-maskin med ett 96 djupbrunnsblock. När PCR är klar, slå på droppläsaren och den anslutna datorn.Ladda plattan med post-PCR-proverna i droppläsarplatthållaren. Medan du håller folielocket på provplattan, placera locket på toppen av hållaren och säkra det på plats med svarta låsklämmor. För att öppna droppläsarlocket trycker du sedan på knappen öppna / stäng.Ladda sedan droppläsarplatthållaren med provplattan i läsarkammaren och placera den ordentligt på magnetbasen. Tryck på öppna/stäng-knappen igen för att stänga locket. Öppna analysprogramvarans gränssnitt.Välj fliken Lägg till plåt, klicka på Lägg till plåt och sedan Konfigurera plåt. På fliken Plåtinformation anger du ett plåtnamn, väljer Supermix för prober, Ingen DUTP från rullgardinsmenyn Supermix och anger ett filnamn under Spara datafil As.In fliken Brunnsval, markerar de brunnar som ska analyseras och klickar på Inkludera valda brunnar. På fliken Brunnsinformation väljer du sedan de brunnar som ska kommenteras.Välj Direkt kvantifiering i listrutan Experimenttyp. Fyll sedan i rutorna för exempelbeskrivning, provtyp och målnamn och lägg till brunnsanteckningar och eller plåtanteckningar efter behov. Klicka sedan på Apply.När plåtkonfigurationen är klar klickar du på Starta körning. För resultatanalys väljer du fliken Dataanalys och öppnar filen som ska analyseras på menyn Mina datafiler. Klicka sedan på fliken 1D-amplitud för enfärgsexperiment eller fliken 2D-amplitud för tvåfärgsexperiment.Välj sedan de brunnar som kräver tröskel. Använd verktyget Tröskellinjeläge för att manuellt tillämpa tröskelvärdet i det fria utrymmet mellan de positiva och negativa populationerna i amplituddiagrammet och se till att hårkorset placeras så att de fyra dropppopulationerna är tydligt åtskilda. När tröskelvärdet har tillämpats för alla exempel exporterar du resultaten som en csv-fil för vidare analys genom att klicka på fliken Datatabell, Importera/exportera, och välja Exportera synliga data till CSV.Ange ett lämpligt filnamn och klicka på Spara. PCR- och droppläsningsförfarandena som används i detta protokoll visade närvaron av tydligt separerade populationer av positiva och negativa droppar, både i fam- och hexkanalerna. Mitokondriella DNA-populationer som är positiva för båda sonderna kan också särskiljas från encellslysater.Denna metod visade också att för prover med deletioner i mitokondriellt DNA finns en blandad population av dubbelpositiva droppar och droppar som är positiva för endast den icke-raderade delen av DNA: t. Denna metod har framgångsrikt använts för att räkna mitokondriellt DNA-kopieringsnummer per cell i en mängd olika däggdjursceller, inklusive musoocyter och primära musembryonala celler. I celler med heteroplasma med hög deletionsplasma visade sig dessutom populationen positiv för en enda sond vara signifikant större än den dubbelpositiva populationen.Men i celler med heteroplasmi med låg deletion var båda populationerna av liknande storlek. Så exakta resultat säkerställer alltid att droppgenereringen har lyckats och att tröskelvärdet har tillämpats på lämpligt sätt med hjälp av 1D- eller 2D-amplitudvyn. Oanvänd lysat kan användas för andra encellsanalyser, såsom pyrosekvensering, som kan mäta heteroplasmi med enkel nukleotidpolymorfism.Utvecklingen av denna teknik har gjort det möjligt för oss att göra noggranna mätningar av mitokondriellt DNA-kopieringsnummer och radering heteroplasmi i enskilda celler, vilket tidigare inte var möjligt.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Mätning Stigande Aorta Styvhet<em&gt; In Vivo</em&gt; I möss med ultraljud

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Utvärdering av stamcells Fastigheter i Human ovarialkarcinomceller Använda Multi och enda cell-baserade Spheres Analyser

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31-magnetisk resonansspektroskopi: ett verktyg för att mäta<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial oxidativ fosforylering Kapacitet i human skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Romanen diagnostik i Revision artroplastik: implantat ultraljudsbehandling och Multiplex Polymerase Chain Reaction

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

En blod-baserat Test för påvisande av ROS1 och RET Fusion avskrifter från cirkulerande ribonukleinsyra använder digitala Polymerase Chain Reaction

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Ett flöde flödescytometri-baserad analys för att mäta mitokondriella membranet Potential i hjärt myocyter efter hypoxi/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Uppskattning av Nephron antal i hela njuren med hjälp av Acid maceration metod

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Genotypning av enstaka nukleotidpolymorfismer i mitokondriellt genom pyrosequencing

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Mätning av membrantjocklek och funktion med hjälp av Point-of-Care ultraljud

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...