Name: measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Dr. L Bozhilova'ya damlacık üretimi PCR verilerinin istatistiksel analizi konusunda tavsiyeleriniz için teşekkür ederiz. Dr. H Zhang'a, Şekil 3C ve Şekil 4B'de veri üretmek için kullanılan oositleri sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cambridge Üniversitesi Tıbbi Araştırma Konseyi Mitokondriyal Biyoloji Birimi'nde (MC_UU_00015 / 9) SPB tarafından yürütülmüş ve PFC (212219 / Z / 18 / Z) tarafından düzenlenen Wellcome Trust Principal Research Fellowship tarafından finanse edilmiştir.

Tüm deneyler ARRIVE yönergelerini takip etti ve Cambridge Üniversitesi Hayvan Refahı Etik İnceleme Organı (AWERB) tarafından onaylandı.
NOT: Damlacık oluşturmadan önceki tüm numune hazırlama adımları, temiz bir PCR öncesi çalışma alanında, ideal olarak mümkün olduğunda UV sterilize edilmiş bir kabinde gerçekleştirilmelidir. Burada açıklanan protokol, belirli damlacık üretimi PCR ekipmanı kullanır ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve genel yöntemin...

<ol>
	<li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+genome:+structure,+transcription,+translation+and+replication.">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li><li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility.">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li><li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription,+mass+and+respiratory+activity.">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li><li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy:+implications+for+human+health+and+disease.">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li><li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--&gt;G.">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A--&gt;G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases.">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146 (2013).</li><li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse.">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells:+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues.">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li><li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA(Lys)+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+(MERRF).">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR.">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li><li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA:+age,+fiber+type,+and+mutation-induced+changes.">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li><li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution.">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li><li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control.">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li><li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells.">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li><li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis.">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li><li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms.">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, 2369-2378 (2013).</li><li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+(second+edition).">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li><li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes.">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li><li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions.">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186 (2016).</li><li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions.">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li><li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation.">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G&amp;T-seq.">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&amp;T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li><li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics.">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li><li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species.">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li><li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression.">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li><li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases.">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+Technology+Review.">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li><li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane.">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative,+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care.">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).</li></ol>

Burada açıklanan protokol, yukarıda tartışılanlara ek olarak çok çeşitli hücre tipleri ve türleri arasında uygulanabilir, ancak yeni tahlil tasarımlarının dikkatli optimizasyonu, daha önce doğrulanmış primer / prob kombinasyonlarından uzaklaşırken yöntemin doğruluğunun ve tekrarlanabilirliğinin korunmasını sağlamak için anahtar olacaktır. Tek hücrelerle çalışırken, elde edilen sonuçların tek tek hücrelerinkileri gerçekten yansıttığından emin olmak için numune toplamanın mümk...

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, iki rRNA, 22 tRNA ve 13 protein kodlayan gen 1'den oluşan 37 geni kodlayan mitokondriyal matriste bulunan küçük (yaklaşık 16.5 Kb), dairesel bir DNA genomudur. Hücre başına her genin bir (haploid) veya iki (diploid) kopyasını içeren nükleer genomun aksine, mtDNA, her hücrenin mitokondrisinde, onlarca kopyadan (örneğin, olgun spermatositler) yüz binlerce kopyaya (örneğin, oositler) kadar değişen çoklu kopyalarda bulunur2,3. Bu çok kopyalı doğanın bir sonucu, mtDNA genomundaki tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), delesyonlar veya duplikasyonlar olarak var olabilen mutasyonların, herhangi bir hücrede değişen seviyelerde bulunabilmesidir ve hücrenin toplam mtDNA popülasyonunun% 0 ila% 100'ünü oluşturur. Aynı hücrede vahşi tip ve mutant mtDNA genomlarının varlığı heteroplazmi olarak adlandırılır ve patojenik heteroplazmik mtDNA mutasyonları, altta yatan heteroplazmik mtDNA mutasyonlarına bağlı birkaç yaygın nörolojik sendromla mitokondriyal hastalığın önemli bir nedenidir4.
Klinik hastalığa neden olan heteroplazmik mtDNA mutasyonu olasılığına katkıda bulunan iki anahtar parametre, heteroplazmi seviyesi ve mtDNA kopya sayısıdır. Birçok heteroplazmik mutasyon bir eşik etkisi gösterir, biyokimyasal ve klinik fenotipler sadece belirli bir heteroplazmi seviyesinin üzerinde, tipik olarak% 80 civarında5 belirginleşir ve daha sonra heteroplazmi daha da arttıkça kötüleşir4. Bununla birlikte, hücrede bulunan mtDNA'nın kopyalarının sayısını da dikkate almak önemlidir, çünkü bu, belirli bir heteroplazmi seviyesinde bulunan vahşi tip (yani 'sağlıklı') mtDNA genomlarının sayısını etkileyecektir. Mitokondriyal hastalık hastalarında yapılan çalışmalar, heteroplazmi ile kopya sayısı5,6 arasındaki bu etkileşimin önemini vurgulamıştır ve Filograna ve ark. yakın zamanda, mitokondriyal hastalığın bir fare modelinde değişmemiş heteroplazmiye rağmen semptomları hafifleten mtDNA kopya sayısında bir artış olduğunu bildirmiştir7.
Son yıllarda mtDNA heteroplazmisinin neden olduğu hastalıkların patogenezi ve iletiminin anlaşılmasını geliştirmek için çok şey yapılmış olsa da, bu çalışmanın çoğu, ortalama doku heteroplazmi seviyelerini ve toplu doku biyopsilerinden ve kan örneklerinden elde edilen kopya sayısı ölçümlerini karşılaştırarak, hücrelerden ziyade dokular düzeyinde gerçekleştirilmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi bazı köklü teknikler, hücresel düzeyde bu tür ölçümlere izin verir 8,9; Bununla birlikte, yüksek verimli tek hücreli analiz yöntemlerinin veya "Tek Hücreli Omics"10 olarak adlandırılan son patlaması, bu önemli mtDNA parametrelerini tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçebilen yöntemler için bir gereklilik yaratmıştır.
Damlacık üretimi PCR yöntemi, örnek DNA11'deki spesifik hedef amplikonların PCR amplifikasyonu yoluyla bilinmeyen DNA konsantrasyonlarını ölçmek için mevcut yöntemleri geliştirmek için mikroakışkan teknolojisindeki son gelişmelerden yararlanır. Numune DNA'sının tek bir reaksiyonda güçlendirildiği qPCR'den farklı olarak, PCR ürününün göreceli birikim hızı okuma görevi görür, bu yöntem ilk numuneyi binlerce bireysel damlacığa böler, böylece numune DNA moleküllerini mekansal olarak ayrı reaksiyonlara bölümlere ayırır12. Sonraki PCR reaksiyonu her bir damlacıkta ilerler, PCR ürünü sadece hedef DNA'yı içeren damlacıklarda birikir. Bu reaksiyonun sonucu, hedef DNA'nın ve güçlendirilmiş PCR ürününün bir kopyasını içeren veya hedef DNA içermeyen bir damlacık havuzu şeklinde dijital bir çıktıdır. Floresan DNA probları veya çift sarmallı (ds) DNA bağlayıcı boya kullanılarak, güçlendirilmiş ürün içeren damlacıklar sayılabilir ve ilk numunede bulunan DNA kopyalarının mutlak sayısını hesaplamak için 'pozitif' ila 'negatif' damlacıkların oranı kullanılabilir. Bu mutlak ölçüm, bir qPCR reaksiyonundan elde edilen bağıl ölçümün aksine, bu metodolojinin tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ve heteroplazminin doğru ölçümü için kullanılmasına izin veren anahtar faktördür11 ve son zamanlarda yapılan birkaç çalışmada damlacık üretimi PCR teknolojisi bu amaçla kullanılmıştır13,14 . Bu makalede, hem insan hem de fare dokusundan tek hücrelerde mtDNA kopya sayısını ve delesyon heteroplazmisini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >50% Tween-20 solution</td>
			<td >Novex</td>
			<td >3005</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated droplet-generating oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C1000 PCR machine with deep-well block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td>PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Collection plate cooling block</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12002819</td>
			<td>Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR 96-well plates&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR droplet reader oil&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1863023</td>
			<td>Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DG32 automated droplet generator cartridges&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10270-106</td>
			<td>Qualified fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foil plate covers&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEK 293T cells</td>
			<td >Takara</td>
			<td >632180</td>
			<td>Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HeLa cells</td>
			<td >ECACC</td>
			<td >93021013</td>
			<td>Human cervix epitheloid carcinoma cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High glucose DMEM</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >13345364</td>
			<td>4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human cybrids</td>
			<td colspan="2">University of Miami</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse embryonic fibroblasts&#160;</td>
			<td colspan="2">Newcastle University</td>
			<td>Immortalized from C57Bl/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water</td>
			<td >Ambion</td>
			<td >AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate seals</td>
			<td >Pierce</td>
			<td >SP-0027</td>
			<td>Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet Tip Waste Bins</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet tips for AutoDG system&#160;</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primary human dermal fibroblast cells</td>
			<td>Newcastle Biobank</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primers/Probes</td>
			<td >IDT</td>
			<td >N/A</td>
			<td>Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K 20 mg/mL solution</td>
			<td >Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PX1 PCR plate sealer</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX Manager software</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>12012172</td>
			<td>Droplet reader set up &#38; analysis software (used in Protocol Steps 6 &#38; 7)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 AutoDG droplet generator</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >QX200 droplet reader</td>
			<td >Bio Rad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reader (used in Protocol Step 6)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizma pre-set crystals pH 8.3</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T8943-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring single-cell mitochondrial dna copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction

Memeli mitokondriyal (mt) DNA'sı, elektron taşıma zincirinin 13 alt birimini kodlayan küçük, dairesel, çift sarmallı, mitokondriyal bir DNA molekülüdür. Diploid nükleer genomun aksine, çoğu hücre, hücre tipine bağlı olarak 100'den az ila 200.000'den fazla kopya arasında değişen mtDNA'nın çok daha fazla kopyasını içerir. MtDNA kopya sayısı, yaşa bağlı bir dizi dejeneratif durum ve hastalık için bir biyobelirteç olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır ve bu nedenle, mtDNA kopya sayısının doğru ölçümü hem araştırma hem de teşhis ortamlarında önemli bir araç haline gelmektedir. Genellikle tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) veya delesyonlar olarak ortaya çıkan mtDNA'daki mutasyonlar, hücre içindeki mtDNA'nın tüm kopyalarında (homoplazmi olarak adlandırılır) veya mutasyona uğramış ve WT mtDNA kopyalarının (heteroplazmi olarak adlandırılır) bir karışımı olarak bulunabilir. Heteroplazmik mtDNA mutasyonları, nadir hastalıklarda veya Parkinson hastalığı gibi giderek artan sayıda yaygın geç başlangıçlı hastalıkta klinik mitokondriyal patolojinin önemli bir nedenidir. Hücrelerde bulunan heteroplazmi seviyesinin belirlenmesi, nadir görülen mitokondriyal hastalıkların tanısında ve mitokondrinin rol oynayabileceği yaygın geç başlangıçlı bozuklukları anlamayı amaçlayan araştırmalarda kritik bir adımdır. MtDNA kopya sayısı ve heteroplazmi geleneksel olarak kantitatif (q) PCR tabanlı testler veya derin dizileme ile ölçülmüştür. Bununla birlikte, ddPCR teknolojisinin yakın zamanda tanıtılması, her iki parametreyi ölçmek için alternatif bir yöntem sağlamıştır. Mutlak mtDNA kopya sayısını ölçme yeteneği ve düşük kopya sayılarında bile tek hücrelerden doğru ölçümler yapmak için yeterli hassasiyet de dahil olmak üzere mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar. Burada, ddPCR kullanılarak tek hücrelerde mtDNA kopya sayısının ölçümünü açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır, bundan böyle damlacık üretimi PCR olarak adlandırılacaktır ve mtDNA delesyonlu hücrelerde heteroplazmilerin eşzamanlı olarak ölçülmesi seçeneği sunulmaktadır. Bu yöntemin mtDNA SNP'li hücrelerde heteroplazmiyi ölçmek için genişletilmesi olasılığı da tartışılmaktadır.

Damlacık oluşumunu takiben, her bir kuyucuktaki yağ fazının üstünde yüzen şeffaf bir opak damlacık tabakası görülebilir (Şekil 1B). Damlacık oluşumu, tek hücreler üzerinde deneyler yapılırken giriş lizatındaki deterjanların varlığından olumsuz etkilenebilir. 2.1.2.'de açıklanan lizis protokolü kullanılarak, son numunede küçük bir kalıntı miktarda TWEEN-20 bulunmasına rağmen, önerilen 10.000 seviyesinin üzerindeki damlacık verimleri rutin olarak elde ed...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Bu protokol, bireysel hücrelerde bulunan mitokondriyal DNA'nın kopyalarının sayısını ve belirli mitokondriyal DNA mutasyon tiplerinin seviyesini doğru bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Önceki yöntemler, bu ölçümleri birçok hücre içeren doku örneklerinde doğru bir şekilde yapabilir. Bu tekniğin temel avantajı, aynı ölçümleri tek hücrelerde yapabilmemizdir.Bu yöntem özellikle mitokondri üzerinde çalışanlar için kullanışlıdır ve bu alanda geniş uygulamalara sahip olacaktır. Tek hücrelerin etkili izolasyonu ve lizisi bu tekniğin anahtarıdır. Tek hücre sıralama ile ilgili önceki deneyim çok yardımcı olacaktır.Başlamak için, metinde açıklandığı gibi, buz üzerinde örnek DNA olmadan PCR için ana karışımı hazırlayın. Vorteksten kısa bir süre sonra, hazırlanan ana karışımın gerekli hacmini, damlacık üretimi PCR 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın ve numuneleri tam sütunlar halinde düzenleyin. Ardından, ana karışımı şablon dışı denetimler olarak kullanmak için tamamlanmamış sütunlardaki boş kuyucuklara ekleyin.Ardından, her bir kuyucuğun toplam hacmini 22 mikrolitre yapmak için giriş DNA'sını her bir kuyucuğa ekleyin. Plakayı yapışkan bir plaka contasıyla kapatın ve bir dakika boyunca 2000 RPM'de bir çalkalayıcıya yerleştirin. Daha sonra plakayı buzun üzerine koymadan önce dört santigrat derecede bir dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüj yapın.Damlacık üretimi için, önce damlacık jeneratörünün açık olduğundan emin olun ve alet güvertesinin E konumuna bir şişe damlacık üreten yağ yüklenip yüklenmediğini kontrol edin. Ardından dokunmatik ekranda Örnek Plakayı Yapılandır'ı tıklayın. Numuneleri veya boşlukları içeren numune plakasındaki tüm sütunları seçtikten sonra, plaka konfigürasyonunu onaylamak için Tamam'a tıklayın.Ardından, damlacık jeneratörü kartuşlarını enstrüman güvertesinde B konumuna yerleştirin, böylece tüm ışıklar yeşile döner ve boş bir uç atık oluğunu C konumuna yerleştirin. Ardından, numune plakasını alet güvertesinin F konumuna yerleştirmeden önce yapışkan contayı çıkarın, böylece ışık yeşile döner. Ayrıca, ışığın yeşile dönmesi için G konumunda, eksi 20 santigrat derecede önceden soğutulmuş, serin bir bloğa yerleştirilmiş boş bir damlacık toplama 96 delikli plaka yükleyin.Cihazın dokunmatik ekranında Damlacık Oluşturmayı Başlat'a tıkladığınızda damlacık jeneratörü kapağı otomatik olarak kapanır. Damlacık üretimi tamamlandıktan sonra, her bir kuyucukta yağ fazının üzerinde bir damlacık emülsiyon tabakasının bulunduğunu doğrulamak için numune toplama plakasını görsel olarak kontrol edin. Ardından, plaka kapatıcıyı açın ve sıcaklığı 180 santigrat dereceye ayarlayın ve kapatma süresini beş saniyeye ayarlayın.Makinenin çalışma sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Daha sonra numune toplama plakasını plaka kapatıcının plaka tutucusuna yerleştirin ve plakanın üstüne kırmızı çizgi yukarı bakacak şekilde taze bir folyo conta yerleştirin. Plaka sızdırmazlık elemanı çalışma sıcaklığına ulaştığında, cihazın dokunmatik ekranında çıkarma düğmesine basın.Plaka tutucuyu plaka kapatıcının çekmecesine yerleştirdikten sonra, çekmeceyi kapatmak için contaya basın. Sızdırmazlık tamamlandığında, çekmece otomatik olarak açılacaktır. Sızdırmaz plakayı çıkarın ve soğuk bloğun üzerine yerleştirin.Ardından plaka kapatıcıyı kapatın. PCR'yi çalıştırmak için, kapalı damlacık toplama plakasını 96 derin kuyucuklu bir bloğa sahip bir PCR makinesine yerleştirin. PCR tamamlandıktan sonra, damlacık okuyucuyu ve bağlı bilgisayarı açın.PCR sonrası numunelerle plakayı damlacık okuyucu plaka tutucusuna yükleyin. Folyo kapağını numune plakasında tutarken, kapağı tutucunun üstüne yerleştirin ve siyah kilitleme klipsleriyle yerine sabitleyin. Ardından, damlacık okuyucu kapağını açmak için aç/kapat düğmesine basın.Ardından, damlacık okuyucu plakası tutucusunu numune plakasıyla birlikte okuyucu odasına yükleyin ve manyetik tabana güvenli bir şekilde yerleştirin. Kapağı kapatmak için aç/kapat düğmesine tekrar basın. Analiz yazılımı arayüzünü açın.Plaka Ekle sekmesini seçin, Plaka Ekle'yi tıklatın ve ardından Plakayı Yapılandır'ı tıklatın. Plaka Bilgileri sekmesinde bir plaka adı girin, Supermix Açılır menüsünden Problar için Supermix, DUTP Yok'u seçin ve Kuyu Seçimi sekmesindeki Veri Dosyasını Kaydet As.In altına bir dosya adı girin, analiz edilecek kuyuları vurgulayın ve Seçilen Kuyuları Dahil Et'i tıklatın. Ardından, Kuyu Bilgileri sekmesinde, açıklama eklenecek kuyuları seçin.Deneme Türü açılır menüsünden Doğrudan Nicelik'i seçin. Ardından örnek açıklamasını, örnek türünü ve hedef adı kutularını doldurun ve gerektiğinde iyi notlar ve/veya plaka notları ekleyin. Ardından Uygula'yı tıklayın.Plaka yapılandırması tamamlandıktan sonra, Çalıştırmayı Başlat'ı tıklatın. Sonuç analizi için, Veri Analizi sekmesini seçin ve analiz edilecek dosyayı Veri Dosyalarım menüsünden açın. Ardından, tek renkli denemeler için 1B Genlik sekmesini veya iki renkli denemeler için 2B Genlik sekmesini tıklatın.Ardından, eşik gerektiren kuyuları seçin. Genlik grafiğindeki pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki boş alana eşiği manuel olarak uygulamak için Eşik Çizgisi Modu aracını kullanın ve artı işaretinin dört damlacık popülasyonunun açıkça ayrılacağı şekilde yerleştirilmesini sağlayın. Eşik tüm örnekler için uygulandıktan sonra, Veri Tablosu sekmesi, İçe/Dışa Aktar'a tıklayıp Görünür Verileri CSV'ye Aktar'ı seçerek sonuçları daha fazla analiz için csv dosyası olarak dışa aktarın.Uygun bir dosya adı girin ve Kaydet'i tıklatın. Bu protokolde kullanılan PCR ve damlacık okuma prosedürleri, hem fam hem de hex kanallarında açıkça ayrılmış pozitif ve negatif damlacık popülasyonlarının varlığını göstermiştir. Her iki prob için pozitif olan mitokondriyal DNA popülasyonları, tek hücreli lizatlardan da ayırt edilebilir.Bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal DNA'da delesyonları olan örnekler için, DNA'nın sadece silinmemiş kısmı için pozitif olan çift pozitif damlacıklar ve damlacıklardan oluşan karışık bir popülasyonun mevcut olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, fare oositleri ve birincil fare embriyonik hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli memeli hücrelerinde hücre başına mitokondriyal DNA kopya sayısını saymak için başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, yüksek delesyon heteroplazmisine sahip hücrelerde, tek bir prob için pozitif olan popülasyonun, çift pozitif popülasyondan anlamlı derecede daha büyük olduğu bulunmuştur.Bununla birlikte, düşük delesyonlu heteroplazmiye sahip hücrelerde, her iki popülasyon da benzer büyüklükteydi. Bu nedenle doğru sonuçlar her zaman damlacık üretiminin başarılı olmasını ve eşiklemenin 1D veya 2D genlik görünümü kullanılarak uygun şekilde uygulanmasını sağlar. Kullanılmayan lizat, tek nükleotid polimorfizm heteroplazmını ölçebilen pirosekanslama gibi diğer tek hücreli testler için kullanılabilir.Bu tekniğin geliştirilmesi, mitokondriyal DNA kopya sayısının doğru ölçümlerini yapmamıza ve daha önce mümkün olmayan bireysel hücrelerde delesyon heteroplazmisini yapmamıza izin verdi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

Artan Aort Katılığa Ölçme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ultrason Kullanımı Farelerde

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı<em&gt; İn Vivo</emİnsan İskelet Kası içinde&gt; Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction

Revizyon artroplastisi roman tanılama: Sonication ve Multiplex Polimeraz zincir reaksiyonu

In orthopedic patients, foreign body-associated infections, especially periprosthetic joint infections (PJIs), are a devastating complication of ...

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Kardiyak miyositler mitokondrial membran potansiyeli hipoksi/Reoxygenation sonra ölçmek için akış sitometresi tabanlı tahlil

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

Asit maserasyon yöntemini kullanarak tüm böbrek netron numarasının tahmini

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Ultrasound in Evaluating Diaphragm Dysfunction and Monitoring Treatment

Measuring Diaphragm Thickness and Function Using Point-of-Care Ultrasound

Unraveling the Impact of Mechanical Ventilation on Diaphragm Function and Patient Outcomes (Video) | JoVE

Bakım Noktası Ultrasonu Kullanarak Diyafram Kalınlığını ve İşlevini Ölçme

The diaphragm is the main component of the respiratory muscle pump. Diaphragm dysfunction can cause dyspnea and exercise intolerance, and predisposes ...