يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص تأثير إنزيمات الغليكوزيل المتعددة على ملف تعريف الجليكو للبروتين المستهدف والمساهمة في فهم أفضل لوظائف الإنزيم. تسمح طبيعة البروتوكول بفحص إنزيمات الغليكوزيل بطريقة عابرة ، ولكنها عالية الإنتاجية. يمكن أن يؤدي تغيير ملامح الغليكوزيل إلى تحسين أنشطة الأجسام المضادة ، وبالتالي زيادة فعالية المنتج النهائي.
تراقب شركات الأدوية الحيوية عن كثب الجليكوزيل كسمة جودة حرجة. الغليكوزيل الشاذ هو السمة المميزة لأمراض مثل السرطان. لذلك ، هذه الطريقة ذات صلة بالبحوث الدوائية والطبية الحيوية.
يفترض البروتوكول أن المستخدمين لديهم خبرة في العديد من التقنيات التجريبية ، بما في ذلك نقل خلايا الثدييات والبقع الغربية. من الأفضل البدء بعينات أقل واستخدام نقاط التوقف في المقام الأول. ابدأ بتقييم كثافة وجدوى خلايا مبيض الهامستر الصيني.
بعد ذلك ، قم بتنظيف خزانة السلامة البيولوجية وجميع المعدات بعناية باستخدام 70٪ من الإيثانول ومحلول مثبط RNase لتجنب التلوث. بعد ذلك ، قم بتكوير الخلايا عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليقها في وسط تم تسخينه مسبقا بكثافة خلية تبلغ خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. انقل ثمانية ميكرولترات من المزيج الرئيسي DsiRNA أو التحكم إلى كوفيت كهربائي معقم.
أضف 800 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى نفس الكوفيت ، واخلطه ، وقم بتوصيل نبضة الكهرب. ثم ، انقل تعليق الخلية من الكوفيت إلى بئر واحد من صفيحة من ستة آبار ، وتجنب المواد الشبيهة بالرغوة. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق دون اهتزاز.
بعد الحضانة ، أضف 800 ميكرولتر من الوسائط التي تم تسخينها مسبقا لجعل الحجم النهائي 1.6 ملليلتر لكل بئر. تنمو الخلايا المنقولة في الحاضنة أثناء الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة. بعد 48 ساعة ، حصاد supernatant والخلايا.
بعد تنقية IgG ، أضف الاستخلاص A إلى مكثف طرد مركزي بوزن جزيئي يبلغ ثلاثة كيلودالتون ، وجهاز طرد مركزي عند 13،300 مرة G لمدة 40 إلى 50 دقيقة عند أربع درجات مئوية. يكتمل الطرد المركزي بمجرد أن يكون الحجم المتبقي مساويا أو أقل من 50 ميكرولتر. تخلص من التدفق وأضف 500 ميكرولتر من 1X PBS المبردة مسبقا لتخفيف الفائض المتبقي.
قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى باستخدام نفس الظروف حتى يبقى 50 ميكرولتر من المواد الفائقة المتبقية. للحصول على تخفيف 100X من supernatant ، أضف 500 ميكرولتر من 1X PBS المبردة مسبقا وكرر عملية الطرد المركزي. ركز المادة الفائقة في تركيز نهائي يبلغ حوالي 2.5 جرام لكل لتر في 40 ميكرولتر لضمان التوافق مع طريقة تحليل الجليكان.
لتحليل الجليكان ، انقل 200 ميكرولتر من محلول الخرزة المغناطيسية إلى أنبوب PCR سعة 2 ملليلتر. ضعه على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن السوبرناتانت وإزالة السوبرناتانت بعناية. ثم ، قم بإزالة الأنابيب من الحامل المغناطيسي وأضف عينة البروتين النقية والدوامة.
بعد ذلك ، أضف مخزن تمسخ الإمداد إلى أنبوب العينة واحتضنه لمدة ثماني دقائق عند 60 درجة مئوية. حافظ على أنابيب العينة مفتوحة للحصول على أفضل أداء للتفاعل. بعد الحضانة ، أضف PNGase F واحتضنه لمدة 20 دقيقة أخرى عند 60 درجة مئوية لشق الجليكان من الأجسام المضادة النقية.
بعد إطلاق N-glycans ، أغلق أنبوب العينة والدوامة. ثم ، أضف الأسيتونيتريل إلى أنبوب العينة ، الدوامة ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. ضع أنابيب العينة في الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن المحلول.
ثم ، باستخدام ماصة ، قم بإزالة supernatant بعناية دون لمس الخرز. أضف محلول وضع العلامات على الجليكان المحتوي على الفلوروفور إلى العينة في غطاء الدخان واخلطه عن طريق الدوامة. بعد حضانة لمدة 20 دقيقة عند 60 درجة مئوية بأغطية مفتوحة ، قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل العينة ثلاث مرات في الأسيتونيتريل.
ثم ، قم بتمييع الجليكان المسمى في الماء المقطر المزدوج. ضع أنبوب العينة في الحامل المغناطيسي واجمع السوبرناتانت المخصب بالجليكان النقي والملصق. بعد ذلك ، قم بإعداد وتحميل جميع المعايير والعينات المطلوبة في مواضع الدرج المحددة.
قم بتشغيل بروتوكول تحليل الجليكان وتحليل وتحديد الجليكان الموجود في العينة باستخدام البرامج المناسبة. أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاض التعبير عن بروتين Fut8 في الخلايا المنقولة بمزيج من ثلاثة هياكل Fut8 DsiRNA. كما أظهرت هياكل الجليكان من الخلايا القاضية انخفاضا في الاندماج.
كان هذا الاتجاه أكثر وضوحا في هياكل agalactosylated ولوحظ بدرجة أقل في الهياكل galactosylated. وقد لوحظ انخفاض بمقدار ضعفين في الفوكوسيل الأساسي من الكهربية باستخدام نبضتين من الموجة المربعة مقارنة بنبضة موجة مربعة واحدة دون اختلافات كبيرة في صلاحية الخلية. بشكل عام ، فإن زيادة تركيز الحمض النووي الريبي قصير التداخل له تداخل كبير على الفوكوسيل الأساسي من زيادة وقت الحصاد.
تحدد النسبة بين الماء والأسيتونيتريل ما إذا كان الجليكان في محلول أو جزء من الخرز. من الأهمية بمكان أن نتذكر أثناء خطوات الغسيل لتجنب الإزالة العرضية للجليكان المسمى من المحلول. قد تتضمن تجربة المتابعة توصيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المنقاة باستخدام المقايسات القائمة على الخلايا لتحديد السمية الخلوية المعتمدة على الخلايا المعتمدة على الأجسام المضادة والسمية الخلوية المعتمدة على المكملات.
