Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

يشكر PK قسم الهندسة الكيميائية ، إمبريال كوليدج لندن ، على منحته الدراسية. يشكر RD مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية في المملكة المتحدة على طلابه. يتم تمويل MM من قبل مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية في المملكة المتحدة (مرجع المنحة: BB/S006206/1). IAG تشكر مجلس البحوث الأيرلندي (رقم المنحة. GOIPG/2017/1049) و CONACyT (منحة رقم 438330).

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تتضمن مسارات الغليكوزيل شبكة استقلابية معقدة من الإنزيمات والبروتينات الملحقة. إن تشريح وظيفة مكونات المسار أمر شاق إذا كان يعتمد على استراتيجيات الهندسة الوراثية التقليدية بالضربة القاضية أو الطرق السريعة وحدها. هناك نهج بديل يتمثل في الفحص الأولي لأعضاء المسار باستخدام فحص عابر لفقدان الوظيفة. وتحقيقا لهذه الغاية ، تم الجمع بين بروتوكولين سريعين ، وهما الكشف عن RNAi و CGE-LIF ، لإنشاء طريقة أكثر كفاءة لتوصيف جينات الغليكوزيل. تتطلب الطريقة الموصوفة 5-7 أيام لإكمالها مقارنة بالطرق التقليدية التي قد تستغرق عدة أسابيع لإكمالها. علاوة على ذلك ، يمكن لبيئات البحث ذات قدرات الأتمتة استغلال هذه الطريقة لفحص المزيد من الجينات المرشحة أكثر مما هو ممكن مع المعالجة اليدوية.
يعتمد نجاح حملة هندسة السكر العابرة إلى حد كبير على تصميم siRNA. يجب أن تتبع تصميمات DsiRNA المخصصة القواعد الموضحة مسبقا ، أو للسهولة ، يمكن للمستخدمين اختيار التسلسلات المصممة مسبقا المتاحة تجاريا. مثل استراتيجيات تعديل الجينات الأخرى ، فإن RNAi لديه القدرة على تأثيرات غير مستهدفة. لذلك ، يتم تشجيع المستخدمين على تقييم استهداف الجينات غير المقصود بالطرق الحسابية41. يمكن أن تساعد خيارات التصميم التجريبية أيضا في الحد من التأثيرات غير المستهدفة. أظهر Kittler et al. أن التسليم المتعدد الإرسال ل siRNA أدى إلى انخفاض في التأثيرات غير المستهدفة42. على الرغم من أن هذا يبدو غير بديهي ، إلا أنه يقترح أن المزيج الرئيسي يقلل من تركيز كل بنية siRNA ، مما يحد من فرصة إسكات الجينات خارج الهدف. فائدة أخرى هي أن النقل المتزامن لهياكل siRNA التي تستهدف نفس الجين يزيد من احتمال نجاح الحمض النووي الريبي. كما يضمن استخدام المزيج الرئيسي الاتساق بين العينات وتكرار عملية النقل وتسريعها. بعد فحص أولي لبنى siRNA المختلطة ، يمكن إجراء تجربة أخرى باستخدام تركيبات فردية للتأكد من كفاءة RNAi لكل تسلسل. في هذه الدراسة وغيرها من الدراسات القاضية ، تم تجميع ما يصل إلى ثلاثة siRNA وتسليمها إلى الخلايا43،44،45. ومع ذلك ، قد يكون من المستحسن فحص أكثر من ثلاثة siRNA في وقت واحد لاستهداف جين واحد بكفاءة أو لاستهداف العديد من الجينات. في الواقع، أظهرت إحدى الدراسات إسكات ما يصل إلى ستة جينات بوساطة الحمض النووي الريبوزي المرسال بمستويات مماثلة لإسكات الجينات الفردية46. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد الحد الأقصى لعدد هياكل siRNA التي يمكن استخدامها في تجمع دون المساس بكفاءة إسكات الصوت. تم اقتراح استراتيجية تعدد الإرسال من قبل مارتن وآخرون لتعزيز وتيرة تجارب فحص مكتبة RNAi46 ، وقد يكون مفهوم مماثل مفيدا لفحص جينات الغليكوزيل.
يعمل البروتوكول الموصوف هنا كدليل على المفهوم مع توقع إجراء تجارب لاحقة للتحقق من صحة جينات الجليكوزيل الأخرى. قد تكون الجينات الجديدة ذات الأهمية غير مميزة أو أقل شعبية من Fut8 ، وقد تكون الأجسام المضادة الأولية للكشف عن إسكات الجينات ضعيفة أو غير متوفرة. في هذا السيناريو ، يمكن استخدام طرق بديلة مثل RT-PCR لتحديد كمية إسكات الجينات47 ، ولكن تجدر الإشارة إلى أن RT-PCR يكتشف mRNA بدلا من البروتين. عندما تتوفر الأجسام المضادة للنشاف الغربي ، فإن المشكلة الشائعة هي ضعف الكشف أو وجود نطاقات غير محددة. تتوفر أدلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها لمساعدة المستخدمين على حل المشكلات الشائعة، وتميل إلى تضمين مجموعة من الحلول مثل معايرة الأجسام المضادة الأولية والحظر البديل وشروط الكشف48,49. في هذه الدراسة ، ظهر FUT8 بشكل غير متوقع كنطاق مزدوج عند ~ 65 و ~ 70 kDa. من الممكن أن يمثل النطاق ~ 70 kDa FUT8 الغليكوزيلي. تصف الأدلة الأدبية من خطوط الخلايا البشرية الجليكوزيل المرتبط ب O في Thr 564 50,51 ، وهو موقع محفوظ في الهامستر الصيني ، وتسلسلات CHO K1 FUT8.
كما ذكرنا سابقا ، غالبا ما تتضمن مسارات الجليكوزيل مجموعة معقدة من الإنزيمات. تم تطوير البروتوكول الحالي وتحسينه وإثباته باستخدام تفاعل جليكوزيل أحادي المنشأ يتم التحكم فيه بواسطة Fut8. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتأكيد متانة هذه الطريقة عندما يقوم الجين المستهدف بتشفير إنزيم بمستويات حركة وتعبير بديلة أو مسار تنظمه إيزوزيمات ذات وظائف زائدة عن الحاجة.
وإذا ما أخذنا ذلك في الحسبان، فإن القدرة على إسكات الجينات بسرعة والكشف عن الجليكوبروفايلات المعدلة من IgG هي أداة مفيدة في الجهود المبذولة نحو الأجسام المضادة المصممة خصيصا للجليكو. يمكن تطبيق رؤى من دراسات مماثلة قصيرة الأجل لتوليد خلايا مستقرة مصممة بالسكر لاستخدامها في الفحوصات طويلة الأجل مثل ثقافة الدفعات الغذائية. خارج السياق الصيدلاني ، تساهم هذه الطريقة في دراسة بيولوجيا الجليكان وتسلط الضوء على الوظيفة المهمة للجليكان في التنمية والصحة والمرض.

الغليكوزيل المرتبط ب N هو عملية إنزيمية ترتبط من خلالها موليغوساكاريد موي تساهميا ببقايا Asn. على عكس تخليق البروتين دي نوفو ، فإن تخليق الجليكان هو تفاعل غير قالب يؤدي إلى غليكوزيل غير متجانس للبروتينات. يمكن أن يؤثر هيكل وتكوين وتوزيع الجليكان على تكوين البروتين ووظيفته. في الواقع ، ينظم N-glycosylation في منطقة الشظية القابلة للتبلور (Fc) من الغلوبولين المناعي G (IgG) الفعالية العلاجية والمناعة ونصف عمر الجسم المضاد1. على هذا النحو ، فإن نموذج الجودة حسب التصميم (QbD) لتطوير منتجات البروتين العلاجي الحيوي المؤتلف يحدد بشكل طبيعي الجليكوزيل كسمة جودة حرجة (CQA) 2,3. غالبا ما تكون خلايا الثدييات هي أنظمة التعبير المفضلة لأنها تنتج بطبيعتها أنماط غليكوزيل تشبه الإنسان بشكل أوثق من البكتيريا أو الخميرة أو الحشرات أو الخلايا النباتية. علاوة على ذلك ، يتم اختيار خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) على خطوط خلايا الثدييات الأخرى لأنها مقاومة للعدوى الفيروسية البشرية ، وتفرز المنتجات في عيارات عالية ، ويمكن زراعتها في ثقافة التعليق إلى كثافات خلايا عالية قابلة للحياة4. وفيما يتعلق بتكوين الجليكان، تولد خلايا إنتاج الفئران غير التابعة ل CHO جليكانات مناعية المنشأ (α (1-3) مرتبطة بالجالاكتوز [α(1-3)-Gal] وحمض N-glycolylneuraminic [NeuGc]) الذي يؤثر على الاستخدام الآمن للأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs)5. هذه الفوائد تجعل خلايا CHO نظام التعبير الأول ، المسؤول عن إنتاج أكثر من 80٪ من biotherapeutics الجديدة بين عامي 2014 و 20186. ومع ذلك ، فإن الجليكوزيل المستقل عن القالب هو آلية محفوظة تؤدي إلى biotherapeutics المشتقة من CHO مع مجموعة من glycoforms.
تهدف استراتيجيات تطوير العلاج الحيوي إلى التحكم في عدم التجانس في خلايا CHO عن طريق الهندسة الوراثية. تشمل بعض الأمثلة الأدبية ضربة قاضية من السياليداس (Neu1 ، Neu3)7 ، الناتج المحلي الإجمالي - مانوز 4،6-ديهيدراتاز (GMD) بالضربة القاضية8 ، والإفراط في التعبير عن الجليكوسيل ترانسفيراز (GnTIII)9. التقدم في هندسة السكر ممكن بسبب مزيج من الموارد المتاحة للجمهور، مثل جينوم CHO10، والتطوير المستمر لأدوات الهندسة الوراثية، مثل نوكلياز المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALENs)، ونوكلياز إصبع الزنك (ZFNs)، والتكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بانتظام (كريسبر) المرتبطة بالبروتين 9 (كريسبر-كاس9)11،12،13،14 . عادة ما يتم تسليم هذه الأدوات إلى خلايا CHO كحمض نووي بلازميد أو كمجمعات بروتين ريبي نووي منقى (RNP). وعلى العكس من ذلك، فإن تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو تقنية هندسة وراثية لا تتطلب في أبسط أشكالها سوى تسليم أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي الريبي قصيرة التداخل (siRNA). تقوم البروتينات الداخلية بمعالجة siRNA المزدوج الخيوط في خيوط مفردة ، ويشكل النوكليز ، مركب إسكات الحمض النووي الريبي الناجم عن الحمض النووي الريبي (RISC) ، معقدا مع siRNA لشق تسلسلات mRNA المستهدفة15,16,17. يعد إسكات الجينات عبر هذه الطريقة عابرا بسبب عدم استقرار الحمض النووي الريبي ، لكن التحقيق هنا يستفيد من هذه الميزة للمساعدة في الفحص السريع.
ينتج الإنزيم النموذجي المختار للدراسة الحالية ، α1,6-fucosyltransferase (FUT8) ، N-glycans مع α-1,6 L-fucose المرتبط بالنواة (Fuc). هذا التعديل هو المحدد الرئيسي لنشاط السمية الخلوية للخلايا المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) ، كما يتضح من دراسات الأجسام المضادة التجارية. في حالة عدم وجود fucosylation الأساسية ، Rituximab (anti-CD20 IgG1) يزيد من ADCC 50 ضعفا ويزيد ADCC في Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) من خلال تحسين ربط FcgRIIIa18,19. وبالتالي ، يعتبر الفوكوسيل الأساسي سمة غير مرغوب فيها من mAbs التي تستدعي بذل جهود لعكس هذا النمط الظاهري. هناك أمثلة على استهداف جين Fut8 الناجح باستخدام siRNA مع الزيادات المصاحبة في ADCC20,21,22 ، على الرغم من أن هذه الأمثلة تقدم Fut8 siRNA المشفرة على الحمض النووي للبلازميد. تولد مثل هذه التجارب إسكات جينيا مستقرا حيث يعمل الحمض النووي البلازميد كقالب لتخليق siRNA. هذا يسمح للخلايا بتجديد جزيئات siRNA التي تتحلل بواسطة RNases داخل الخلايا والفوسفاتيز. وعلى العكس من ذلك، فإن تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي الخارجي لا يسمح إلا بإسكات الجينات العابرة حيث لا يمكن تجديد الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب عدم وجود قالب داخل الخلايا. وبالتالي ، يجب على المستخدمين النظر فيما إذا كانت التصاميم التجريبية متوافقة مع siRNA المشتق من البلازميد أو الاصطناعي. على سبيل المثال ، قد تختار الدراسات التي تركز على ذروة إنتاج mAb ، عادة في اليوم السادس من الثقافة 23,24 ، siRNA الاصطناعية التي يمكن تسليمها إلى الخلايا قبل بضعة أيام من ذروة التعبير. تشمل فوائد النهج العابر باستخدام siRNA الاصطناعي القدرة على الاستعانة بمصادر خارجية للإنتاج وحقيقة أنه يمكن إنشاء تركيبات siRNA متعددة في جزء صغير من الوقت المستغرق لتوليد التركيبات في البلازميدات. علاوة على ذلك ، فإن siRNA الاصطناعي فعال ، كما يتضح من الأمثلة الأدبية لإسكات جين Fut8 الذي يكفي لتقليل تعبير بروتين FUT825 وإنتاج IgGs afucosylated مع زيادة ربط FCgRIIIa و ADCC26.
تم تحديد نجاح بروتوكول glycoengineering هذا من خلال درجة غليكوزيل Fc. عادة ما يكون قياس الطيف الكتلي هو الطريقة المفضلة لتحليلات الغليكوميك. ومع ذلك ، فإن الرحلان الكهربائي الهلامي الشعري والكشف عن التألق الناجم عن الليزر (CGE-LIF) قابل تماما لحل ملف تعريف الجليكوبروفايل ل IgGs المنقى ولديه ميزة السرعة والبساطة الأكبر. يجب أن تجمع بروتوكولات قياس الطيف الكتلي بين طرق الكروماتوغرافيا والاشتقاق المناسبة ومصادر التأين وأجهزة تحليل الكتلة27،28،29. بالإضافة إلى الحاجة إلى أخصائي مدرب ، فإن بروتوكولات قياس الطيف الكتلي طويلة ، وتنوع الأساليب يجعل من الصعب مقارنة البيانات بين المختبرات ذات الإعدادات المختلفة. في سياق المستحضرات الصيدلانية الحيوية ، تعد CGE-LIF طريقة حساسة يمكن أن توفر تفاصيل كافية عن جليكو الأجسام المضادة ويمكن تطويرها بسهولة للطرق عالية الإنتاجية. بالنسبة للوفرة المنخفضة ، والمخاليط المعقدة للغاية مع البروتينات السكرية سيئة الوصف ، قد تظل مزايا قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، فإن تحليلات mAb عالية الدقة وعالية الحساسية التي يوفرها تحليل N-glycan القائم على CGE-LIF بمثابة الأساس المنطقي لتجربة هذه الطريقة. علاوة على ذلك ، يتم الانتهاء من إعداد العينات وتحليلها في غضون ساعات قليلة30. أظهرت الدراسات الحديثة أنه يمكن استخدام CGE-LIF لمراقبة الجليكان المشتقة من البلازما البشرية31 والفأر32 و CHO IgGs33. تسلط هذه الدراسات الضوء على استخدام CGE-LIF لتحليل العينات عالية الإنتاجية وأحجام العينات الصغيرة.
وتنطوي طريقة CGE-LIF على قيود ينبغي أخذها في الاعتبار. التكلفة هي حاجز كبير أمام استخدام هذا الجهاز وغيره من الأجهزة لتحليل الجليكان. ومع ذلك، فإن هذه التكاليف نموذجية في الميدان، ويعتقد أن CGE-LIF هو الخيار34 الفعال من حيث التكلفة. قد تجد المختبرات ذات الميزانيات الأصغر أنه من العملي استئجار الآلات أو الاستعانة بمصادر خارجية لتحليل العينات. اعتبار آخر لأي طريقة تحليلية هو التكرار. وأجري تقييم ل CGE-LIF باستخدام 48 نسخة طبق الأصل من نفس العينة التي تم فحصها في أيام مختلفة. تم تحديد الانحراف المعياري النسبي لكل شعيرة شعرية للتكرار داخل الدفعات وبين الدفعات. وجد أن المقارنة بين الدفعات من النسخ المتماثلة لها انحراف معياري نسبي بنسبة 6.2٪ ، مما يشير إلى أن الأداء الشعري ليس موحدا. علاوة على ذلك ، أظهرت مقارنة البيانات بين الدفعات انحرافا معياريا نسبيا بنسبة 15.8٪ 31 ، مما يشير إلى أن الأداء الشعري يتغير بمرور الوقت. وقد لا تنطبق أوجه القصور التشغيلية المحددة في الدراسة الحالية، التي تستخدم آلات مختلفة وكواشف مسجلة الملكية. إذا كان المستخدمون يعتزمون تطوير بروتوكول داخلي ، فسيكون من المفيد النظر في الدراسة التي أجراها Ruhaak et al. 31 ، الذي قيم بعناية الكواشف الخاصة ب CGE-LIF. على هذا النحو ، تم تحسين كواشف حقن العينات (Hi-Di Formamide و DMSO) ، ووضع العلامات على الجليكان (NaBH3CN أو 2-picoline borane)31 ، وغيرها.
تقدم هذه الدراسة بروتوكول هندسة جليكوهندسية فعال من حيث الوقت يجمع بين سرعة الحمض النووي الريبي المباشر وتحليل الغليكوميك في المراحل النهائية. يتم توضيح المنهجية باستخدام جين Fut8 كهدف للأسباب الموضحة أعلاه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

تربط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المؤتلفة أهدافا جزيئية محددة ، وبالتالي تحفز استجابة مناعية أو تمنع ربط الأربطة الأخرى. ومع ذلك ، قد يتم تقليل وظائف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وعمر النصف حسب نوع وتوزيع الجليكوسيل الخاص بالمضيف. ألهمت محاولات إنتاج أجسام مضادة متفوقة تطوير خلايا منتجة معدلة وراثيا تقوم بتوليف الأجسام المضادة المحسنة للجليكو. تتطلب هندسة الجليكوغرافيا عادة توليد خط خلية بالضربة القاضية أو الضربة القاضية المستقرة باستخدام طرق مثل البروتين 9 المرتبط باليندروميك القصير المتجمع بانتظام (CRISPR). ثم يتم وصف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تنتجها الخلايا الهندسية باستخدام طرق الطيف الكتلي لتحديد ما إذا كان قد تم الحصول على الجليكوبروفايل المطلوب. هذه الاستراتيجية تستغرق وقتا طويلا ، وتحديا تقنيا ، وتتطلب متخصصين. لذلك ، فإن الاستراتيجية البديلة التي تستخدم بروتوكولات مبسطة للهندسة الوراثية للجليكو والكشف عن الجليكان قد تساعد في المساعي نحو الأجسام المضادة المثلى. في دراسة إثبات المفهوم هذه ، كانت خلية مبيض الهامستر الصينية المنتجة ل IgG بمثابة مضيف مثالي لتحسين هندسة الجليكو. تم تسليم الحمض النووي الريبي قصير التداخل الذي يستهدف جين Fut8 إلى خلايا مبيض الهامستر الصيني ، وتم تحديد التغيرات الناتجة في تعبير بروتين FUT8. تشير النتائج إلى أن ضربة قاضية بهذه الطريقة كانت فعالة ، مما أدى إلى انخفاض بنسبة 60٪ تقريبا في FUT8. تم إجراء تحليل تكميلي لجليكو الجسم المضاد باستخدام تقنية سريعة ولكنها حساسة للغاية: الرحلان الكهربائي الهلامي الشعري والكشف عن التألق الناجم عن الليزر. أظهرت جميع تجارب الضربة القاضية زيادة في الجليكان الأفوكوسيلي. ومع ذلك ، فإن أكبر تحول تحقق في هذه الدراسة كان ~ 20 ٪. يبسط هذا البروتوكول جهود هندسة السكر من خلال تسخير أدوات تصميم سيليكو ، وكواشف استهداف الجينات المركبة تجاريا ، واختبارات القياس الكمي السريع التي لا تتطلب خبرة سابقة واسعة. على هذا النحو ، قد تساعد الكفاءة الزمنية التي يوفرها هذا البروتوكول في التحقيقات في أهداف الجينات الجديدة.

أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاض تعبير بروتين FUT8 في الخلايا المنقولة بمزيج من ثلاثة تركيبات Fut8 DsiRNA. في عينات التحكم المنقولة باستخدام DsiRNA غير المستهدفة ، ظهر FUT8 كنطاق مزدوج عند ~ 65 و 70 kDa. نظرا لأن الوزن الجزيئي المتوقع ل FUT8 هو 66 kDa ، فإن انخفاض كثافة الإشارة لنطاق الوزن الجزيئي المنخفض يدل على إسكات الجينات. لتأكيد وقياس إسكات الجينات ، تم تطبيع مستوى بروتين FUT8 إلى مستوى بروتين GAPDH النسبي. كشف تحليل اللطخة الغربية عن نطاقين ل GAPDH عند ~ 37 و 35 kDa. يتوافق نطاق الوزن الجزيئي الأعلى مع حجم البروتين المتوقع ، وبالتالي فهو يستخدم في حسابات التطبيع. عند تطبيعه ضد مستويات بروتين GAPDH ، تم تقليل تعبير بروتين FUT8 بنسبة تصل إلى 60٪ (الشكل 1).
تمشيا مع ملاحظة الضربة القاضية للجين عند 48 ساعة بعد النقل ، تمت معالجة عينات mAb المقابلة للتحليل من قبل CGE- LIF. أظهرت هياكل الجليكان من الخلايا القاضية انخفاضا في الفيوكسيلات. كان هذا الاتجاه أكثر وضوحا في هياكل agalactosylated (G0F) ولوحظ بدرجة أقل في الهياكل galactosylated (G1F و G1F و G2F). من مجموعة البيانات هذه ، انخفض إجمالي فوكوسيل IgG الأساسي إلى ~ 75٪ ، بانخفاض من ~ 95٪ من fucosylation الأساسية التي لوحظت لحالة التحكم السلبية (الشكل 2). كان من المتوقع حدوث انخفاض أكبر في الفوكوزيل الأساسي نظرا للانخفاض بنسبة 60٪ تقريبا في مستويات بروتين FUT8. عند التفكير ، من الجدير بالذكر أن glycoprofile يمثل mAbs الغليكوزيلاتي التي تراكمت على مدى فترة 48 ساعة منذ النقل ، في حين أن إسكات الجينات يمثل مستويات البروتين الموجودة في وقت الحصاد فقط.
تضمن مزيد من التدقيق في طريقة الضربة القاضية هذه تغيير تركيز DsiRNA ووقت الحصاد وظروف الكهربية. تم فحص كل عامل على حدة لتحديد أهميته. يتم التقاط تأثير ظروف نبض الكهربية على الفوكوسيل الأساسي وجدوى الخلية في التجارب B و C و D و E. وتظهر هذه النتائج انخفاضا بمقدار ضعفين في الفوكوسيل الأساسي من الكهربية باستخدام نبضتين موجيتين مربعتين (التجربة ج) مقارنة بنبضة موجة مربعة واحدة (التجربة ب)، دون وجود اختلافات كبيرة في صلاحية الخلية (الجدول 2). أدت حالة الكهربية e3 (التجربة D) إلى أدنى صلاحية للخلية (~ 90٪) وإنتاجية IgG في هذه المرحلة الزمنية. ومع ذلك ، تم نقل الخلايا التي نجت من حدث الكهربية بشكل معتدل ، كما يتضح من انخفاض ~ 10٪ في fucosylation الأساسية (الجدول 2). ومن المثير للاهتمام أن التجربة D استخدمت ظروف الكهربية التي وفرت أكبر انخفاض في الفوكوسيل الأساسي (14.7٪) ولكنها كانت ضارة بشكل واضح بصلاحية الخلية (91٪ -93٪ من قابلية البقاء). توضح هذه المجموعة المحدودة من التجارب الحاجة إلى تحديد إعدادات الكهربية التي تمكن من النفاذية الكافية لغشاء الخلية دون التسبب في ضرر لا رجعة فيه. ومن المثير للاهتمام أيضا أن نلاحظ دور تركيز siRNA ووقت الحصاد على fucosylation الأساسية. بشكل عام ، فإن زيادة تركيز SIRNA له تأثير أكبر على الفوكوسيل الأساسي من زيادة وقت الحصاد (التجارب B و F و G مقابل التجارب A و B و H). في التجارب المستقبلية ، سيكون من المثير للاهتمام معايرة تركيزات siRNA التي تقدمها طريقة الكهربية e2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> الشكل 1. مخطط التدفق التجريبي. يتم تصوير خطوات هندسة السكر وتحليل العينات مع الوقت المرتبط المطلوب لكل خطوة. يستغرق تصميم SiRNA بضع ساعات ، اعتمادا على عدد الأهداف الجينية أو التركيبات لكل هدف جيني. يكتمل نقل خلايا CHO مع siRNA في غضون ساعات قليلة ، وتترك الخلايا المحولة لتنمو لمدة 48 ساعة. يتم حصاد الكريات الخلوية و supernatants في غضون ساعات قليلة. يتم تحليل الكريات الخلوية ، ويتم فصل البروتينات داخل الخلايا على صفحة SDS وبعد ذلك يتم مسحها وفحصها بالأجسام المضادة ضد الجين المستهدف. يتم شق الجليكان من الأجسام المضادة النقية وتحليلها بواسطة CGE-LIF. قد تتطلب هذه الفحوصات 1 يوم لكل منهما. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> الشكل 2. تأكيد تداخل الحمض النووي الريبي. الكشف الغربي عن بقع مستويات البروتين α-1,6-fucosyltransferase (FUT8) في العينات المعالجة باستخدام Fut8 أو DsiRNA للتحكم غير الاستهدافي. النطاقات المقابلة ل FUT8 أكثر كثافة في التحكم من عينات ضربة قاضية Fut8. كما تم تقييم مستوى بروتين GAPDH من أجل تطبيع التعبير الجيني المستهدف. وقد أخذت جميع العينات من التجربة زاي (انظر الجدول 2). أعيد طبعها من كوتيديس وآخرون. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> الشكل 3. تأثير ضربة قاضية Fut8 على غليكوزيل IgG التراكمي عند 48 ساعة. تم الكشف عن تحول في توزيع الجليكان في عينات ضربة قاضية. على وجه الخصوص ، يتم تقليل الوفرة النسبية للهياكل الرئيسية الأساسية (G0F) بينما يتم زيادة الأنواع الأفوسيلية في تجربة الضربة القاضية. وأجريت القياسات من عينات التجربة G (انظر الجدول 2). تم خلط الثلاثية البيولوجية التي أجريت لكل تجربة بعد الحصاد لتقليل عبء التحليل النهائي. أعيد طبعها من كوتيديس وآخرون. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">اسم التجربة</td>
			<td colspan="2">طريقة الكهربية</td>
			<td colspan="2">تركيز الحمض النووي الريبوزي المرسال (nΜ)</td>
			<td>وقت الحصاد (ح)</td>
			<td>الجدوى (٪)</td>
			<td colspan="2">الخامس عشر (106 خلايا·مل-1)</td>
			<td>عيار IgG (ملغ· L-1)</td>
			<td colspan="2">الفرق في قلب فوكوسيل (٪)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">ه2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">ه3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">ه٤</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه٤</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">ه1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2. تحسين النقل. أدت التعديلات التكرارية لطريقة الكهربية ، وتركيز DsiRNA ، ووقت الحصاد إلى تغييرات في صلاحية الخلية ، وكثافة الخلايا القابلة للحياة ، وعيار IgG في وقت الحصاد ، والاختلافات في fucosylation الأساسية. قارنت كل تجربة بين الضربة القاضية والتحكم السلبي المعني لتحديد ما إذا كان التعديل ينتج التأثير المطلوب (أي انخفاض في الفيكوزيلج). وكانت إعدادات الكهربية على النحو التالي: e1: 1200 فولت ، 0.1 مللي ثانية ، الشكل الموجي المربع. e2: 1200 فولت ، 2 × 0.1 مللي ثانية ، 5 ثانية بين النبضات ، الشكل الموجي المربع ؛ e3: 150 فولت ، 20 مللي ثانية ، الشكل الموجي المربع ؛ e4: 250 فولت ، 500 ميكروفهرنهايت ، الاضمحلال الأسي. أعيد طبعها من كوتيديس وآخرون. 52.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

يحدد نمط الجليكوزيل للجسم المضاد أدائه السريري ، وبالتالي تستمر الجهود الصناعية والأكاديمية للسيطرة على الجليكوزيل. نظرا لأن حملات هندسة الجليكوزين النموذجية تتطلب وقتا طويلا وعمالة ، فإن إنشاء بروتوكول سريع لتوصيف تأثير جينات الجليكوزيل باستخدام إسكات عابر سيكون مفيدا.

هندسة جليكو الأجسام المضادة السريعة في خلايا مبيض الهامستر الصينية

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص تأثير إنزيمات الغليكوزيل المتعددة على ملف تعريف الجليكو للبروتين المستهدف والمساهمة في فهم أفضل لوظائف الإنزيم. تسمح طبيعة البروتوكول بفحص إنزيمات الغليكوزيل بطريقة عابرة ، ولكنها عالية الإنتاجية. يمكن أن يؤدي تغيير ملامح الغليكوزيل إلى تحسين أنشطة الأجسام المضادة ، وبالتالي زيادة فعالية المنتج النهائي.تراقب شركات الأدوية الحيوية عن كثب الجليكوزيل كسمة جودة حرجة. الغليكوزيل الشاذ هو السمة المميزة لأمراض مثل السرطان. لذلك ، هذه الطريقة ذات صلة بالبحوث الدوائية والطبية الحيوية.يفترض البروتوكول أن المستخدمين لديهم خبرة في العديد من التقنيات التجريبية ، بما في ذلك نقل خلايا الثدييات والبقع الغربية. من الأفضل البدء بعينات أقل واستخدام نقاط التوقف في المقام الأول. ابدأ بتقييم كثافة وجدوى خلايا مبيض الهامستر الصيني.بعد ذلك ، قم بتنظيف خزانة السلامة البيولوجية وجميع المعدات بعناية باستخدام 70٪ من الإيثانول ومحلول مثبط RNase لتجنب التلوث. بعد ذلك ، قم بتكوير الخلايا عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق وإعادة تعليقها في وسط تم تسخينه مسبقا بكثافة خلية تبلغ خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. انقل ثمانية ميكرولترات من المزيج الرئيسي DsiRNA أو التحكم إلى كوفيت كهربائي معقم.أضف 800 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى نفس الكوفيت ، واخلطه ، وقم بتوصيل نبضة الكهرب. ثم ، انقل تعليق الخلية من الكوفيت إلى بئر واحد من صفيحة من ستة آبار ، وتجنب المواد الشبيهة بالرغوة. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق دون اهتزاز.بعد الحضانة ، أضف 800 ميكرولتر من الوسائط التي تم تسخينها مسبقا لجعل الحجم النهائي 1.6 ملليلتر لكل بئر. تنمو الخلايا المنقولة في الحاضنة أثناء الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة. بعد 48 ساعة ، حصاد supernatant والخلايا.بعد تنقية IgG ، أضف الاستخلاص A إلى مكثف طرد مركزي بوزن جزيئي يبلغ ثلاثة كيلودالتون ، وجهاز طرد مركزي عند 13،300 مرة G لمدة 40 إلى 50 دقيقة عند أربع درجات مئوية. يكتمل الطرد المركزي بمجرد أن يكون الحجم المتبقي مساويا أو أقل من 50 ميكرولتر. تخلص من التدفق وأضف 500 ميكرولتر من 1X PBS المبردة مسبقا لتخفيف الفائض المتبقي.قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى باستخدام نفس الظروف حتى يبقى 50 ميكرولتر من المواد الفائقة المتبقية. للحصول على تخفيف 100X من supernatant ، أضف 500 ميكرولتر من 1X PBS المبردة مسبقا وكرر عملية الطرد المركزي. ركز المادة الفائقة في تركيز نهائي يبلغ حوالي 2.5 جرام لكل لتر في 40 ميكرولتر لضمان التوافق مع طريقة تحليل الجليكان.لتحليل الجليكان ، انقل 200 ميكرولتر من محلول الخرزة المغناطيسية إلى أنبوب PCR سعة 2 ملليلتر. ضعه على الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن السوبرناتانت وإزالة السوبرناتانت بعناية. ثم ، قم بإزالة الأنابيب من الحامل المغناطيسي وأضف عينة البروتين النقية والدوامة.بعد ذلك ، أضف مخزن تمسخ الإمداد إلى أنبوب العينة واحتضنه لمدة ثماني دقائق عند 60 درجة مئوية. حافظ على أنابيب العينة مفتوحة للحصول على أفضل أداء للتفاعل. بعد الحضانة ، أضف PNGase F واحتضنه لمدة 20 دقيقة أخرى عند 60 درجة مئوية لشق الجليكان من الأجسام المضادة النقية.بعد إطلاق N-glycans ، أغلق أنبوب العينة والدوامة. ثم ، أضف الأسيتونيتريل إلى أنبوب العينة ، الدوامة ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. ضع أنابيب العينة في الحامل المغناطيسي لفصل الخرز عن المحلول.ثم ، باستخدام ماصة ، قم بإزالة supernatant بعناية دون لمس الخرز. أضف محلول وضع العلامات على الجليكان المحتوي على الفلوروفور إلى العينة في غطاء الدخان واخلطه عن طريق الدوامة. بعد حضانة لمدة 20 دقيقة عند 60 درجة مئوية بأغطية مفتوحة ، قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل العينة ثلاث مرات في الأسيتونيتريل.ثم ، قم بتمييع الجليكان المسمى في الماء المقطر المزدوج. ضع أنبوب العينة في الحامل المغناطيسي واجمع السوبرناتانت المخصب بالجليكان النقي والملصق. بعد ذلك ، قم بإعداد وتحميل جميع المعايير والعينات المطلوبة في مواضع الدرج المحددة.قم بتشغيل بروتوكول تحليل الجليكان وتحليل وتحديد الجليكان الموجود في العينة باستخدام البرامج المناسبة. أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاض التعبير عن بروتين Fut8 في الخلايا المنقولة بمزيج من ثلاثة هياكل Fut8 DsiRNA. كما أظهرت هياكل الجليكان من الخلايا القاضية انخفاضا في الاندماج.كان هذا الاتجاه أكثر وضوحا في هياكل agalactosylated ولوحظ بدرجة أقل في الهياكل galactosylated. وقد لوحظ انخفاض بمقدار ضعفين في الفوكوسيل الأساسي من الكهربية باستخدام نبضتين من الموجة المربعة مقارنة بنبضة موجة مربعة واحدة دون اختلافات كبيرة في صلاحية الخلية. بشكل عام ، فإن زيادة تركيز الحمض النووي الريبي قصير التداخل له تداخل كبير على الفوكوسيل الأساسي من زيادة وقت الحصاد.تحدد النسبة بين الماء والأسيتونيتريل ما إذا كان الجليكان في محلول أو جزء من الخرز. من الأهمية بمكان أن نتذكر أثناء خطوات الغسيل لتجنب الإزالة العرضية للجليكان المسمى من المحلول. قد تتضمن تجربة المتابعة توصيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المنقاة باستخدام المقايسات القائمة على الخلايا لتحديد السمية الخلوية المعتمدة على الخلايا المعتمدة على الأجسام المضادة والسمية الخلوية المعتمدة على المكملات.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

مخصص الصينية النامية الهامستر بروتين الخلية المبيض في استضافة فحوصات باستخدام التكنولوجيا الصوتية Microparticle الغشائية

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

سريع عزل الخلايا السرطانية قابلة للحياة اعارة من عينات الدم من المريض

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

سرعة المسح الضوئي الكترون ممغطس الرنين تفتح آفاقا جديدة للالتصوير الناحية الفسيولوجية معلمات هام<em&gt; في فيفو</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

جليكونجينيرينج الأيض حمض اللعابي استخدام N-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

والرزن سريع فوعة جرثومية المستندة إلى الصور استخدام أميبا

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

عملية التحسين باستخدام الإنتاجية العالية الإنتاجية المفاعلات الحيوية الدقيقة الآلية في زراعة الخلايا المبيض الهامستر الصينية

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...