Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
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PK dankt dem Department of Chemical Engineering, Imperial College London, für sein Stipendium. RD dankt dem U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council für sein Studium. MM wird vom U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council finanziert (Grant reference: BB/S006206/1). IAG dankt dem Irish Research Council (Stipendium Nr. GOIPG/2017/1049) und CONACyT (Stipendium Nr. 438330).

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Glykosylierungswege beinhalten ein komplexes metabolisches Netzwerk von Enzymen und akzessorischen Proteinen. Die Sezierung der Funktion von Signalwegsbestandteilen ist entmutigend, wenn sie allein auf konventionelle Knockout- oder Knockin-Gentechnik-Strategien angewiesen ist. Ein alternativer Ansatz besteht darin, Mitglieder eines Pfades vorläufig mit einem transienten Funktionsverlust-Assay zu screenen. Zu diesem Zweck wurden zwei schnelle Protokolle, RNAi- und CGE-LIF-Detektion, kombiniert, um eine effizientere Möglichkeit zur Charakterisierung von Glykosylierungsgenen zu schaffen. Die beschriebene Methode erfordert 5-7 Tage für den Abschluss im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, die möglicherweise mehrere Wochen dauern. Darüber hinaus könnten Forschungsumgebungen mit Automatisierungsfunktionen diese Methode nutzen, um mehr Genkandidaten zu screenen, als mit manueller Handhabung möglich ist.
Der Erfolg einer transienten Glykoengineering-Kampagne hängt maßgeblich vom siRNA-Design ab. Benutzerdefinierte DsiRNA-Designs müssen den zuvor beschriebenen Regeln entsprechen, oder der Einfachheit halber können sich Benutzer für kommerziell erhältliche vorgefertigte Sequenzen entscheiden. Wie andere Genmodifikationsstrategien hat RNAi das Potenzial für Off-Target-Effekte. Daher werden die Nutzer ermutigt, unbeabsichtigtes Gen-Targeting mit Berechnungsmethoden zu bewerten41. Experimentelle Designentscheidungen können auch dazu beitragen, Off-Target-Effekte zu begrenzen. Kittler et al. zeigten, dass die gemultiplexte Abgabe von siRNA zu einer Verringerung der Off-Target-Effekte führte42. Obwohl dies kontraintuitiv erscheint, wird vorgeschlagen, dass ein Master-Mix die Konzentration jedes siRNA-Konstrukts reduziert und somit die Möglichkeit eines Off-Target-Gen-Silencings einschränkt. Ein weiterer Vorteil ist, dass die gleichzeitige Transfektion von siRNA-Strukturen, die auf dasselbe Gen abzielen, die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen RNAi erhöht. Die Verwendung eines Master-Mixes gewährleistet auch die Konsistenz zwischen Proben und Replikaten und beschleunigt den Transfektionsprozess. Nach einem ersten Screening von gemischten siRNA-Konstrukten kann ein weiteres Experiment mit einzelnen Konstrukten durchgeführt werden, um die RNAi-Effizienz jeder Sequenz zu bestimmen. In dieser und anderen Knockdown-Studien wurden bis zu drei siRNA gepoolt und an die Zellenabgegeben 43,44,45. Es kann jedoch wünschenswert sein, mehr als drei siRNA gleichzeitig zu screenen, um effizient auf ein einzelnes Gen oder mehrere Gene abzuzielen. Tatsächlich zeigte eine Studie ein gemultiplextes siRNA-vermitteltes Silencing von bis zu sechs Genen in Konzentrationen, die mit dem Silencing einzelner Gene vergleichbar sind46. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die maximale Anzahl von siRNA-Konstrukten zu bestimmen, die in einem Pool verwendet werden können, ohne die Stummschaltungseffizienz zu beeinträchtigen. Die Multiplex-Strategie wurde von Martin et al. vorgeschlagen, um das Tempo der RNAi-Bibliotheks-Screening-Experimente zu verbessern46, und ein ähnliches Konzept könnte sich als nützlich erweisen, um Glykosylierungsgene zu screenen.
Das hierin beschriebene Protokoll dient als Proof-of-Concept mit der Erwartung, dass nachfolgende Experimente durchgeführt werden, um andere Glykosylierungsgene zu validieren. Neue Gene von Interesse können uncharakterisiert oder weniger beliebt sein als Fut8, und primäre Antikörper zum Nachweis von Gen-Silencing können schlecht oder nicht verfügbar sein. In diesem Szenario können alternative Methoden wie die RT-PCR verwendet werden, um das Gen-Silencing47 zu quantifizieren, aber es sollte beachtet werden, dass RT-PCR eher mRNA als Protein nachweist. Wenn Antikörper für Western Blotting verfügbar sind, ist ein häufiges Problem ein schlechter Nachweis oder das Vorhandensein unspezifischer Banden. Anleitungen zur Fehlerbehebung, die Benutzern bei der Lösung häufiger Probleme helfen, sind verfügbar, und diese umfassen in der Regel eine Reihe von Lösungen wie primäre Antikörpertitrierung, alternative Blockierung und Nachweisbedingungen48,49. In dieser Studie erschien FUT8 unerwartet als Doppelband bei ~65 und ~70 kDa. Es ist möglich, dass das ~70 kDa-Band glykosyliertes FUT8 darstellt. Literaturnachweise aus menschlichen Zelllinien beschreiben die O-verknüpfte Glykosylierung bei Thr 56450,51, einer Stelle, die in chinesischen Hamster-Sequenzen konserviert ist, und CHO K1 FUT8-Sequenzen.
Wie bereits erwähnt, beinhalten Glykosylierungswege oft eine komplexe Reihe von Enzymen. Das aktuelle Protokoll wurde unter Verwendung einer monogenen Glykosylierungsreaktion, die von Fut8 kontrolliert wird, entwickelt, optimiert und demonstriert. Daher sind weitere Studien erforderlich, um die Robustheit dieser Methode zu bestätigen, wenn das Zielgen für ein Enzym mit abwechselnder Kinetik und Expressionsniveaus oder einen durch Isoenzyme mit redundanten Funktionen regulierten Weg kodiert.
Zusammengenommen ist die Fähigkeit, Gene schnell zum Schweigen zu bringen und modifizierte IgG-Glykoprofile zu erkennen, ein nützliches Werkzeug bei den Bemühungen um maßgeschneiderte glykotechnische Antikörper. Erkenntnisse aus ähnlichen Kurzzeitstudien können angewendet werden, um stabile glykotechnisch hergestellte Zellen für den Einsatz in Langzeitassays wie der Fed-Batch-Kultur zu erzeugen. Außerhalb des pharmazeutischen Kontextes trägt diese Methode zum Studium der Glykanbiologie bei und hebt die wichtige Funktion von Glykanen bei Entwicklung, Gesundheit und Krankheit hervor.

Die N-verknüpfte Glykosylierung ist ein enzymatischer Prozess, bei dem Oligosaccharid-Einheiten kovalent an Asn-Reste gebunden werden. Im Gegensatz zur De-novo-Proteinsynthese ist die Glykansynthese eine nicht vorlagenbasierte Reaktion, die zu einer heterogenen Glykosylierung von Proteinen führt. Die Struktur, Zusammensetzung und Verteilung von Glykanen kann die Proteinkonformation und -funktion beeinflussen. Tatsächlich reguliert die N-Glykosylierung in der Region des Immunglobulins G (IgG) im Bereich des kristallisierbaren Fragments (Fc) die therapeutische Wirksamkeit, Immunogenität und Halbwertszeit des Antikörpers1. Daher identifiziert das QbD-Paradigma (Quality by Design) für die Entwicklung rekombinanter biotherapeutischer Proteinprodukte die Glykosylierung auf natürliche Weise als kritisches Qualitätsmerkmal (CQA)2,3. Säugetierzellen sind oft die bevorzugten Expressionssysteme, da sie von Natur aus menschenähnliche Glykosylierungsmuster stärker produzieren als Bakterien, Hefen, Insekten oder Pflanzenzellen. Darüber hinaus werden Chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO) über anderen Säugetierzelllinien ausgewählt, da sie resistent gegen menschliche Virusinfektionen sind, Produkte bei hohen Titern absondern und in Suspensionskultur zu hohen lebensfähigen Zelldichten gezüchtetwerden können 4. In Bezug auf die Glykanbildung erzeugen nicht-CHO-murine Produktionszellen immunogene Glykane (α(1-3)-verknüpfte Galactose [α(1-3)-Gal] und N-Glykolylneuraminsäure [NeuGc]), die die sichere Verwendung von monoklonalen Antikörpern (mAbs)5 beeinträchtigen. Diese Vorteile machen CHO-Zellen zum führenden Expressionssystem, das für die Produktion von über 80% der neuen Biotherapeutika zwischen 2014 und 2018 verantwortlichist 6. Die vorlagenunabhängige Glykosylierung ist jedoch ein konservierter Mechanismus, der zu CHO-abgeleiteten Biotherapeutika mit einer Reihe von Glykoformen führt.
Biotherapeutische Entwicklungsstrategien zielen darauf ab, die Heterogenität in CHO-Zellen durch Gentechnik zu kontrollieren. Einige Literaturbeispiele sind der Knockdown von Sialidasen (Neu1, Neu3)7, GDP-Mannose 4,6-Dehydratase (GMD) Knockout8 und Überexpression von Glykosyltransferasen (GnTIII)9. Fortschritte im Glykoengineering sind möglich durch eine Kombination von öffentlich zugänglichen Ressourcen, wie dem CHO-Genom10, und der laufenden Entwicklung gentechnischer Werkzeuge, wie Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs), Zinkfingernukleasen (ZFNs) und geclusterte regelmäßig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-assoziiertes Protein 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Diese Werkzeuge werden typischerweise als Plasmid-DNA oder als gereinigte Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexe an CHO-Zellen abgegeben. Umgekehrt ist die RNA-Interferenz (RNAi) eine gentechnische Technologie, die in ihrer einfachsten Form nur die Abgabe von gereinigten kurzen störenden RNA (siRNA) Oligonukleotiden erfordert. Endogene Proteine verarbeiten doppelsträngige siRNA zu Einzelsträngen, und die Nuklease, RNA-induzierter Silencing-Komplex (RISC), bildet einen Komplex mit siRNA, um die Ziel-mRNA-Sequenzen15,16,17 zu spalten. Das Gen-Silencing über diese Methode ist aufgrund der RNA-Instabilität vorübergehend, aber die Untersuchung hierin nutzt diese Funktion, um ein schnelles Screening zu unterstützen.
Das für die aktuelle Studie ausgewählte Modellenzym, die α1,6-Fucosyltransferase (FUT8), produziert N-Glykane mit α-1,6-kerngebundener L-Fucose (Fuc). Diese Modifikation ist eine primäre Determinante der antikörperabhängigen Zellzytotoxizität (ADCC), wie Studien an kommerziellen Antikörpern belegen. In Ermangelung einer Kernfukosylierung erhöht Rituximab (Anti-CD20-IgG1) den ADCC um das 50-fache und erhöht den ADCC in Trastuzumab (Anti-Her2-IgG1) durch Verbesserung der FcgRIIIa-Bindung18,19. Die Kernfucosylierung wird daher als unerwünschtes Merkmal von mAbs angesehen, das Bemühungen zur Umkehrung dieses Phänotyps rechtfertigt. Es gibt Beispiele für erfolgreiches Fut8-Gen-Targeting unter Verwendung von siRNA mit gleichzeitigem Anstieg des ADCC20,21,22, obwohl diese Beispiele Fut8-siRNA liefern, die auf Plasmid-DNA kodiert ist. Solche Experimente erzeugen ein stabiles Gen-Silencing, da Plasmid-DNA als Vorlage für die siRNA-Synthese dient. Dies ermöglicht es den Zellen, siRNA-Moleküle aufzufüllen, die durch intrazelluläre RNasen und Phosphatasen abgebaut werden. Umgekehrt erlaubt die Abgabe von exogener synthetischer siRNA nur ein vorübergehendes Gen-Silencing, da siRNA aufgrund des Fehlens einer intrazellulären Vorlage nicht wieder aufgefüllt werden kann. Daher sollten Anwender überlegen, ob experimentelle Designs mit plasmidabgeleiteter oder synthetischer siRNA kompatibel sind. Zum Beispiel können Studien, die sich auf die maximale mAb-Produktion konzentrieren, typischerweise Tag sechs der Kultur23,24, sich für synthetische siRNA entscheiden, die einige Tage vor der Spitzenexpression an Zellen abgegeben werden kann. Zu den Vorteilen eines transienten Ansatzes unter Verwendung synthetischer siRNA gehören die Möglichkeit, die Produktion auszulagern, und die Tatsache, dass mehrere siRNA-Konstrukte in einem Bruchteil der Zeit erzeugt werden können, die zur Erzeugung von Konstrukten in Plasmiden benötigt wird. Darüber hinaus ist synthetische siRNA wirksam, wie Literaturbeispiele für Fut8-Gen-Silencing belegen, die ausreichen, um die FUT8-Proteinexpression25 zu reduzieren und afucosylierte IgGs mit erhöhter FCgRIIIa-Bindung und ADCC26 zu erhalten.
Der Erfolg dieses Glykoengineering-Protokolls wurde durch den Grad der Fc-Glykosylierung bestimmt. Die Massenspektrometrie ist normalerweise die Methode der Wahl für glykomische Analysen; Die Kapillargelelektrophorese und die laserinduzierte Fluoreszenzdetektion (CGE-LIF) eignen sich jedoch hervorragend zum Auflösen des Glykoprofils gereinigter IgGs und haben den Vorteil einer größeren Schnelligkeit und Einfachheit. Massenspektrometrieprotokolle müssen die entsprechenden chromatographischen und Derivatisierungsmethoden, Ionisationsquellen und Massenanalysatoren 27,28,29 kombinieren. Massenspektrometrieprotokolle erfordern nicht nur einen ausgebildeten Spezialisten, sondern sind auch langwierig, und die Vielfalt der Methoden macht es schwierig, Daten zwischen Labors mit unterschiedlichen Setups zu vergleichen. Im Kontext von Biopharmazeutika ist CGE-LIF eine empfindliche Methode, die ausreichende Details eines Antikörperglykoprofils liefern kann und für Hochdurchsatzmethoden leicht skalierbar ist. Bei niederfrequenten, hochkomplexen Gemischen mit schlecht charakterisierten Glykoproteinen könnten die Vorteile der Massenspektrometrie bestehen bleiben. Die hochauflösende und hochempfindliche mAb-Analytik, die durch die CGE-LIF-basierte N-Glykan-Analyse ermöglicht wird, dient jedoch als Begründung für die Erprobung dieser Methode. Darüber hinaus sind die Probenvorbereitung und -analyse in nur wenigen Stundenabgeschlossen 30. Jüngste Studien haben gezeigt, dass CGE-LIF zur Überwachung von Glykanen aus menschlichem Plasma31, Maus32 und CHO IgGs33 verwendet werden kann. Diese Studien unterstreichen die Verwendung von CGE-LIF für die Hochdurchsatz-Probenanalyse und kleine Probenvolumina.
Die CGE-LIF-Methode weist Einschränkungen auf, die berücksichtigt werden sollten. Die Kosten sind ein erhebliches Hindernis für die Verwendung dieses und anderer Geräte für die Glykananalyse. Diese Kosten sind jedoch typisch für das Feld, und CGE-LIF gilt als kostengünstige Option34. Labore mit kleineren Budgets können es praktischer finden, Maschinen zu leasen oder die Probenanalyse auszulagern. Eine weitere Überlegung jeder analytischen Methode ist die Wiederholbarkeit. Die Evaluierung von CGE-LIF wurde unter Verwendung von 48 Replikaten derselben Probe durchgeführt, die an verschiedenen Tagen untersucht wurden. Die relative Standardabweichung pro Kapillare wurde für die Intrabatch- und Interbatch-Wiederholbarkeit bestimmt. Der Intrabatch-Vergleich von Replikaten wies eine relative Standardabweichung von 6,2% auf, was darauf hindeutet, dass die Kapillarleistung nicht einheitlich ist. Darüber hinaus zeigte ein Vergleich der Interbatch-Daten eine relative Standardabweichung von 15,8 %31, was darauf hindeutet, dass sich die Kapillarleistung im Laufe der Zeit ändert. Die festgestellten betrieblichen Mängel gelten möglicherweise nicht für die aktuelle Studie, bei der andere Maschinen und proprietäre Reagenzien verwendet werden. Wenn Benutzer beabsichtigen, ein internes Protokoll zu entwickeln, lohnt es sich, die Studie von Ruhaak et al. in Betracht zu ziehen. 31, die die Reagenzien für CGE-LIF sorgfältig bewertete. Daher wurden die Reagenzien für die Probeninjektion (Hi-Di-Formamid und DMSO), die Glykanmarkierung (NaBH3CN oder 2-Picolin-Boran)31 und andere optimiert.
Diese Studie präsentiert ein zeiteffizientes Glykoengineering-Protokoll, das die Schnelligkeit der direkten RNAi mit der nachgeschalteten glykomischen Analyse kombiniert. Die Methodik wird anhand des Fut8-Gens als Ziel aus den oben genannten Gründen veranschaulicht.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

Rekombinante monoklonale Antikörper binden spezifische molekulare Ziele und induzieren anschließend eine Immunantwort oder hemmen die Bindung anderer Liganden. Die monoklonale Antikörperfunktionalität und Halbwertszeit kann jedoch durch die Art und Verteilung der wirtsspezifischen Glykosylierung verringert werden. Versuche, überlegene Antikörper zu produzieren, haben die Entwicklung gentechnisch veränderter Produzentenzellen inspiriert, die glykooptimierte Antikörper synthetisieren. Glykoengineering erfordert typischerweise die Erzeugung einer stabilen Knockout- oder Knockin-Zelllinie unter Verwendung von Methoden wie dem Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-assoziierten Protein 9. Monoklonale Antikörper, die von künstlichen Zellen hergestellt werden, werden dann mit massenspektrometrischen Methoden charakterisiert, um festzustellen, ob das gewünschte Glykoprofil erhalten wurde. Diese Strategie ist zeitaufwendig, technisch anspruchsvoll und erfordert Spezialisten. Daher kann eine alternative Strategie, die optimierte Protokolle für das genetische Glykoengineering und den Glykannachweis verwendet, die Bemühungen um optimale Antikörper unterstützen. In dieser Proof-of-Concept-Studie diente eine IgG-produzierende chinesische Hamster-Eierstockzelle als idealer Wirt, um das Glykoengineering zu optimieren. Kurze störende RNA, die auf das Fut8-Gen abzielte, wurden an chinesische Hamster-Eierstockzellen abgegeben, und die daraus resultierenden Veränderungen in der FUT8-Proteinexpression wurden quantifiziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Knockdown mit dieser Methode effizient war, was zu einer ~ 60% igen Reduktion von FUT8 führte. Die komplementäre Analyse des Antikörperglykoprofils wurde mit einer schnellen, aber hochempfindlichen Technik durchgeführt: Kapillargelelektrophorese und laserinduzierter Fluoreszenzdetektion. Alle Knockdown-Experimente zeigten einen Anstieg der afucosylierten Glykane; Die größte Verschiebung, die in dieser Studie erreicht wurde, betrug jedoch ~ 20%. Dieses Protokoll vereinfacht die Glykoengineering-Bemühungen durch die Nutzung von In-silico-Design-Tools , kommerziell synthetisierten Gen-Targeting-Reagenzien und schnellen Quantifizierungsassays, die keine umfangreichen Vorkenntnisse erfordern. Daher können die von diesem Protokoll gebotenen Zeiteffizienzen die Untersuchung neuer Genziele unterstützen.

Die Western-Blot-Analyse zeigte eine reduzierte FUT8-Proteinexpression in Zellen, die mit einer Mischung aus drei Fut8-DsiRNA-Konstrukten transfiziert wurden. In Kontrollproben, die mit nicht zielgerichteter DsiRNA transfiziert wurden, erschien FUT8 als Doppelband bei ~65 und 70 kDa. Da das vorhergesagte Molekulargewicht von FUT8 66 kDa beträgt, ist eine Verringerung der Signalintensität des unteren Molekulargewichtsbandes ein Hinweis auf Gen-Silencing. Um das Gen-Silencing zu bestätigen und zu quantifizieren, wurde der FUT8-Proteinspiegel auf den relativen GAPDH-Proteinspiegel normalisiert. Die Western-Blot-Analyse ergab zwei Banden für GAPDH bei ~37 und 35 kDa. Das höhere Molekulargewichtsband entspricht der vorhergesagten Proteingröße und wird daher in Normalisierungsberechnungen verwendet. Bei Normalisierung gegen GAPDH-Proteinspiegel wurde die FUT8-Proteinexpression um bis zu 60% reduziert (Abbildung 1).
Im Einklang mit der Beobachtung des Gen-Knockdowns bei 48 h nach der Transfektion wurden entsprechende mAb-Proben für die Analyse mittels CGE-LIF aufbereitet. Glykanstrukturen aus Knockdown-Zellen zeigten eine Abnahme der Fukosylierung. Dieser Trend war in agalaktosylierten Strukturen (G0F) am ausgeprägtesten und in geringerem Maße in galaktosylierten Strukturen (G1F, G1F' und G2F) zu beobachten. Aus diesem Datensatz ging hervor, dass die gesamte IgG-Kernfucosylierung auf ~ 75% sank, verglichen mit ~ 95% der Kernfucosylierung, die für die negative Kontrollbedingung beobachtet wurde (Abbildung 2). Eine stärkere Verringerung der Kernfucosylierung wurde angesichts der ~ 60% igen Abnahme des FUT8-Proteinspiegels erwartet. Bei näherer Betrachtung ist es bemerkenswert, dass das Glykoprofil glykosylierte mAbs darstellt, die sich über einen Zeitraum von 48 h seit der Transfektion angesammelt haben, während Gen-Silencing nur Proteinspiegel darstellt, die zum Zeitpunkt der Ernte vorhanden sind.
Eine weitere Untersuchung dieser Knockdown-Methode beinhaltete die Variation der DsiRNA-Konzentration, der Erntezeit und der Elektroporationsbedingungen. Jeder Faktor wurde einzeln untersucht, um seine Relevanz zu bestimmen. Der Einfluss von Elektroporationspulsbedingungen auf die Kernfucosylierung und die Zelllebensfähigkeit wird in den Experimenten B, C, D und E erfasst. Diese Ergebnisse zeigen eine zweifache Reduktion der Kernfucosylierung durch Elektroporation unter Verwendung von zwei Rechteckwellenpulsen (Experiment C) im Vergleich zu einem einzelnen Rechteckwellenpuls (Experiment B), ohne signifikante Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit (Tabelle 2). Die Elektroporationsbedingung e3 (Experiment D) führte zu diesem Zeitpunkt zu der niedrigsten Zelllebensfähigkeit (~ 90%) und IgG-Ausbeute. Zellen, die das Elektroporationsereignis überlebten, waren jedoch mäßig transfiziert, wie die ~ 10% ige Abnahme der Kernfucosylierung zeigt (Tabelle 2). Interessanterweise verwendete Experiment D Elektroporationsbedingungen, die die größte Verringerung der Kernfucosylierung (14,7%) lieferten, aber offensichtlich schädlich für die Zelllebensfähigkeit waren (91% -93% Lebensfähigkeit). Diese begrenzte Anzahl von Experimenten veranschaulicht die Notwendigkeit, Elektroporationseinstellungen zu bestimmen, die eine ausreichende Permeabilisierung der Zellmembran ermöglichen, ohne unwiderrufliche Schäden zu verursachen. Es ist auch interessant, die Rolle der siRNA-Konzentration und der Erntezeit bei der Kernfukosylierung zu beachten. Insgesamt hat die Erhöhung der siRNA-Konzentration einen größeren Einfluss auf die Kernfucosylierung als die Erhöhung der Erntezeit (Experimente B, F, G versus Experimente A, B, H). In zukünftigen Experimenten wäre es interessant, die siRNA-Konzentrationen der Elektroporationsmethode e2 zu titrieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> Abbildung 1. Experimentelles Flussdiagramm. Glykoengineering- und Probenanalyseschritte werden mit der zugehörigen Zeit dargestellt, die für jeden Schritt benötigt wird. Das SiRNA-Design dauert einige Stunden, abhängig von der Anzahl der Genziele oder -konstrukte pro Genziel. Die CHO-Zelltransfektion mit siRNA ist in wenigen Stunden abgeschlossen, und transformierte Zellen können 48 Stunden lang wachsen. Zellpellets und Überstände werden innerhalb weniger Stunden geerntet. Zellpellets werden lysiert, und die intrazellulären Proteine werden auf einer SDS-SEITE getrennt und anschließend mit Antikörpern gegen das Zielgen abgetupft und untersucht. Glykane werden aus gereinigten Antikörpern gespalten und mit CGE-LIF analysiert. Diese Assays können jeweils 1 Tag dauern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> Abbildung 2. Bestätigung der RNA-Interferenz. Western Blot-Nachweis von α-1,6-Fucosyltransferase (FUT8)-Proteinspiegeln in Proben, die mit Fut8 oder Non-Targeting-Kontroll-DsiRNA behandelt wurden. Banden, die FUT8 entsprechen, sind intensiver in der Kontrolle als Fut8-Knockdown-Samples. Der GAPDH-Proteinspiegel wurde ebenfalls bewertet, um die Expression des Zielgens zu normalisieren. Alle Proben wurden aus Experiment G entnommen (siehe Tabelle 2). Nachdruck von Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> Abbildung 3. Wirkung von Fut8-Knockdown auf die kumulative IgG-Glykosylierung bei 48 h. Eine Verschiebung der Glykanverteilung wird in Knockdown-Proben nachgewiesen. Insbesondere wird die relative Häufigkeit der wichtigsten kernfucosylierten Strukturen (G0F) reduziert, während die afucosylierten Spezies im Knockdown-Experiment erhöht werden. Die Messungen wurden anhand von Proben aus Experiment G durchgeführt (siehe Tabelle 2). Biologische Verdreifachungen, die für jedes Experiment durchgeführt wurden, wurden nach der Ernte gemischt, um die Belastung durch nachgelagerte Analysen zu reduzieren. Nachdruck von Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Name des Experiments</td>
			<td colspan="2">Elektroporationsverfahren</td>
			<td colspan="2">DsiRNA-Konzentration (nΜ)</td>
			<td>Erntezeit (h)</td>
			<td>Lebensfähigkeit (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 Zellen·mL-1)</td>
			<td>IgG-Titer (mg· L-1)</td>
			<td colspan="2">Unterschied in der Kern-Fucosylierung (%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">E3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">E4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2. Transfektionsoptimierung. Iterative Modifikationen der Elektroporationsmethode, der DsiRNA-Konzentration und der Erntezeit führten zu Veränderungen der Zelllebensfähigkeit, der lebensfähigen Zelldichte, des IgG-Titers zum Erntezeitpunkt und Unterschieden in der Kernfukosylierung. Jedes Experiment verglich den Knockdown und die jeweilige Negativkontrolle, um festzustellen, ob die Modifikation den gewünschten Effekt erzeugt (d.h. eine Abnahme der Fukosylierung). Die Elektroporationseinstellungen waren wie folgt: e1: 1200 V, 0,1 ms, Rechteckwellenform; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s zwischen den Impulsen, Rechteckwellenform; e3: 150 V, 20 ms, Rechteckwellenform; e4: 250 V, 500 μF, exponentieller Zerfall. Nachdruck von Kotidis et al. 52.

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Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers bestimmt seine klinische Leistung, so dass die industriellen und akademischen Bemühungen zur Kontrolle der Glykosylierung bestehen bleiben. Da typische Glykoengineering-Kampagnen zeit- und arbeitsintensiv sind, würde sich die Erstellung eines schnellen Protokolls zur Charakterisierung der Auswirkungen von Glykosylierungsgenen mittels transienter Silencing als nützlich erweisen.

Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung mehrerer Glykosylierungsenzyme auf das Glykoprofil eines Zielproteins zu untersuchen und zu einem besseren Verständnis der Funktionalitäten des Enzyms beizutragen. Die Art des Protokolls ermöglicht das Screening von Glykosylierungsenzymen in einer vorübergehenden, aber hochdurchlässigen Weise. Veränderte Glykosylierungsprofile können zu verbesserten Antikörperaktivitäten führen und somit die Wirksamkeit des Endprodukts erhöhen.Biopharmazeutische Unternehmen überwachen die Glykosylierung als kritisches Qualitätsmerkmal genau. Eine abweichende Glykosylierung ist ein Kennzeichen von Krankheiten wie Krebs. Daher ist diese Methode für die pharmakologische und biomedizinische Forschung relevant.Das Protokoll geht davon aus, dass Benutzer Erfahrung mit verschiedenen experimentellen Techniken haben, einschließlich der Transfektion von Säugetierzellen und westlichen Flecken. Es ist besser, mit weniger Proben zu beginnen und in erster Linie Haltepunkte zu verwenden. Beginnen Sie mit der Beurteilung der Dichte und Lebensfähigkeit der Ovarialzellen des chinesischen Hamsters.Reinigen Sie dann die Biosicherheitskabine und alle Geräte sorgfältig mit 70% Ethanol und einer RNase-Inhibitorlösung, um eine Kontamination zu vermeiden. Als nächstes pelletieren Sie die Zellen bei 100 mal G für fünf Minuten und suspendieren Sie sie in einem vorerwärmten Medium bei einer Zelldichte von fünf mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie acht Mikroliter des DsiRNA-Master-Mixes oder der Steuerung auf eine sterile Elektroporationsküvette.Fügen Sie 800 Mikroliter der Zellsuspension in dieselbe Küvette hinzu, mischen Sie und geben Sie den Elektroporationspuls ab. Übertragen Sie dann die Zellsuspension von der Küvette auf eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen und vermeiden Sie schaumartiges Material. Inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten ohne zu schütteln.Nach der Inkubation 800 Mikroliter vorerwärmtes Medium hinzufügen, um ein endgültiges Volumen von 1,6 Millilitern pro Vertiefung zu erhalten. Züchten Sie die transfizierten Zellen im Inkubator, während Sie mit 150 U / min schütteln. Nach 48 Stunden den Überstand und die Zellen ernten.Nach der IgG-Reinigung die Elution A auf einen Drei-Kilodalton-Molekulargewichts-Cutoff-Zentrifugalkonzentrator geben und bei 13.300 mal G für 40 bis 50 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Zentrifugation ist abgeschlossen, sobald das Restvolumen gleich oder kleiner als 50 Mikroliter ist. Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie 500 Mikroliter vorgekühltes 1X PBS hinzu, um den verbleibenden Überstand zu verdünnen.Zentrifen Sie die Probe erneut unter den gleichen Bedingungen, bis 50 Mikroliter Restüberstand übrig sind. Um eine 100-fache Verdünnung des Überstands zu erhalten, fügen Sie 500 Mikroliter vorgekühltes 1X PBS hinzu und wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess. Konzentrieren Sie den Überstand auf eine Endkonzentration von etwa 2,5 Gramm pro Liter in 40 Mikrolitern, um die Kompatibilität mit der Glykananalysemethode sicherzustellen.Für die Glykananalyse werden 200 Mikroliter der magnetischen Perlenlösung in ein 2-Milliliter-PCR-Röhrchen übertragen. Legen Sie es auf den Magnetständer, um die Perlen vom Überstand zu trennen und den Überstand vorsichtig zu entfernen. Entfernen Sie dann die Röhrchen aus dem Magnetständer und fügen Sie die gereinigte Proteinprobe und den Wirbel hinzu.Als nächstes fügen Sie den Versorgungsdenaturierungspuffer zum Probenröhrchen hinzu und inkubieren Sie acht Minuten lang bei 60 Grad Celsius. Halten Sie die Probenröhrchen offen, um eine optimale Reaktionsleistung zu erzielen. Nach der Inkubation PNGase F hinzufügen und weitere 20 Minuten bei 60 Grad Celsius inkubieren, um Glykane von den gereinigten Antikörpern zu trennen.Nach der Freisetzung von N-Glykanen das Probenröhrchen und den Wirbel schließen. Dann fügen Sie Acetonitril zum Probenröhrchen hinzu, wirbeln Sie es vor und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Minute. Legen Sie die Probenröhrchen in den Magnetständer, um die Perlen von der Lösung zu trennen.Entfernen Sie dann vorsichtig mit einer Pipette den Überstand, ohne die Perlen zu berühren. Die fluorophorhaltige Glykan-Markierungslösung in die Probe in einem Abzug geben und durch Vortexen mischen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 60 Grad Celsius mit offenen Deckeln entfernen Sie überschüssigen Farbstoff, indem Sie die Probe dreimal in Acetonitril waschen.Dann eluieren Sie die markierten Glykane in doppelt destilliertem Wasser. Legen Sie das Probenröhrchen in den Magnetständer und sammeln Sie den mit gereinigten und markierten Glykanen angereicherten Überstand. Als nächstes bereiten Sie alle erforderlichen Standards und Proben vor und laden Sie sie in die dafür vorgesehenen Tray-Positionen.Führen Sie das Glykananalyseprotokoll aus und analysieren und identifizieren Sie die in der Probe vorhandenen Glykane mit der entsprechenden Software. Die Western-Blot-Analyse zeigte eine reduzierte Fut8-Proteinexpression in Zellen, die mit einer Mischung aus drei Fut8-DsiRNA-Konstrukten transfiziert wurden. Glykanstrukturen aus den Knockdown-Zellen zeigten ebenfalls eine verminderte Fukosylierung.Dieser Trend war in agalaktosylierten Strukturen am ausgeprägtesten und in geringerem Maße in galaktosylierten Strukturen zu beobachten. Eine zweifache Reduktion der Kernfucosylierung wurde durch Elektroporation unter Verwendung von zwei Rechteckwellenpulsen im Vergleich zu einem einzelnen Rechteckwellenpuls ohne signifikante Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit beobachtet. Insgesamt hat die Erhöhung der kurzgradig störenden RNA-Konzentration eine große Störung der Kernfucosylierung als die Erhöhung der Erntezeit.Das Verhältnis zwischen Wasser und Acetonitril bestimmt, ob Glykane in Lösung oder Teil der Kügelchen sind. Es ist wichtig, sich während der Waschschritte daran zu erinnern, um ein versehentliches Entfernen der markierten Glykane aus der Lösung zu vermeiden. Ein Folgeexperiment könnte die Charakterisierung gereinigter monoklonaler Antikörper unter Verwendung zellbasierter Assays zur Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität und der komplementabhängigen Zytotoxizität beinhalten.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Forschung

Biotechnik

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Schnelle Isolierung von lebensfähigen zirkulierende Tumorzellen von Patientenblutproben

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

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Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

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Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

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