Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

पीके ने अपनी छात्रवृत्ति के लिए इंपीरियल कॉलेज लंदन के केमिकल इंजीनियरिंग विभाग को धन्यवाद दिया। आरएंडडी ने अपनी छात्रवृत्ति के लिए यूके बायोटेक्नोलॉजी एंड बायोलॉजिकल साइंसेज रिसर्च काउंसिल को धन्यवाद दिया। एमएम यूके जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (अनुदान संदर्भ: बीबी / आईएजी आयरिश अनुसंधान परिषद (छात्रवृत्ति सं। जीओआईपीजी/2017/1049) और कोनासाइट (छात्रवृत्ति संख्या 438330)।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

ग्लाइकोसिलेशन मार्गों में एंजाइमों और सहायक प्रोटीन का एक जटिल चयापचय नेटवर्क शामिल है। मार्ग घटकों के कार्य को विच्छेदन करना चुनौतीपूर्ण है यदि पारंपरिक नॉकआउट या अकेले आनुवंशिक इंजीनियरिंग रणनीतियों पर निर्भर है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रारंभिक रूप से एक क्षणिक हानि-ऑफ-फ़ंक्शन परख का उपयोग करके एक मार्ग के सदस्यों को स्क्रीन करना है। इस अंत में, ग्लाइकोसिलेशन जीन को चिह्नित करने के लिए एक अधिक कुशल तरीका बनाने के लिए दो रैपिड प्रोटोकॉल, आरएनएआई और सीजीई-एलआईएफ डिटेक्शन को जोड़ा गया था। वर्णित विधि को पारंपरिक तरीकों की तुलना में पूरा होने के लिए 5-7 दिनों की आवश्यकता होती है जो संभावित रूप से पूरा होने में कई सप्ताह लगते हैं। इसके अलावा, स्वचालन क्षमताओं के साथ अनुसंधान वातावरण मैनुअल हैंडलिंग के साथ संभव से अधिक जीन उम्मीदवारों को स्क्रीन करने के लिए इस पद्धति का फायदा उठा सकता है।
एक क्षणिक ग्लाइकोइंजीनियरिंग अभियान की सफलता काफी हद तक सीआरएनए डिजाइन पर निर्भर है। कस्टम DsiRNA डिज़ाइन को पहले उल्लिखित नियमों का पालन करना चाहिए, या आसानी के लिए, उपयोगकर्ता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व डिज़ाइन किए गए अनुक्रमों का विकल्प चुन सकते हैं। अन्य जीन संशोधन रणनीतियों की तरह, आरएनएआई में ऑफ-टारगेट प्रभावों की क्षमता है। इसलिए, उपयोगकर्ताओं को कम्प्यूटेशनल विधियों द्वारा अनजाने जीन लक्ष्यीकरण का आकलन करने के लिए प्रोत्साहितकिया जाता है 41. प्रायोगिक डिजाइन विकल्प ऑफ-टारगेट प्रभावों को सीमित करने में भी मदद कर सकते हैं। किटलर एट अल से पता चला है कि एसआईआरएनए की मल्टीप्लेक्स डिलीवरी ने ऑफ-टारगेट प्रभाव42 में कमी का नेतृत्व किया। यद्यपि यह प्रतिकूल लगता है, यह सुझाव दिया जाता है कि एक मास्टर मिश्रण प्रत्येक सिरना निर्माण की एकाग्रता को कम करता है, इस प्रकार ऑफ-टारगेट जीन साइलेंसिंग के अवसर को सीमित करता है। एक और लाभ यह है कि एक ही जीन को लक्षित करने वाली एसआईआरएनए संरचनाओं का एक साथ अभिकर्मक सफल आरएनएआई की संभावना को बढ़ाता है। एक मास्टर मिश्रण का उपयोग नमूनों और प्रतिकृतियों के बीच स्थिरता भी सुनिश्चित करता है और अभिकर्मक प्रक्रिया को गति देता है। मिश्रित एसआईआरएनए निर्माणों की प्रारंभिक स्क्रीन के बाद, प्रत्येक अनुक्रम की आरएनएआई दक्षता का पता लगाने के लिए व्यक्तिगत निर्माणों का उपयोग करके एक और प्रयोग किया जा सकता है। इस और अन्य नॉकडाउन अध्ययनों में, तीन एसआईआरएनए को पूल किया गया है औरकोशिकाओं 43,44,45 तक पहुंचाया गया है। हालांकि, एक जीन को कुशलतापूर्वक लक्षित करने या कई जीनों को लक्षित करने के लिए एक साथ तीन से अधिक एसआईआरएनए को स्क्रीन करना वांछनीय हो सकता है। दरअसल, एक अध्ययन ने व्यक्तिगत जीन46 के चुप्पी के बराबर स्तर पर छह जीनों तक के मल्टीप्लेक्स सिआरएनए-मध्यस्थता चुप्पी का प्रदर्शन किया। हालांकि, सिआरएनए निर्माणों की अधिकतम संख्या निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है जिनका उपयोग साइलेंसिंग दक्षता से समझौता किए बिना पूल में किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स रणनीति मार्टिन एट अल द्वारा प्रस्तावित की गई थी आरएनएआई लाइब्रेरी स्क्रीनिंग प्रयोगों46 की गति को बढ़ाने के लिए, और इसी तरह की अवधारणा ग्लाइकोसिलेशन जीन को स्क्रीन करने के लिए उपयोगी साबित हो सकती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल इस उम्मीद के साथ एक सबूत-अवधारणा के रूप में कार्य करता है कि बाद के प्रयोगों को अन्य ग्लाइकोसिलेशन जीन को मान्य करने के लिए किया जाएगा। ब्याज के नए जीन Fut8 की तुलना में अनिर्दिष्ट या कम लोकप्रिय हो सकते हैं, और जीन साइलेंसिंग का पता लगाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी खराब या अनुपलब्ध हो सकते हैं। इस परिदृश्य में, आरटी-पीसीआर जैसे वैकल्पिक तरीकों का उपयोग जीन साइलेंसिंग47 को मापने के लिए किया जा सकता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरटी-पीसीआर प्रोटीन के बजाय एमआरएनए का पता लगाता है। जब पश्चिमी सोख्ता के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध होते हैं, तो एक सामान्य मुद्दा खराब पहचान या गैर-विशिष्ट बैंड की उपस्थिति है। उपयोगकर्ताओं को सामान्य समस्याओं को हल करने में मदद करने के लिए समस्या निवारण मार्गदर्शिकाएँ उपलब्ध हैं, और इनमें प्राथमिक एंटीबॉडी अनुमापन, वैकल्पिक अवरुद्ध और पता लगाने की स्थिति48,49 जैसे समाधानों की एक श्रृंखला शामिल है। इस अध्ययन में, एफयूटी 8 अप्रत्याशित रूप से ~ 65 और ~ 70 केडीए पर डबल बैंड के रूप में दिखाई दिया। यह संभव है कि ~ 70 केडीए बैंड ग्लाइकोसिलेटेड एफयूटी 8 का प्रतिनिधित्व करता है। मानव कोशिका रेखाओं से साहित्य साक्ष्य थ्र 56450,51 पर ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन का वर्णन करता है, एक साइट जो चीनी हैम्स्टर में संरक्षित है, और सीएचओ के 1 एफयूटी 8 अनुक्रम।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ग्लाइकोसिलेशन मार्गों में अक्सर एंजाइमों की एक जटिल सरणी शामिल होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल को Fut8 द्वारा नियंत्रित मोनोजेनिक ग्लाइकोसिलेशन प्रतिक्रिया का उपयोग करके विकसित, अनुकूलित और प्रदर्शित किया गया है। इसलिए, इस पद्धति की मजबूती की पुष्टि करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है जब लक्ष्य जीन वैकल्पिक कैनेटीक्स और अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक एंजाइम को एन्कोड करता है या अनावश्यक कार्यों के साथ आइसोएंजाइम द्वारा विनियमित मार्ग होता है।
एक साथ लिया गया, जीन को तेजी से चुप कराने और संशोधित आईजीजी ग्लाइकोप्रोफाइल्स का पता लगाने की क्षमता कस्टम ग्लाइकोइंजिनियर एंटीबॉडी के प्रयास में एक उपयोगी उपकरण है। इसी तरह के अल्पकालिक अध्ययनों से अंतर्दृष्टि को फेड-बैच संस्कृति जैसे दीर्घकालिक परखों में उपयोग के लिए स्थिर ग्लाइकोइंजिनियर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है। दवा संदर्भ के बाहर, यह विधि ग्लाइकन जीव विज्ञान के अध्ययन में योगदान देती है और विकास, स्वास्थ्य और बीमारी में ग्लाइकन के महत्वपूर्ण कार्य पर प्रकाश डालती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

पुनः संयोजक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशिष्ट आणविक लक्ष्यों को बांधते हैं और बाद में, एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रेरित करते हैं या अन्य लिगेंड के बंधन को रोकते हैं। हालांकि, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कार्यक्षमता और आधा जीवन मेजबान-विशिष्ट ग्लाइकोसिलेशन के प्रकार और वितरण से कम हो सकता है। बेहतर एंटीबॉडी का उत्पादन करने के प्रयासों ने आनुवंशिक रूप से संशोधित निर्माता कोशिकाओं के विकास को प्रेरित किया है जो ग्लाइको-अनुकूलित एंटीबॉडी को संश्लेषित करते हैं। ग्लाइकोइंजीनियरिंग को आमतौर पर क्लस्टर किए गए नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर) से जुड़े प्रोटीन 9 जैसे तरीकों का उपयोग करके एक स्थिर नॉकआउट या नॉकिन सेल लाइन की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इंजीनियर कोशिकाओं द्वारा उत्पादित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को तब बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विधियों का उपयोग करके यह निर्धारित करने की विशेषता है कि वांछित ग्लाइकोप्रोफाइल प्राप्त किया गया है या नहीं। यह रणनीति समय लेने वाली, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और विशेषज्ञों की आवश्यकता है। इसलिए, एक वैकल्पिक रणनीति जो आनुवंशिक ग्लाइकोइंजीनियरिंग और ग्लाइकन का पता लगाने के लिए सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल का उपयोग करती है, इष्टतम एंटीबॉडी की दिशा में प्रयासों में सहायता कर सकती है। इस प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट अध्ययन में, एक आईजीजी-उत्पादक चीनी हैम्स्टर अंडाशय सेल ने ग्लाइकोइंजीनियरिंग को अनुकूलित करने के लिए एक आदर्श मेजबान के रूप में कार्य किया। Fut8 जीन को लक्षित करने वाले लघु हस्तक्षेप आरएनए को चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं को वितरित किया गया था, और एफयूटी 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिणामी परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित की गई थी। परिणाम बताते हैं कि इस विधि द्वारा नॉकडाउन कुशल था, जिससे एफयूटी 8 में ~ 60% की कमी आई। एंटीबॉडी ग्लाइकोप्रोफाइल का पूरक विश्लेषण एक तेजी से अभी तक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक का उपयोग करके किया गया था: केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन और लेजर प्रेरित प्रतिदीप्ति का पता लगाना। सभी नॉकडाउन प्रयोगों ने एफुकोसिलेटेड ग्लाइकन में वृद्धि देखी; हालाँकि, इस अध्ययन में हासिल की गई सबसे बड़ी पारी ~ 20% थी। यह प्रोटोकॉल सिलिको डिजाइन टूल, व्यावसायिक रूप से संश्लेषित जीन लक्ष्यीकरण अभिकर्मकों, और तेजी से मात्रा का ठहराव परख में दोहन करके ग्लाइकोइंजीनियरिंग प्रयासों को सरल बनाता है जिन्हें व्यापक पूर्व अनुभव की आवश्यकता नहीं होती है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल द्वारा दी गई समय क्षमता नए जीन लक्ष्यों में जांच में सहायता कर सकती है।

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Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

एंटीबॉडी का ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न इसके नैदानिक प्रदर्शन को निर्धारित करता है, इस प्रकार ग्लाइकोसिलेशन को नियंत्रित करने के लिए औद्योगिक और अकादमिक प्रयास जारी रहते हैं। चूंकि विशिष्ट ग्लाइकोइंजीनियरिंग अभियान समय और श्रम-गहन होते हैं, इसलिए क्षणिक साइलेंसिंग का उपयोग करके ग्लाइकोसिलेशन जीन के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल की पीढ़ी उपयोगी साबित होगी।

चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं में रैपिड एंटीबॉडी ग्लाइकोइंजीनियरिंग

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन के ग्लाइको-प्रोफाइल पर कई ग्लाइकोसिलेशन एंजाइमों के प्रभाव को स्क्रीन करने और एंजाइम की कार्यक्षमताओं की बेहतर समझ में योगदान करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की प्रकृति एक क्षणिक, अभी तक उच्च थ्रूपुट तरीके से ग्लाइकोसिलेशन एंजाइमों की स्क्रीनिंग की अनुमति देती है। परिवर्तित ग्लाइकोसिलेशन प्रोफाइल से एंटीबॉडी गतिविधियों में सुधार हो सकता है, और इसलिए अंतिम उत्पाद की प्रभावकारिता में वृद्धि हो सकती है।बायोफार्मास्युटिकल कंपनियां एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषता के रूप में ग्लाइकोसिलेशन की बारीकी से निगरानी करती हैं। एक विचलित ग्लाइकोसिलेशन कैंसर जैसी बीमारियों की पहचान है। इसलिए, यह विधि औषधीय और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए प्रासंगिक है।प्रोटोकॉल स्तनधारी सेल अभिकर्मक और पश्चिमी धब्बा सहित कई प्रयोगात्मक तकनीकों में अनुभव करने के लिए उपयोगकर्ताओं को मानता है। कम नमूनों के साथ शुरू करना और पहले उदाहरण में स्टॉपिंग पॉइंट का उपयोग करना बेहतर है। चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं के घनत्व और व्यवहार्यता का आकलन करके शुरू करें।फिर, संदूषण से बचने के लिए 70% इथेनॉल और एक आरएनएएसई अवरोधक समाधान के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट और सभी उपकरणों को सावधानीपूर्वक साफ करें। अगला, पांच मिनट के लिए 100 गुना जी पर कोशिकाओं को गोली दें और उन्हें पांच गुना 10 से छह कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर के सेल घनत्व पर पूर्व-गर्म माध्यम में फिर से निलंबित करें। एक बाँझ इलेक्ट्रोपोरेशन क्युवेट में डीएसआईआरएनए मास्टर मिश्रण या नियंत्रण के आठ माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें।एक ही क्युवेट में सेल निलंबन के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें, मिश्रण करें, और इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स वितरित करें। फिर, फोम जैसी सामग्री से परहेज करते हुए, क्युवेट से सेल निलंबन को छह अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें। मिलाते हुए बिना 10 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं।इनक्यूबेशन के बाद, प्रति अच्छी तरह से 1.6 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा बनाने के लिए प्री-वार्म मीडिया के 800 माइक्रोलीटर जोड़ें। 150 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं को बढ़ाएं। 48 घंटों के बाद, सतह पर तैरनेवाला और कोशिकाओं की कटाई करें।आईजीजी शुद्धिकरण के बाद, तीन किलोडाल्टन आणविक भार कटऑफ केन्द्रापसारक सांद्रता पर क्षालन ए जोड़ें, और चार डिग्री सेल्सियस पर 40 से 50 मिनट के लिए 13, 300 गुना जी पर अपकेंद्रित्र जोड़ें। अवशिष्ट मात्रा 50 माइक्रोलीटर के बराबर या उससे कम होने के बाद सेंट्रीफ्यूजेशन पूरा हो जाता है। प्रवाह के माध्यम से त्यागें और अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला पतला करने के लिए पूर्व ठंडा 1 एक्स पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें।अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला के 50 माइक्रोलीटर रहने तक एक ही शर्तों का उपयोग कर फिर से नमूना अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला के 100 एक्स कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए, पूर्व-ठंडा 1 एक्स पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया को दोहराएं। ग्लाइकन विश्लेषण विधि के साथ संगतता सुनिश्चित करने के लिए 40 माइक्रोलीटर में लगभग 2.5 ग्राम प्रति लीटर की अंतिम एकाग्रता में सतह पर तैरनेवाला ध्यान केंद्रित करें।ग्लाइकन विश्लेषण के लिए, चुंबकीय मनका समाधान के 200 माइक्रोलीटर को 2-मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। सतह पर तैरनेवाला से मोती को अलग करने और सतह पर तैरनेवाला को ध्यान से हटाने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर रखें। फिर, चुंबकीय स्टैंड से ट्यूबों को हटा दें और शुद्ध प्रोटीन नमूना और भंवर जोड़ें।अगला, नमूना ट्यूब के लिए आपूर्ति विकृतीकरण बफर जोड़ें और 60 डिग्री सेल्सियस पर आठ मिनट के लिए सेते हैं। इष्टतम प्रतिक्रिया प्रदर्शन के लिए नमूना ट्यूबों को खुला रखें। इनक्यूबेशन बाद, पीएनजीएसई एफ जोड़ें और शुद्ध एंटीबॉडी से ग्लाइकन को क्लीव करने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक और 20 मिनट के लिए सेते हैं।एन-ग्लाइकन की रिहाई के बाद, नमूना ट्यूब और भंवर को बंद करें। फिर, नमूना ट्यूब, भंवर में एसिटोनिट्राइल जोड़ें, और एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। समाधान से मोती को अलग करने के लिए चुंबकीय स्टैंड में नमूना ट्यूब रखें।फिर, एक पिपेट का उपयोग करके, ध्यान से मोती को छूने के बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें। एक धूआं हुड में नमूने के लिए फ्लोरोफोर युक्त ग्लाइकन लेबलिंग समाधान जोड़ें और भंवर द्वारा मिश्रण करें। खुले ढक्कन के साथ 60 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, एसिटोनाइट्राइल में तीन बार नमूने को धोकर अतिरिक्त डाई को हटा दें।फिर, डबल-डिस्टिल्ड पानी में लेबल किए गए ग्लाइकन को हटा दें। चुंबकीय स्टैंड में नमूना ट्यूब रखें और शुद्ध और लेबल ग्लाइकन के साथ समृद्ध सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें। अगला, तैयार करें और निर्दिष्ट ट्रे पदों में सभी आवश्यक मानकों और नमूनों को लोड करें।ग्लाइकन विश्लेषण प्रोटोकॉल चलाएं और उचित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके नमूने में मौजूद ग्लाइकन का विश्लेषण और पहचान करें। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने तीन फुट 8 डीएसआईआरएनए निर्माणों के मिश्रण से संक्रमित कोशिकाओं में कम फट 8 प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाई। नॉकडाउन कोशिकाओं से ग्लाइकन संरचनाओं ने भी फ्यूकोसिलेशन में कमी देखी।यह प्रवृत्ति अगालेक्टोसिलेटेड संरचनाओं में सबसे अधिक स्पष्ट थी और गैलेक्टोसिलेटेड संरचनाओं में कुछ हद तक देखी गई थी। सेल व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण अंतर के बिना एक एकल वर्ग-तरंग पल्स की तुलना में दो वर्ग-तरंग दालों का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन से कोर फ्यूकोसिलेशन में दो गुना कमी देखी गई थी। कुल मिलाकर, लघु-हस्तक्षेप आरएनए एकाग्रता में वृद्धि से फसल के समय को बढ़ाने की तुलना में कोर फ्यूकोसिलेशन पर एक बड़ा हस्तक्षेप होता है।पानी और एसिटोनाइट्राइल के बीच का अनुपात यह निर्धारित करता है कि ग्लाइकन समाधान में हैं या मोतियों का हिस्सा हैं। समाधान से लेबल किए गए ग्लाइकन के आकस्मिक हटाने से बचने के लिए धोने के चरणों के दौरान याद रखना महत्वपूर्ण है। एक अनुवर्ती प्रयोग में एंटीबॉडी-निर्भर सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी और पूरक-निर्भर साइटोटॉक्सिसिटी को मापने के लिए सेल-आधारित परख का उपयोग करके शुद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का लक्षण वर्णन शामिल हो सकता है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

विकासशील कस्टम चीनी हैम्स्टर अंडाशय मेजबान सेल प्रोटीन ध्वनिक झिल्ली microparticle प्रौद्योगिकी का उपयोग कर Assays

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

रोगी के रक्त के नमूने से व्यवहार्य परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं का तेजी से अलगाव

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट की तरह मायोजेनिक प्रोजेनिटर का प्रत्यारोपण

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

एकल कक्षों और 3 डी कारावास में एकल भ्रूण आदेश: उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक नई डिवाइस

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

रैपिड स्कैन इलेक्ट्रॉन समचुंबक अनुनाद इमेजिंग Physiologically महत्वपूर्ण पैरामीटर के लिए नए रास्ते खोलता है<em&gt; Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Angiogenesis visualizing द्वारा Multiphoton माइक्रोस्कोपी में आनुवंशिक रूप से संशोधित 3 डी-PLGA/Calvarial क्रिटिकल हड्डी दोष मरंमत के लिए nHAp पाड़

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic अम्ल का चयापचय Glycoengineering उपयोग N-acyl-संशोधित Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

एक तेजी से छवि आधारित बैक्टीरियल डाह परख अमीबा का उपयोग

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं से एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का शोधन और विश्लेषण एक स्वचालित माइक्रोबायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करते हुए

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

चीनी हम्सटर अंडाशय सेल खेती में उच्च थ्रूपुट स्वचालित माइक्रो-बायोरिएक्टरों का उपयोग करके अनुकूलन प्रक्रिया

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...