Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

PK ringrazia il Dipartimento di Ingegneria Chimica, Imperial College di Londra, per la sua borsa di studio. RD ringrazia il Consiglio di ricerca sulle biotecnologie e le scienze biologiche del Regno Unito per la sua studentship. MM è finanziato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council del Regno Unito (riferimento alla sovvenzione: BB/S006206/1). IAG ringrazia l'Irish Research Council (Borsa di studio n. GOIPG/2017/1049) e CONACyT (Borsa di studio n. 438330).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le vie di glicosilazione coinvolgono una complessa rete metabolica di enzimi e proteine accessorie. Sezionare la funzione dei costituenti del percorso è scoraggiante se si basa solo su strategie convenzionali di ingegneria genetica knockout o knockin. Un approccio alternativo consiste nello screening preliminare dei membri di un percorso utilizzando un test transitorio di perdita di funzione. A tal fine, sono stati combinati due protocolli rapidi, RNAi e CGE-LIF detection, per creare un modo più efficiente per caratterizzare i geni della glicosilazione. Il metodo descritto richiede 5-7 giorni per il completamento rispetto ai metodi convenzionali che potenzialmente richiedono diverse settimane per il completamento. Inoltre, gli ambienti di ricerca con capacità di automazione potrebbero sfruttare questo metodo per selezionare più candidati genetici di quanto possibile con la gestione manuale.
Il successo di una campagna di glicoingegneria transitoria dipende in gran parte dal design del siRNA. I progetti DsiRNA personalizzati devono seguire le regole precedentemente delineate o, per facilità, gli utenti possono optare per sequenze preprogettate disponibili in commercio. Come altre strategie di modificazione genica, l'RNAi ha il potenziale per effetti off-target. Pertanto, gli utenti sono incoraggiati a valutare il targeting genico non intenzionale con metodi computazionali41. Le scelte di progettazione sperimentale possono anche aiutare a limitare gli effetti fuori bersaglio. Kittler et al. hanno dimostrato che la consegna multiplexata di siRNA ha portato a una riduzione degli effetti off-target42. Anche se questo sembra controintuitivo, si suggerisce che un master mix riduca la concentrazione di ciascun costrutto di siRNA, limitando così l'opportunità di silenziamento genico off-target. Un ulteriore vantaggio è che la trasfezione simultanea di strutture di siRNA che colpiscono lo stesso gene aumenta la probabilità di successo dell'RNAi. L'uso di un master mix garantisce inoltre la coerenza tra campioni e repliche e accelera il processo di trasfezione. Dopo uno screening iniziale di costrutti di siRNA misti, un altro esperimento può essere condotto utilizzando singoli costrutti per accertare l'efficienza RNAi di ciascuna sequenza. In questo e in altri studi di knockdown, fino a tre siRNA sono stati raggruppati e consegnati alle cellule 43,44,45. Tuttavia, può essere desiderabile esaminare più di tre siRNA contemporaneamente per colpire in modo efficiente un singolo gene o per indirizzare diversi geni. In effetti, uno studio ha dimostrato il silenziamento multiscelato mediato da siRNA di un massimo di sei geni a livelli paragonabili al silenziamento dei singoli geni46. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per determinare il numero massimo di costrutti di siRNA che possono essere utilizzati in una piscina senza compromettere l'efficienza del silenziamento. La strategia multiplex è stata proposta da Martin et al. per migliorare il ritmo degli esperimenti di screening della libreria RNAi46, e un concetto simile potrebbe rivelarsi utile per lo screening dei geni di glicosilazione.
Il protocollo qui descritto funge da proof-of-concept con l'aspettativa che vengano eseguiti esperimenti successivi per convalidare altri geni di glicosilazione. I nuovi geni di interesse possono essere insoliti o meno popolari di Fut8 e gli anticorpi primari per rilevare il silenziamento genico possono essere scarsi o non disponibili. In questo scenario, metodi alternativi come RT-PCR possono essere utilizzati per quantificare il silenziamento genico47, ma va notato che RT-PCR rileva l'mRNA piuttosto che le proteine. Quando sono disponibili anticorpi per il western blotting, un problema comune è la scarsa rilevazione o la presenza di bande non specifiche. Sono disponibili guide alla risoluzione dei problemi per aiutare gli utenti a risolvere problemi comuni e queste tendono a includere una gamma di soluzioni come la titolazione degli anticorpi primari, il blocco alternativo e le condizioni di rilevamento48,49. In questo studio, FUT8 è apparso inaspettatamente come una doppia banda a ~ 65 e ~ 70 kDa. È possibile che la banda ~70 kDa rappresenti FUT8 glicosilato. Prove di letteratura da linee cellulari umane descrivono la glicosilazione legata all'O a Thr 56450,51, un sito che è conservato nel criceto cinese, e le sequenze CHO K1 FUT8.
Come accennato in precedenza, le vie di glicosilazione spesso coinvolgono una complessa serie di enzimi. L'attuale protocollo è stato sviluppato, ottimizzato e dimostrato utilizzando una reazione di glicosilazione monogenica controllata da Fut8. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per confermare la robustezza di questo metodo quando il gene bersaglio codifica un enzima con cinetica alternativa e livelli di espressione o una via regolata da isoenzimi con funzioni ridondanti.
Nel complesso, la capacità di silenziare rapidamente i geni e rilevare glicoprofili IgG modificati è uno strumento utile nello sforzo verso anticorpi glicoingegnerizzati personalizzati. Approfondimenti da studi simili a breve termine possono essere applicati per generare cellule glicoingegnerizzate stabili da utilizzare in saggi a lungo termine come la coltura a batch alimentato. Al di fuori del contesto farmaceutico, questo metodo contribuisce allo studio della biologia del glicano ed evidenzia l'importante funzione dei glicani nello sviluppo, nella salute e nella malattia.

La glicosilazione legata all'N è un processo enzimatico mediante il quale le parti oligosaccaridiche sono legate covalentemente ai residui di Asn. A differenza della sintesi proteica de novo, la sintesi del glicano è una reazione non modellata che si traduce in glicosilazione eterogenea delle proteine. La struttura, la composizione e la distribuzione dei glicani possono influenzare la conformazione e la funzione delle proteine. Infatti, la N-glicosilazione nella regione del frammento cristallizzabile (Fc) dell'immunoglobulina G (IgG) regola l'efficacia terapeutica, l'immunogenicità e l'emivita dell'anticorpo1. Pertanto, il paradigma quality by design (QbD) per lo sviluppo di prodotti proteici bioterapeutici ricombinanti identifica naturalmente la glicosilazione come attributo critico di qualità (CQA)2,3. Le cellule di mammifero sono spesso i sistemi di espressione preferiti in quanto producono intrinsecamente modelli di glicosilazione simili a quelli umani più da vicino di batteri, lieviti, insetti o cellule vegetali. Inoltre, le cellule dell'ovaio di criceto cinese (CHO) sono selezionate rispetto ad altre linee cellulari di mammiferi perché sono resistenti alle infezioni da virus umani, secernono prodotti ad alti titoli e possono essere coltivate in coltura in sospensione ad alte densità cellulari vitali4. Per quanto riguarda la formazione di glicani, le cellule di produzione murina non-CHO generano glicani immunogenici (galattosio legato all'α(1-3)[α(1-3)-Gal] e acido N-glicolilneuraminico [NeuGc]) che interferiscono con l'uso sicuro degli anticorpi monoclonali (mAbs)5. Questi benefici rendono le cellule CHO il principale sistema di espressione, responsabile della produzione di oltre l'80% di nuove bioterapie tra il 2014 e il 20186. Tuttavia, la glicosilazione indipendente dal modello è un meccanismo conservato che porta a bioterapie derivate da CHO con una serie di glicoforme.
Le strategie di sviluppo bioterapeutico mirano a controllare l'eterogeneità nelle cellule CHO mediante l'ingegneria genetica. Alcuni esempi di letteratura includono il knockdown delle sialidasi (Neu1, Neu3)7, il knockout 4,6-deidratasi (GMD)8 e la sovraespressione di glicosiltransferasi (GnTIII)9. I progressi nella glicoingegneria sono possibili grazie a una combinazione di risorse pubblicamente disponibili, come il genoma CHO10, e al continuo sviluppo di strumenti di ingegneria genetica, come le nucleasi effettori simili ad attivatori di trascrizione (TALEN), le nucleasi a dita di zinco (ZFN) e le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR)-associate alla proteina 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Questi strumenti vengono tipicamente consegnati alle cellule CHO come DNA plasmidico o come complessi di ribonucleoproteine purificate (RNP). Al contrario, l'interferenza dell'RNA (RNAi) è una tecnologia di ingegneria genetica che, nella sua forma più semplice, richiede solo la consegna di oligonucleotidi di RNA interferente breve purificato (siRNA). Le proteine endogene elaborano il siRNA a doppio filamento in singoli filamenti e il complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) della nucleasi forma un complesso con siRNA per scindere le sequenze di mRNA bersaglio 15,16,17. Il silenziamento genico tramite questo metodo è transitorio a causa dell'instabilità dell'RNA, ma l'indagine qui contenuta sfrutta questa funzione per aiutare uno screening rapido.
L'enzima modello selezionato per il presente studio, l'α1,6-fucosiltransferasi (FUT8), produce N-glicani con α-1,6 L-fucosi legata al nucleo (Fuc). Questa modifica è un determinante primario dell'attività della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC), come evidenziato da studi di anticorpi commerciali. In assenza di fucosilazione del nucleo, Rituximab (anti-CD20 IgG1) aumenta l'ADCC di 50 volte e aumenta l'ADCC in Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) migliorando il legame fcgRIIIa 18,19. La fucosilazione del nucleo è, quindi, considerata una caratteristica indesiderabile di mAbs che giustifica gli sforzi per invertire questo fenotipo. Ci sono esempi di targeting del gene Fut8 di successo utilizzando siRNA con aumenti concomitanti di ADCC 20,21,22, anche se questi esempi forniscono siRNA Fut8 codificato sul DNA plasmidico. Tali esperimenti generano un silenziamento genico stabile poiché il DNA plasmidico funge da modello per la sintesi del siRNA. Ciò consente alle cellule di ricostituire le molecole di siRNA che vengono degradate dalle RNasi intracellulari e dalle fosfatasi. Al contrario, la somministrazione di siRNA sintetico esogeno consente solo il silenziamento genico transitorio poiché il siRNA non può essere reintegrato a causa della mancanza di un modello intracellulare. Pertanto, gli utenti dovrebbero considerare se i progetti sperimentali sono compatibili con siRNA derivati da plasmidi o sintetici. Ad esempio, gli studi incentrati sulla produzione di mAb di picco, in genere il sesto giorno della coltura23,24, possono optare per siRNA sintetici che possono essere consegnati alle cellule pochi giorni prima del picco di espressione. I vantaggi di un approccio transitorio che utilizza siRNA sintetici includono la capacità di esternalizzare la produzione e il fatto che più costrutti di siRNA possono essere generati in una frazione del tempo necessario per generare costrutti nei plasmidi. Inoltre, il siRNA sintetico è efficace, come evidenziato da esempi di silenziamento genico Fut8 che sono sufficienti per ridurre l'espressione della proteina FUT825 e produrre IgG afucosilati con aumento del legame FCgRIIIa e ADCC26.
Il successo di questo protocollo di glicoingegneria è stato determinato dal grado di glicosilazione Fc. La spettrometria di massa è normalmente il metodo di scelta per le analisi glicemiche; tuttavia, l'elettroforesi su gel capillare e la rilevazione a fluorescenza indotta da laser (CGE-LIF) sono perfettamente suscettibili di risolvere il glicoprofilo delle IgG purificate e hanno il vantaggio di una maggiore rapidità e semplicità. I protocolli di spettrometria di massa devono combinare i metodi cromatografici e di derivatizzazione appropriati, le sorgenti di ionizzazione e gli analizzatori di massa 27,28,29. Oltre a richiedere uno specialista qualificato, i protocolli di spettrometria di massa sono lunghi e la diversità dei metodi rende difficile confrontare i dati tra laboratori con configurazioni diverse. Nel contesto dei biofarmaci, CGE-LIF è un metodo sensibile in grado di fornire dettagli sufficienti di un glicoprofilo anticorpale ed è facilmente scalabile per metodi ad alto rendimento. Per miscele a bassa abbondanza e altamente complesse con glicoproteine scarsamente caratterizzate, i vantaggi della spettrometria di massa potrebbero rimanere. Tuttavia, l'analisi mAb ad alta risoluzione e ad alta sensibilità offerta dall'analisi N-glicano basata su CGE-LIF serve come logica per testare questo metodo. Inoltre, la preparazione e l'analisi del campione sono completate in poche ore30. Studi recenti hanno dimostrato che CGE-LIF può essere utilizzato per monitorare i glicani derivati dal plasma umano31, topo32 e CHO IgG33. Questi studi evidenziano l'uso di CGE-LIF per l'analisi di campioni ad alto rendimento e piccoli volumi di campioni.
Il metodo CGE-LIF presenta limitazioni che dovrebbero essere prese in considerazione. Il costo è una barriera significativa all'uso di questo e di altri dispositivi per l'analisi del glicano. Tuttavia, questi costi sono tipici del settore e si ritiene che CGE-LIF sia un'opzioneeconomicamente vantaggiosa 34. I laboratori con budget ridotti possono trovare più pratico noleggiare macchinari o esternalizzare l'analisi dei campioni. Un'altra considerazione di qualsiasi metodo analitico è la ripetibilità. La valutazione di CGE-LIF è stata condotta utilizzando 48 repliche dello stesso campione che sono state analizzate in giorni diversi. La deviazione standard relativa per capillare è stata determinata per la ripetibilità intrabatch e interbatch. Il confronto intrabatch delle repliche è risultato avere una deviazione standard relativa del 6,2%, indicando che le prestazioni capillari non sono uniformi. Inoltre, un confronto dei dati interbatch ha mostrato una deviazione standard relativa del 15,8%31, indicando che le prestazioni capillari cambiano nel tempo. Le carenze operative individuate potrebbero non applicarsi nel presente studio, che utilizza macchinari e reagenti proprietari diversi. Se gli utenti intendono sviluppare un protocollo interno, varrebbe la pena considerare lo studio di Ruhaak et al. 31, che ha valutato attentamente i reagenti per CGE-LIF. Pertanto, i reagenti per l'iniezione del campione (Hi-Di Formamide e DMSO), l'etichettatura del glicano (NaBH3CN o 2-picolina borano)31 e altri sono stati ottimizzati.
Questo studio presenta un protocollo di glicoingegneria efficiente in termini di tempo che combina la rapidità dell'RNAi diretto con l'analisi glicemica a valle. La metodologia è illustrata utilizzando il gene Fut8 come bersaglio per i motivi sopra descritti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

Gli anticorpi monoclonali ricombinanti legano specifici bersagli molecolari e, successivamente, inducono una risposta immunitaria o inibiscono il legame di altri ligandi. Tuttavia, la funzionalità e l'emivita degli anticorpi monoclonali possono essere ridotte dal tipo e dalla distribuzione della glicosilazione specifica dell'ospite. I tentativi di produrre anticorpi superiori hanno ispirato lo sviluppo di cellule produttrici geneticamente modificate che sintetizzano anticorpi glico-ottimizzati. La glicoingegneria richiede tipicamente la generazione di una linea cellulare knockout o knockin stabile utilizzando metodi come la proteina 9 associata a brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR). Gli anticorpi monoclonali prodotti da cellule ingegnerizzate vengono quindi caratterizzati utilizzando metodi spettrometrici di massa per determinare se è stato ottenuto il glicoprofilo desiderato. Questa strategia richiede molto tempo, è tecnicamente impegnativa e richiede specialisti. Pertanto, una strategia alternativa che utilizza protocolli semplificati per la glicoingegneria genetica e il rilevamento del glicano può aiutare gli sforzi verso anticorpi ottimali. In questo studio proof-of-concept, una cellula ovarica di criceto cinese produttrice di IgG è servita come ospite ideale per ottimizzare la glicoingegneria. L'RNA interferente breve mirato al gene Fut8 è stato consegnato alle cellule ovariche del criceto cinese e sono stati quantificati i conseguenti cambiamenti nell'espressione della proteina FUT8. I risultati indicano che il knockdown con questo metodo è stato efficiente, portando a una riduzione di circa il 60% di FUT8. L'analisi complementare del glicoprofilo anticorpale è stata eseguita utilizzando una tecnica rapida ma altamente sensibile: elettroforesi su gel capillare e rilevamento della fluorescenza indotta dal laser. Tutti gli esperimenti di knockdown hanno mostrato un aumento dei glicani afucosilati; tuttavia, il più grande cambiamento ottenuto in questo studio è stato ~ 20%. Questo protocollo semplifica gli sforzi di glicoingegneria sfruttando strumenti di progettazione in silico , reagenti di targeting genico sintetizzati commercialmente e saggi di quantificazione rapida che non richiedono una vasta esperienza precedente. Pertanto, le efficienze temporali offerte da questo protocollo possono aiutare le indagini su nuovi bersagli genici.

L'analisi Western blot ha mostrato una ridotta espressione proteica fuT8 nelle cellule trasfettate con una miscela di tre costrutti fut8 DsiRNA. Nei campioni di controllo trasfettati con DsiRNA non mirato, FUT8 è apparso come una doppia banda a ~ 65 e 70 kDa. Poiché il peso molecolare previsto di FUT8 è di 66 kDa, una riduzione dell'intensità del segnale della banda di peso molecolare inferiore è indicativa del silenziamento genico. Per confermare e quantificare il silenziamento genico, il livello della proteina FUT8 è stato normalizzato al livello relativo della proteina GAPDH. L'analisi Western blot ha rilevato due bande per GAPDH a ~ 37 e 35 kDa. La banda di peso molecolare più elevata corrisponde alla dimensione proteica prevista ed è, quindi, utilizzata nei calcoli di normalizzazione. Quando normalizzata rispetto ai livelli di proteina GAPDH, l'espressione della proteina FUT8 è stata ridotta fino al 60% (Figura 1).
In linea con l'osservazione del knockdown genico a 48 ore dopo la trasfezione, i corrispondenti campioni di mAb sono stati elaborati per l'analisi da CGE-LIF. Le strutture glicani delle cellule knockdown hanno mostrato una diminuzione della fucosilazione. Questa tendenza è stata più pronunciata nelle strutture agalattosilate (G0F) e osservata in misura minore nelle strutture galattosilate (G1F, G1F' e G2F). Da questo set di dati, la fucosilazione totale del nucleo IgG è scesa a ~ 75%, in calo rispetto a ~ 95% di fucosilazione del nucleo osservata per la condizione di controllo negativa (Figura 2). È stata prevista una maggiore riduzione della fucosilazione del nucleo data la diminuzione del ~ 60% dei livelli di proteina FUT8. Riflettendoci, è interessante notare che il glicoprofilo rappresenta mAbs glicosilati che si sono accumulati in un periodo di 48 ore dalla trasfezione, mentre il silenziamento genico rappresenta i livelli proteici presenti solo al momento della raccolta.
Un ulteriore esame di questo metodo di abbattimento ha comportato la variazione della concentrazione di DsiRNA, del tempo di raccolta e delle condizioni di elettroporazione. Ogni fattore è stato sondato individualmente per determinarne la rilevanza. L'impatto delle condizioni dell'impulso di elettroporazione sulla fucosilazione del nucleo e sulla vitalità cellulare è catturato negli esperimenti B, C, D ed E. Questi risultati dimostrano una doppia riduzione della fucosilazione del nucleo dall'elettroporazione utilizzando due impulsi a onda quadra (Esperimento C) rispetto a un singolo impulso a onda quadra (Esperimento B), senza differenze significative nella vitalità cellulare (Tabella 2). La condizione di elettroporazione e3 (esperimento D) ha portato alla più bassa vitalità cellulare (~ 90%) e resa IgG in questo momento. Tuttavia, le cellule sopravvissute all'evento di elettroporazione sono state moderatamente trasfettate, come evidenziato dalla diminuzione di circa il 10% della fucosilazione del nucleo (Tabella 2). È interessante notare che l'esperimento D ha utilizzato condizioni di elettroporazione che hanno fornito la maggiore riduzione della fucosilazione del nucleo (14,7%), ma erano evidentemente dannose per la vitalità cellulare (91% -93% di vitalità). Questa serie limitata di esperimenti illustra la necessità di determinare le impostazioni di elettroporazione che consentono una sufficiente permeabilizzazione della membrana cellulare senza causare danni irrevocabili. È anche interessante notare il ruolo della concentrazione di siRNA e del tempo di raccolta sulla fucosilazione del nucleo. Nel complesso, l'aumento della concentrazione di siRNA ha una maggiore influenza sulla fucosilazione del nucleo rispetto all'aumento del tempo di raccolta (esperimenti B, F, G rispetto agli esperimenti A, B, H). In esperimenti futuri, sarebbe interessante titolare le concentrazioni di siRNA fornite dal metodo di elettroporazione e2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> Figura 1. Diagramma di flusso sperimentale. Le fasi di glicoingegneria e analisi del campione sono rappresentate con il tempo associato richiesto per ogni fase. La progettazione del siRNA richiede alcune ore, a seconda del numero di bersagli genici o costrutti per bersaglio genico. La trasfezione delle cellule CHO con siRNA è completa in poche ore e le cellule trasformate vengono lasciate crescere per 48 ore. I pellet cellulari e i supernatanti vengono raccolti in poche ore. I pellet cellulari vengono lisati e le proteine intracellulari vengono separate su una SDS PAGE e successivamente blotted e sondate con anticorpi contro il gene bersaglio. I glicani sono scissi da anticorpi purificati e analizzati da CGE-LIF. Questi test possono richiedere 1 giorno ciascuno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> Figura 2. Conferma dell'interferenza dell'RNA. Western blot detection of α-1,6-fucosyltransferase (FUT8) protein levels in samples treated with Fut8 or non-targeting control DsiRNA. Le bande corrispondenti a FUT8 sono più intense nel controllo rispetto ai campioni di knockdown fut8. Anche il livello di proteina GAPDH è stato valutato al fine di normalizzare l'espressione genica bersaglio. Tutti i campioni sono stati prelevati dall'esperimento G (vedi Tabella 2). Ristampato da Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> Figura 3. Effetto del knockdown di Fut8 sulla glicosilazione cumulativa di IgG a 48 h. Uno spostamento nella distribuzione del glicano viene rilevato nei campioni knockdown. In particolare, l'abbondanza relativa delle principali strutture fucosilate del nucleo (G0F) è ridotta mentre le specie afucosilate sono aumentate nell'esperimento di knockdown. Le misurazioni sono state eseguite da campioni dell'esperimento G (vedere Tabella 2). I triplicati biologici eseguiti per ogni esperimento sono stati miscelati dopo la raccolta per ridurre l'onere dell'analisi a valle. Ristampato da Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Nome dell'esperimento</td>
			<td colspan="2">Metodo di elettroporazione</td>
			<td colspan="2">Concentrazione di DsiRNA (nΜ)</td>
			<td>Tempo di raccolta (h)</td>
			<td>Vitalità (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 celle·mL-1)</td>
			<td>Titolo IgG (mg· L-1)</td>
			<td colspan="2">Differenza nella core-fucosilazione (%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">E3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">E4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2. Ottimizzazione della trasfezione. Le modifiche iterative del metodo di elettroporazione, della concentrazione di DsiRNA e del tempo di raccolta hanno portato a cambiamenti nella vitalità cellulare, nella densità cellulare vitale, nel titolo IgG al momento del raccolto e nelle differenze nella fucosilazione del nucleo. Ogni esperimento ha confrontato il knockdown e il rispettivo controllo negativo per determinare se la modifica produce l'effetto desiderato (cioè una diminuzione della fucosilazione). Le impostazioni di elettroporazione erano le seguenti: e1: 1200 V, 0,1 ms, forma d'onda quadrata; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s tra gli impulsi, forma d'onda quadrata; e3: 150 V, 20 ms, forma d'onda quadrata; e4: 250 V, 500 μF, decadimento esponenziale. Ristampato da Kotidis et al. 52.

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Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Il modello di glicosilazione di un anticorpo determina le sue prestazioni cliniche, quindi gli sforzi industriali e accademici per controllare la glicosilazione persistono. Poiché le tipiche campagne di glicoingegneria richiedono molto tempo e lavoro, la generazione di un protocollo rapido per caratterizzare l'impatto dei geni di glicosilazione utilizzando il silenziamento transitorio si rivelerebbe utile.

Glicoingegneria anticorpale rapida nelle cellule ovariche di criceto cinese

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare l'effetto di più enzimi di glicosilazione sul glico-profilo di una proteina bersaglio e contribuire a una migliore comprensione delle funzionalità dell'enzima. La natura del protocollo consente lo screening degli enzimi di glicosilazione in modo transitorio, ma ad alto rendimento. Profili di glicosilazione alterati possono portare a un miglioramento delle attività anticorpali e quindi aumentare l'efficacia del prodotto finale.Le aziende biofarmaceutiche monitorano attentamente la glicosilazione come attributo critico di qualità. Una glicosilazione aberrante è un segno distintivo di malattie come il cancro. Pertanto, questo metodo è rilevante per la ricerca farmacologica e biomedica.Il protocollo presuppone che gli utenti abbiano esperienza in diverse tecniche sperimentali, tra cui la trasfezione di cellule di mammifero e western blots. È meglio iniziare con meno campioni e utilizzare i punti di arresto in prima istanza. Inizia valutando la densità e la vitalità delle cellule ovariche del criceto cinese.Quindi, pulire accuratamente l'armadio di biosicurezza e tutte le apparecchiature con etanolo al 70% e una soluzione di inibitore della RNasi per evitare la contaminazione. Quindi, pellet le celle a 100 volte G per cinque minuti e risospese in un mezzo preriscaldato ad una densità cellulare di cinque volte 10 alle sei celle per millilitro. Trasferire otto microlitri della miscela o del controllo principale DsiRNA in una cuvetta sterile per elettroporazione.Aggiungere 800 microlitri della sospensione cellulare alla stessa cuvetta, mescolare ed erogare l'impulso di elettroporazione. Quindi, trasferire la sospensione cellulare dalla cuvetta a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, evitando materiale simile alla schiuma. Incubare le cellule per 10 minuti senza agitare.Dopo l'incubazione, aggiungere 800 microlitri di mezzi preriscaldati per ottenere un volume finale di 1,6 millilitri per pozzetto. Far crescere le cellule trasfettate nell'incubatrice mentre si agita a 150 RPM. Dopo 48 ore, raccogliere il surnatante e le cellule.Dopo la purificazione delle IgG, aggiungere l'eluizione A su un concentratore centrifugo a peso molecolare di tre kilodalton e centrifugare a 13.300 volte G per 40-50 minuti a quattro gradi Celsius. La centrifugazione è completa una volta che il volume residuo è pari o inferiore a 50 microlitri. Scartare il flusso attraverso e aggiungere 500 microlitri di PBS 1X pre-refrigerato per diluire il surnatante residuo.Centrifugare nuovamente il campione utilizzando le stesse condizioni fino a quando rimangono 50 microlitri di surnatante residuo. Per ottenere una diluizione 100X del surnatante, aggiungere 500 microlitri di PBS 1X pre-refrigerato e ripetere il processo di centrifugazione. Concentrare il surnatante in una concentrazione finale di circa 2,5 grammi per litro in 40 microlitri per garantire la compatibilità con il metodo di analisi del glicano.Per l'analisi del glicano, trasferire 200 microlitri della soluzione di perline magnetiche in un tubo PCR da 2 millilitri. Posizionalo sul supporto magnetico per separare le perline dal surnatante e rimuovere il surnatante con attenzione. Quindi, rimuovere i tubi dal supporto magnetico e aggiungere il campione proteico purificato e il vortice.Quindi, aggiungere il tampone di denaturazione di alimentazione alla provetta del campione e incubare per otto minuti a 60 gradi Celsius. Tenere aperte le provette campione per prestazioni di reazione ottimali. Dopo l'incubazione, aggiungere PNGasi F e incubare per altri 20 minuti a 60 gradi Celsius per scindere i glicani dagli anticorpi purificati.Dopo il rilascio di N-glicani, chiudere la provetta del campione e il vortice. Quindi, aggiungere acetonitrile alla provetta del campione, vortice e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Posizionare le provette campione nel supporto magnetico per separare le perline dalla soluzione.Quindi, usando una pipetta, rimuovere con cura il surnatante senza toccare le perline. Aggiungere la soluzione di etichettatura glicane contenente fluoroforo al campione in una cappa aspirante e mescolare vorticosamente. Dopo un'incubazione di 20 minuti a 60 gradi Celsius con coperchi aperti, rimuovere il colorante in eccesso lavando il campione tre volte in acetonitrile.Quindi, eluire i glicani etichettati in acqua a doppio distillato. Posizionare la provetta nel supporto magnetico e raccogliere il surnatante arricchito con glicani purificati ed etichettati. Quindi, preparare e caricare tutti gli standard e i campioni richiesti nelle posizioni del vassoio designate.Eseguire il protocollo di analisi dei glicani e analizzare e identificare i glicani presenti nel campione utilizzando un software appropriato. L'analisi Western blot ha mostrato una ridotta espressione della proteina Fut8 nelle cellule trasfettate con una miscela di tre costrutti fut8 DsiRNA. Anche le strutture glicaniche delle cellule abbattute hanno mostrato una diminuzione della fucosilazione.Questa tendenza è stata più pronunciata nelle strutture agalattosilate e osservata in misura minore nelle strutture galattosilate. Una riduzione di due volte della fucosilazione del nucleo è stata osservata dall'elettroporazione utilizzando due impulsi a onda quadra rispetto a un singolo impulso a onda quadra senza differenze significative nella vitalità cellulare. Nel complesso, l'aumento della concentrazione di RNA a breve interferenza ha una grande interferenza sulla fucosilazione del nucleo rispetto all'aumento del tempo di raccolta.Il rapporto tra acqua e acetonitrile determina se i glicani sono in soluzione o parte delle perline. Questo è fondamentale da ricordare durante le fasi di lavaggio per evitare la rimozione accidentale dei glicani etichettati dalla soluzione. Un esperimento di follow-up potrebbe comportare la caratterizzazione di anticorpi monoclonali purificati utilizzando saggi basati su cellule per quantificare la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente e la citotossicità complemento-dipendente.

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