Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
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PKは、彼の奨学金のために、インペリアルカレッジロンドンの化学工学科に感謝します。RDは、彼の学生時代のために英国のバイオテクノロジーと生物科学研究評議会に感謝します。MMは、英国バイオテクノロジー生物科学研究評議会(Grant reference: BB/S006206/1)から資金提供を受けています。IAGはアイルランド研究評議会(奨学金番号)に感謝します。GOIPG/2017/1049)およびCONACyT(奨学金番号438330)。

著者らは開示するものは何もありません。

グリコシル化経路は、酵素および補助タンパク質の複雑な代謝ネットワークを含む。経路構成成分の機能を解剖することは、従来のノックアウトまたはノックイン遺伝子工学戦略のみに依存する場合、困難である。別のアプローチは、一過性機能喪失アッセイを用いて経路のメンバーを予めスクリーニングすることである。この目的のために、RNAiおよびCGE-LIF検出の2つの迅速なプロトコルを組み合わせて、グリコシル化遺伝子を特徴付けるより効率的な方法を作り出した。記載されている方法は、完了に数週間かかる可能性のある従来の方法と比較して、完了に5〜7日かかります。さらに、自動化機能を備えた研究環境は、この方法を利用して、手動処理で実現可能なよりも多くの遺伝子候補をスクリーニングする可能性があります。
一過性糖工学キャンペーンの成功は、siRNAデザインに大きく依存します。カスタムDsiRNAデザインは、以前に概説した規則に従わなければならないか、または容易にするために、ユーザーは市販の事前設計された配列を選択することができる。他の遺伝子改変戦略と同様に、RNAiはオフターゲット効果の可能性を秘めています。したがって、使用者は、計算方法41によって意図しない遺伝子標的化を評価することが奨励される。実験計画の選択は、ターゲット外効果を制限するのにも役立ちます。Kittlerらは、siRNAの多重送達がオフターゲット効果の低下をもたらしたことを示した42。これは直感に反しているように思えるが、マスターミックスは各siRNA構築物の濃度を低下させ、オフターゲット遺伝子サイレンシングの機会を制限することが示唆されている。さらなる利点は、同じ遺伝子を標的とするsiRNA構造の同時トランスフェクションにより、RNAiが成功する可能性が高まることです。また、マスターミックスを使用することで、サンプルと複製の間の一貫性が確保され、トランスフェクションプロセスが高速化されます。混合siRNA構築物の初期スクリーニングに続いて、各配列のRNAi効率を確認するために、個々の構築物を用いて別の実験を実施してもよい。このおよび他のノックダウン研究において、最大3つのsiRNAがプールされ、細胞43、44、45に送達された。しかし、単一の遺伝子を効率的に標的にしたり、複数の遺伝子を標的にしたりするために、3つ以上のsiRNAを同時にスクリーニングすることが望ましい場合があります。実際、ある研究では、個々の遺伝子のサイレンシングに匹敵するレベルで、最大6つの遺伝子の多重化siRNA媒介サイレンシングが実証されました46。しかし、サイレンシング効率を損なうことなくプール内で使用できるsiRNA構築物の最大数を決定するためには、さらなる研究が必要である。この多重化戦略は、RNAiライブラリースクリーニング実験46のペースを速めるためにMartinらによって提案され、同様の概念がグリコシル化遺伝子のスクリーニングに有用であることが証明される可能性がある。
本明細書に記載されるプロトコルは、他のグリコシル化遺伝子を検証するためにその後の実験が行われることを期待して、概念実証として役立つ。関心のある新しい遺伝子は、Fut8よりも特徴付けられていないか、または一般的ではない可能性があり、遺伝子サイレンシングを検出するための一次抗体は不十分であるか、または利用できない可能性がある。このシナリオでは、遺伝子サイレンシング47を定量するためにRT-PCRなどの代替方法を使用してもよいが、RT-PCRはタンパク質ではなくmRNAを検出することに留意すべきである。ウェスタンブロッティング用の抗体が利用可能な場合、一般的な問題は検出不良または非特異的バンドの存在です。ユーザーが一般的な問題を解決するのに役立つトラブルシューティングガイドが利用可能であり、これらには、一次抗体滴定、代替ブロッキング、および検出条件48,49などの幅広いソリューションが含まれる傾向がある。この研究では、FUT8は予想外に〜65および〜70kDaでダブルバンドとして現れた。〜70kDaバンドはグリコシル化FUT8を表す可能性がある。ヒト細胞株からの文献証拠は、チャイニーズハムスターにおいて保存されている部位であるThr 56450、51、およびCHO K1 FUT8配列におけるO結合型グリコシル化を記載している。
前述のように、グリコシル化経路は、しばしば複雑な酵素配列を伴う。現在のプロトコールは、 Fut8によって制御される単遺伝子グリコシル化反応を用いて開発、最適化、および実証されている。したがって、標的遺伝子が代替動態および発現レベルを有する酵素、または冗長な機能を有するアイソザイムによって調節される経路をコードする場合、この方法の堅牢性を確認するためにさらなる研究が必要である。
まとめると、遺伝子を迅速にサイレンシングし、修飾IgGグリコプロファイルを検出する能力は、カスタムグリコエンジニアリング抗体に向けた取り組みにおいて有用なツールです。同様の短期研究からの洞察は、流加培養などの長期アッセイで使用するための安定した糖操作細胞を生成するために適用することができる。薬学的文脈の外では、この方法はグリカン生物学の研究に貢献し、発達、健康、および疾患におけるグリカンの重要な機能を強調する。

N結合型グリコシル化は、オリゴ糖部分がAsn残基に共有結合で結合される酵素プロセスである。de novoタンパク質合成とは異なり、グリカン合成は、タンパク質の不均一なグリコシル化をもたらす非テンプレート化反応である。グリカンの構造、組成、および分布は、タンパク質の立体構造および機能に影響を及ぼし得る。実際、免疫グロブリンG(IgG)の結晶化可能なフラグメント(Fc)領域におけるN-グリコシル化は、抗体1の治療有効性、免疫原性、および半減期を調節する。このように、組換えバイオ治療用タンパク質製品の開発のための設計による品質(QbD)パラダイムは、グリコシル化を重要な品質属性(CQA)として自然に識別します2,3。哺乳動物細胞は、細菌、酵母、昆虫、または植物細胞よりも本質的にヒト様のグリコシル化パターンをより密接に産生するため、しばしば好ましい発現系である。さらに、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、ヒトウイルス感染に耐性があり、高力価で産物を分泌し、浮遊培養で高い生細胞密度に増殖させることができるため、他の哺乳動物細胞株よりも選択される4。グリカン形成に関して、非CHOマウス産生細胞は、モノクローナル抗体(mAbs)5の安全な使用に影響を与える免疫原性グリカン(α(1-3)結合ガラクトース[α(1-3)-Gal]およびN-グリコリルノイラミン酸[NeuGc])を生成する。これらの利点により、CHO細胞は最も重要な発現系となり、2014年から2018年の間に新しいバイオ医薬品の80%以上の生産を担っています6。しかしながら、鋳型非依存性グリコシル化は、一連のグリコフォームを有するCHO由来の生物治療薬をもたらす保存された機構である。
バイオ医薬品開発戦略は、遺伝子工学によってCHO細胞の不均一性を制御することを目指しています。いくつかの文献例には、シアリダーゼ(Neu1、Neu3)7のノックダウン、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ(GMD)ノックアウト8、および糖転移酵素(GnTIII)9の過剰発現が含まれる。CHOゲノム10のような公的に入手可能な資源と、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびクラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)関連タンパク質9(CRISPR-Cas9)などの遺伝子工学ツールの継続的な開発の組み合わせにより、糖工学の進歩が可能である11、12、13、14.これらのツールは、典型的には、プラスミドDNAまたは精製リボヌクレオタンパク質(RNP)複合体としてCHO細胞に送達される。逆に、RNA干渉(RNAi)は、その最も単純な形態では、精製された短い干渉RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドの送達のみを必要とする遺伝子工学技術である。内因性タンパク質は二本鎖siRNAを一本鎖に加工し、ヌクレアーゼであるRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)はsiRNAと複合体を形成して標的mRNA配列を切断する15、16、17。この方法による遺伝子サイレンシングは、RNA不安定性のために一過性であるが、本明細書における調査は、迅速なスクリーニングを支援するためにこの特徴を利用する。
現在の研究のために選択されたモデル酵素であるα1,6-フコース転移酵素(FUT8)は、α-1,6コア結合L-フコース(Fuc)を有するN-グリカンを生成する。この修飾は、市販の抗体の研究によって証明されるように、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の主要な決定因子である。コアフコシル化がない場合、リツキシマブ(抗CD20 IgG1)は、FcgRIIIa結合を改善することによってADCCを50倍に増加させ、トラスツズマブ(抗Her2 IgG1)中のADCCを増加させる18,19。したがって、コアフコシル化は、この表現型を逆転させる努力を正当化するmAbsの望ましくない特徴と考えられている。ADCC 20、21、22の増加を伴うsiRNAを用いたFut8遺伝子ターゲティングの成功例があるが、これらの例はプラスミドDNA上にコードされるFut8 siRNAを送達する。このような実験は、プラスミドDNAがsiRNA合成の鋳型として機能するように、安定した遺伝子サイレンシングを生成する。これにより、細胞は、細胞内RNaseおよびホスファターゼによって分解されるsiRNA分子を補充することができる。逆に、外因性の合成siRNAの送達は、siRNAが細胞内テンプレートの欠如のために補充できないため、一過性の遺伝子サイレンシングのみを可能にする。したがって、ユーザーは、実験計画がプラスミド由来または合成siRNAと互換性があるかどうかを検討する必要があります。例えば、ピークmAb産生に焦点を当てた研究は、典型的には培養23、24の6日目に、ピーク発現の数日前に細胞に送達され得る合成siRNAを選択し得る。合成siRNAを用いた一過性アプローチの利点には、生産を外部委託する能力と、プラスミド中の構築物を生成するのにかかる時間のほんの一部で複数のsiRNA構築物を生成できるという事実が含まれる。さらに、合成siRNAは、FUT8タンパク質発現25を減少させ、FCgRIIIa結合およびADCC26の増加を伴うアフコシル化IgGsを生じるのに十分であるFut8遺伝子サイレンシングの文献例によって証明されるように、有効である。
この糖工学プロトコールの成功は、Fcグリコシル化の程度によって決定された。質量分析は、通常、グリコミック分析に最適な方法です。しかし、キャピラリーゲル電気泳動およびレーザー誘起蛍光検出(CGE-LIF)は、精製されたIgGのグリコプロファイルの解決に完全に適しており、より迅速でシンプルであるという利点を有する。質量分析プロトコルは、適切なクロマトグラフィーおよび誘導体化方法、イオン化源、および質量分析器27、28、29を組み合わせる必要があります。訓練を受けた専門家を必要とすることに加えて、質量分析プロトコルは時間がかかり、方法の多様性は異なるセットアップのラボ間でデータを比較することを困難にします。バイオ医薬品の文脈では、CGE-LIFは抗体グリコプロファイルの十分な詳細を提供することができ、ハイスループット法のために容易に拡張可能な高感度な方法である。存在量が少なく、特性が不十分な糖タンパク質との高度に複雑な混合物の場合、質量分析の利点が残る可能性があります。しかし、CGE-LIFベースのN-グリカン分析によってもたらされる高解像度で高感度のmAb分析は、この方法を試行する理論的根拠として役立ちます。さらに、サンプル調製と分析はわずか数時間30で完了します。最近の研究は、CGE-LIFがヒト血漿31、マウス32、およびCHO IgGs33に由来するグリカンをモニターするために使用できることを示している。これらの研究は、高スループットのサンプル分析と少量のサンプルにCGE-LIFを使用することを強調しています。
CGE-LIF法には、考慮すべき制限があります。コストは、グリカン分析のためのこのデバイスおよび他のデバイスの使用に対する大きな障壁である。しかし、これらのコストは現場では典型的であり、CGE-LIFは費用対効果の高い選択肢であると考えられている34。予算の少ないラボでは、機械をリースしたり、サンプル分析を外部委託したりする方が現実的かもしれません。分析方法のもう1つの考慮事項は、再現性です。CGE−LIFの評価は、異なる日にアッセイされた同じサンプルの48反復を用いて実施した。キャピラリーあたりの相対標準偏差を、バッチ内およびバッチ間の再現性について決定した。反復のバッチ内比較では、6.2%の相対標準偏差を有することが判明し、毛細管性能が均一ではないことを示している。さらに、バッチ間データの比較は、15.8%31の相対標準偏差を示し、毛細管性能が経時的に変化することを示している。特定された運用上の欠点は、異なる機械と独自の試薬を使用する現在の研究では当てはまらない可能性があります。ユーザーが社内プロトコルを開発するつもりなら、Ruhaakらによる研究を検討する価値があるだろう 。図31において、CGE-LIF用の試薬を注意深く評価した。そのようにして、試料注入用の試薬(ハイジホルムアミドおよびDMSO)、グリカン標識(NaBH3CNまたは2−ピコリンボラン)31、およびその他が最適化されている。
この研究は、直接RNAiの迅速さと下流のグリコミック分析を組み合わせた、時間効率の良いグリコエンジニアリングプロトコルを提示します。この方法論は、上記で概説した理由により、 Fut8 遺伝子を標的として用いて例示される。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

組換えモノクローナル抗体は、特定の分子標的に結合し、続いて、免疫応答を誘導するか、または他のリガンドの結合を阻害する。しかしながら、モノクローナル抗体の機能性および半減期は、宿主特異的グリコシル化の種類および分布によって低下し得る。優れた抗体を産生する試みは、糖最適化抗体を合成する遺伝子組み換え生産細胞の開発を鼓舞してきた。糖工学は、典型的には、クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)関連タンパク質9などの方法を用いて、安定なノックアウトまたはノックイン細胞株の生成を必要とする。次いで、操作された細胞によって産生されたモノクローナル抗体は、質量分析法を用いて特徴付けられ、所望のグリコプロファイルが得られたかどうかを決定する。この戦略は時間がかかり、技術的に困難であり、専門家が必要です。したがって、遺伝子グリコエンジニアリングおよびグリカン検出のための合理化されたプロトコルを利用する代替戦略は、最適な抗体に向けた努力を支援する可能性がある。この概念実証研究では、IgG産生チャイニーズハムスター卵巣細胞が糖工学を最適化するための理想的な宿主として役立った。 Fut8 遺伝子を標的とする短い干渉RNAをチャイニーズハムスター卵巣細胞に送達し、その結果生じるFUT8タンパク質発現の変化を定量した。結果は、この方法によるノックダウンが効率的であり、FUT8の〜60%の減少をもたらしたことを示している。抗体グリコプロファイルの相補的解析は、迅速でありながら高感度な技術(キャピラリーゲル電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出)を用いて実施した。すべてのノックダウン実験は、アフコシル化グリカンの増加を示した。しかし、この研究で達成された最大のシフトは約20%でした。このプロトコルは、 インシリコ 設計ツール、商業的に合成された遺伝子標的化試薬、および広範な事前経験を必要としない迅速な定量アッセイを利用することにより、糖工学の取り組みを簡素化します。したがって、このプロトコルによって提供される時間効率は、新しい遺伝子標的の調査に役立つ可能性がある。

ウェスタンブロット分析は、3つの Fut8 DsiRNA構築物の混合物でトランスフェクトされた細胞におけるFUT8タンパク質発現の低下を示した。非標的性DsiRNAを導入した対照試料において、FUT8は〜65および70kDaでダブルバンドとして現れた。FUT8の予測分子量は66kDaであるため、低分子量バンドのシグナル強度の低下は遺伝子サイレンシングの指標である。遺伝子サイレンシングを確認および定量するために、FUT8タンパク質のレベルを相対GAPDHタンパク質レベルに正規化した。ウェスタンブロット分析では、GAPDHの2つのバンドが〜37および35kDaで検出されました。より高い分子量のバンドは、予測されたタンパク質サイズに対応し、したがって、正規化計算に使用される。GAPDHタンパク質レベルに対して標準化すると、FUT8タンパク質発現は最大60%減少した(図1)。
トランスフェクション後48時間での遺伝子ノックダウンの観察に沿って、対応するmAbサンプルをCGE−LIFによる分析のために処理した。ノックダウン細胞由来のグリカン構造は、フコシル化の減少を示した。この傾向は、アガラクトシル化構造(G0F)において最も顕著であり、ガラクトシル化構造(G1F、G1F'およびG2F)においてより少ない程度で観察された。このデータセットから、IgGコアフコシル化の総量は、陰性対照条件で観察されたコアフコシル化の約95%から〜75%に減少した(図2)。コアフコシル化のより大きな減少は、FUT8タンパク質レベルの〜60%の減少を考えると予想された。熟考すると、グリコプロファイルはトランスフェクション以来48時間にわたって蓄積したグリコシル化mAbsを表し、遺伝子サイレンシングは収穫時に存在するタンパク質レベルのみを表すことは注目に値する。
このノックダウン法のさらなる精査には、DsiRNA濃度、収穫時間、およびエレクトロポレーション条件の変化が含まれていました。各因子を個別に調査し、その関連性を判断しました。コアフコシル化および細胞生存率に対するエレクトロポレーションパルス条件の影響は、実験B、C、D、およびEで捕捉される。これらの結果は、2つの方形波パルスを用いたエレクトロポレーション(実験C)からのコアフコシル化が、単一の方形波パルス(実験B)と比較して2倍に減少したことを実証し、細胞生存率に有意差はない(表2)。エレクトロポレーション条件e3(実験D)は、この時点での細胞生存率(〜90%)およびIgG収率が最も低いことをもたらした。しかしながら、エレクトロポレーション事象を生存した細胞は、コアフコシル化の〜10%の減少によって証明されるように、適度にトランスフェクトされた(表2)。興味深いことに、実験Dは、コアフコシル化(14.7%)を最大に減少させたが、明らかに細胞生存率(91%〜93%生存率)に有害であったエレクトロポレーション条件を使用した。この限られた実験セットは、取り返しのつかない損傷を引き起こすことなく細胞膜の十分な透過を可能にするエレクトロポレーション設定を決定する必要性を示しています。また、コアフコシル化におけるsiRNA濃度と収穫時間の役割に注目することも興味深い。全体として、siRNA濃度の増加は、収穫時間を増加させるよりもコアフコシル化に大きな影響を与える(実験B、F、G対実験A、B、H)。将来の実験では、エレクトロポレーション法e2によって送達されるsiRNA濃度を滴定することは興味深いであろう。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> 図1.実験フローチャート。 糖工学およびサンプル分析ステップは、各ステップに必要な関連する時間とともに描かれている。siRNAの設計は、遺伝子標的の数または遺伝子標的ごとの構築物の数に応じて、数時間かかる。siRNAによるCHO細胞トランスフェクションは数時間で完了し、形質転換細胞は48時間増殖するように放置される。細胞ペレットおよび上清は、数時間以内に回収される。細胞ペレットを溶解し、細胞内タンパク質をSDS PAGE上で分離し、続いて標的遺伝子に対する抗体でブロットおよびプローブする。グリカンは精製された抗体から切断され、CGE−LIFによって分析される。これらのアッセイは、それぞれ1日を必要とし得る。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> 図2.RNA干渉の確認。Fut8または非標的対照DsiRNAで処理したサンプル中のα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)タンパク質レベルのウェスタンブロット検出。FUT8に対応するバンドは、Fut8ノックダウンサンプルよりも対照においてより強い。標的遺伝子発現を正常化するために、GAPDHタンパク質レベルも評価した。全ての試料を実験Gから採取した(表2参照)。Kotidisらより転載。52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> 図3.48時間における累積IgGグリコシル化に対する Fut8 ノックダウンの効果。 グリカン分布の変化は、ノックダウンサンプルで検出されます。特に、主コアフコシル化構造(G0F)の相対的存在量は減少し、アフコシル化種はノックダウン実験において増加する。測定は実験Gサンプルから行った( 表2参照)。各実験に対して実施した生物学的3連を採取後に混合し、下流分析の負担を軽減した。Kotidisらより転 載。52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">実験名</td>
			<td colspan="2">エレクトロポレーション法</td>
			<td colspan="2">DsiRNA濃度(nΜ)</td>
			<td>収穫時期(h)</td>
			<td>生存率(%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106セル ・mL-1)</td>
			<td>IgG 力価 (mg·L-1)</td>
			<td colspan="2">コアフコシル化の違い(%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">E2 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E2 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">e3 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e3 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">E4 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E4 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">E1 ·</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>表 2.トランスフェクションの最適化。 エレクトロポレーション法の反復的改変、DsiRNA濃度、および回収時間は、細胞生存率、生細胞密度、回収時のIgG力価、およびコアフコシル化の違いをもたらした。各実験は、ノックダウンとそれぞれの陰性対照とを比較して、修飾が所望の効果(すなわち、フコシル化の減少)を生じるかどうかを決定する。エレクトロポレーションの設定は以下の通りであった: e1: 1200 V, 0.1 ms, 方形波形;e2: 1200 V, 2x 0.1 ms, パルス間5秒, 方形波形;e3: 150 V, 20 ms, 方形波形;e4: 250 V、500 μF、指数関数的減衰。Kotidisらより転載。52。

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Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

抗体のグリコシル化パターンは、その臨床的性能を決定し、したがって、グリコシル化を制御するための産業的および学術的努力は持続する。典型的な糖工学キャンペーンは時間と労力を要するため、一過性サイレンシングを使用してグリコシル化遺伝子の影響を特徴付けるための迅速なプロトコルの生成が有用であることが証明されるであろう。

チャイニーズハムスター卵巣細胞における迅速な抗体糖工学

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

このプロトコルは、標的タンパク質のグリコプロファイルに対する複数のグリコシル化酵素の効果をスクリーニングするために利用され、酵素の機能性のよりよい理解に貢献することができる。このプロトコールの性質により、グリコシル化酵素を一過性でありながらハイスループットな方法でスクリーニングすることができます。グリコシル化プロファイルの変化は、抗体活性の改善につながり、したがって最終生成物の有効性を高めることができる。バイオ製薬企業は、重要な品質属性としてグリコシル化を注意深く監視しています。異常なグリコシル化は、癌のような疾患の特徴である。したがって、この方法は薬理学的および生物医学的研究に関連する。このプロトコルは、哺乳類細胞トランスフェクションやウェスタンブロットを含むいくつかの実験技術の経験があることを前提としています。最初のインスタンスでは、より少ないサンプルから開始し、停止点を使用することをお勧めします。チャイニーズハムスター卵巣細胞の密度と生存率を評価することから始めます。その後、汚染を避けるために、バイオセーフティキャビネットとすべての機器を70%エタノールとRNase阻害剤溶液で慎重に清掃します。次に、細胞を100倍Gで5分間ペレット化し、1ミリリットル当たり6個の細胞に対して10倍から5倍の細胞密度で予め加温した培地にそれらを再懸濁する。8マイクロリットルのDsiRNAマスターミックスまたはコントロールを滅菌エレクトロポレーションキュベットに移す。800マイクロリットルの細胞懸濁液を同じキュベットに加え、混合し、エレクトロポレーションパルスを送達する。次いで、細胞懸濁液をキュベットから6ウェルプレートの1ウェルに移し、泡状物質を避ける。細胞を振とうせずに10分間インキュベートする。インキュベーション後、800マイクロリットルの予め加温した培地を加えて、ウェルあたり1.6ミリリットルの最終容量を作る。トランスフェクトした細胞をインキュベーター内で150RPMで振とうしながら増殖させる。48時間後、上清および細胞を回収する。IgG精製後、溶出Aを分画分子量3キロダルトン遠心濃縮機に加え、4°Cで40~50分間、Gを13,300回で遠心分離した。遠心分離は、残留体積が50マイクロリットル以下になると完了する。フロースルーを破棄し、500マイクロリットルの予め冷却した1X PBSを加えて、残留上清を希釈する。50マイクロリットルの残留上清が残るまで同じ条件を用いて試料を再度遠心分離する。上清の100倍希釈液を得るために、予め冷却した1X PBSを500マイクロリットル加え、遠心分離工程を繰り返す。上清を40マイクロリットルで1リットルあたり約2.5グラムの終濃度に濃縮し、グリカン分析法との適合性を確保します。グリカン分析のために、200マイクロリットルの磁気ビーズ溶液を2ミリリットルPCRチューブに移す。磁気スタンドの上に置き、ビーズを上澄み液から分離し、上澄み液を慎重に取り除きます。その後、磁気スタンドからチューブを取り出し、精製タンパク質サンプルとボルテックスを加えます。次に、供給変性緩衝液をサンプルチューブに加え、摂氏60度で8分間インキュベートする。最適な反応性能を得るために、サンプルチューブを開いたままにしておきます。インキュベーション後、PNGase Fを加え、摂氏60度でさらに20分間インキュベートして、精製抗体からグリカンを切断する。N-グリカンの放出後、サンプルチューブを閉じ、渦を巻き起こす。次いで、アセトニトリルをサンプル管に加え、ボルテックスし、室温で1分間インキュベートした。サンプルチューブを磁気スタンドに置き、ビーズを溶液から分離します。その後、ピペットを用いて、ビーズに触れることなく上澄み液を慎重に除去する。蛍光色素含有グリカン標識溶液をヒュームフード内のサンプルに加え、ボルテックス処理により混合する。開いた蓋で摂氏60度で20分間インキュベートした後、サンプルをアセトニトリルで3回洗浄して余分な色素を除去した。次いで、標識されたグリカンを二重蒸留水に溶出させる。サンプルチューブを磁気スタンドに置き、精製および標識グリカンで富化した上清を回収する。次に、必要なすべての標準とサンプルを準備し、指定されたトレイ位置にロードします。グリカン分析プロトコルを実行し、適切なソフトウェアを使用してサンプル中に存在するグリカンを分析および同定します。ウェスタンブロット分析は、3つのFut8 DsiRNA構築物の混合物でトランスフェクトされた細胞におけるFut8タンパク質発現の減少を示した。ノックダウン細胞由来のグリカン構造も、フコシル化の減少を示した。この傾向は、アガラクトシル化構造において最も顕著であり、ガラクトシル化構造においてより少ない程度で観察された。2つの方形波パルスを用いたエレクトロポレーションからコアフコシル化の2倍の減少が観察されたが、細胞生存率に大きな差はない単一の方形波パルスと比較して観察された。全体として、短い干渉RNA濃度の増加は、収穫時間を増加させるよりもコアフコシル化に大きな干渉を有する。水とアセトニトリルの比率は、グリカンが溶液中またはビーズの一部にあるかどうかを決定します。これは、溶液から標識されたグリカンが誤って除去されるのを避けるために、洗浄ステップ中に覚えておくことが重要です。フォローアップ実験には、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性を定量化するための細胞ベースのアッセイを用いた精製モノクローナル抗体の特性評価が含まれる可能性がある。

Research

JoVE Journal

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