Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

PK takker Institutt for kjemisk prosessteknologi, Imperial College London, for hans stipend. RD takker U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council for hans studentskap. MM er finansiert av U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Grant reference: BB/S006206/1). IAG takker Det irske forskningsrådet (stipendnr. GOIPG/2017/1049) og CONACyT (Stipend nr. 438330).

1. DsiRNA design og rekonstituering
<ol><li>Bruk Safari, Firefox eller Microsoft Edge for å få tilgang til IDT-nettstedet (https://eu.idtdna.com). Velg fanen Produkter og tjenester på hjemmesiden etterfulgt av RNA-interferens. Hvis du vil generere egendefinerte terningkast (DsiRNA) som er rettet mot Fut8-genet , velger du Utformingsverktøy etterfulgt av fanen Generer egendefinert DsiRNA .<ol>
<li>Skriv inn Fut8-tiltredelsesnummeret, eller skriv inn gensekvensen manuelt for å begynne. I denne studien ble de foreslåtte Fut8-sekvensene fra både "CHO-K1" og "Chinese Hamster" -oppføringer hentet fra https://chogenome.org og brukt til å generere DsiRNA. De fleste gener har flere transkripsjonsvarianter, og det er viktig å verifisere at DsiRNA vil være aktiv på alle rapporterte varianter i den nåværende samlingen.</li>
		<li>Velg alternativet for å utføre et "Manuell BLAST" -søk, da CHO-cellegenomet for øyeblikket ikke er tilgjengelig som et "referansegenom" på IDT-nettstedet. Dette trinnet søker etter treff mellom egendefinerte DsiRNA-sekvenser og genomet av interesse.</li>
		<li>Klikk Søk for å generere DsiRNA-sekvenser.</li>
		<li>Vurder i sin tur spesifisiteten til hver DsiRNA ved hjelp av "Manual BLAST" -funksjonen med skatte-ID:10029 (CHO-cellelinjer og kinesisk hamster). Resultatene fra spørringsdekningen indikerer at DsiRNA konstruerer match fut8 (inkludert Fut8-transkripsjonsvarianter ) til 100 %, mens komplementaritet mot utilsiktede mål er ≤76 %35.</li>
		<li>Kontroller at DsiRNA spesifikt er rettet mot Fut8 for å sikre at GC-innholdet er mellom 30% -50%. Et lavt GC-innhold er forbundet med svak og uspesifisert binding, mens et høyt GC-innhold hemmer siRNA-avslapping og lasting i RISC-komplekset36.</li>
		<li>Velg tre DsiRNA for bruk i transfeksjonsstudier (tabell 1), som hver er rettet mot et annet sted for Fut8-genet . Kjøp en forhåndsutformet ikke-målrettet eller kryptert DsiRNA fra IDT for kontrolleksperimenter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ved ankomst sentrifugerer du DsiRNA på 13 300 x g i 1 min til pellets før du åpner røret. Rekonstituer hver lyofiliserte DsiRNA i nukleasefri dupleksbuffer (levert av IDT) til en 100 μM lagerløsning. Legg for eksempel til 20 μL buffer til 2 nmol DsiRNA for å få en 100 μM lager.<ol>
<li>For å sikre tilstrekkelig blanding, inkuber lagerløsningene ved romtemperatur i 30 minutter mens du rister forsiktig på en orbital shaker (50 rpm, 16 mm bane).</li>
		<li>Lag en mesterblanding ved å kombinere 20 μL av hver DsiRNA-konstruksjon som er rettet mot Fut8 (100 μM av hver DsiRNA). Forbered aliquots og oppbevar ved −20 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>DsiRNA-mål</td>
			<td colspan="3">Sekvens</td>
			<td>GC (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Struktur A</td>
			<td colspan="3">5' GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3'</td>
			<td rowspan="2">36%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">5' GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUC 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Struktur B</td>
			<td colspan="3">5' AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3'</td>
			<td rowspan="2">32%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">5' AAGGAAAAACAUCCAUUCAUUCUGA 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Struktur C</td>
			<td colspan="3">5' AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3'</td>
			<td rowspan="2">32%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">5' GUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCG 3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. DsiRNA-sekvenser som brukes til Fut8-knockdown. Sekvenser generert av IDT som er rettet mot Fut8 i kinesiske hamster- og CHO K1-cellegenomer. Sans- og antisensesekvensene for hver konstruksjon vises (henholdsvis), og GC-innholdet i hver struktur vises. Gjengitt fra Kotidis et al. 52.
2. DsiRNA-transfeksjon
<ol><li>Gjenoppliv CHO-celler som uttrykker et IgG monoklonalt antistoff37 ved hjelp av kulturforhold som passer for cellelinjen av interesse. MERK: Cellene som brukes i denne studien ble generert ved hjelp av glutaminsyntetasesystemet (GS), der endogen GS hemmes av L-metioninsulffoksimin (MSX) for å forbedre utvalget av sjeldne høyproduserende kloner. Bruk derfor bare MSX hvis det kreves av den valgte cellelinjen.<ol>
<li>Avriming av et hetteglass med celler i 2-3 min i et vannbad satt til 37 °C. Rengjør hetteglasset utvendig med 70% (v / v) etanol og fortsett alt arbeid i et klasse II biosikkerhetsskap.</li>
		<li>Overfør cellefjæringen til et 15 ml sentrifugerør som inneholder 9 ml forhåndsvarslet medium som passer for den valgte cellelinjen. Pellet cellene ved sentrifugering ved 100 x g i 5 min.</li>
		<li>Fjern og kast forsiktig mediet uten å forstyrre cellepelleten. Deretter resuspenderer du cellepelleten i 10 ml forhåndsvarslet medium og tar en aliquot for telling.</li>
		<li>Flekk cellene med Trypan blå hvis du teller med et hemocytometer, eller en passende flekk for å skille levende / døde celler når du bruker en automatisert celleteller.</li>
		<li>Etter en av opplistingsmetodene overfører du et passende volum celleoppheng til en 125 ml Erlenmeyer shake-kolbe med en levedyktig celletetthet på 3 x 105 celler·ml-1 i 30 ml middels (med valgfri tilskudd på 50 μM MSX).</li>
		<li>Overfør celler til en inkubator satt til 36,5 °C, 5 % CO2 og plasser dem på en risteplattform ved 150 o/min (16 mm bane).</li>
		<li>Passasjeceller hver 3-4 dager med en såddtetthet på 2 x 105 celler·mL-1 og et arbeidsvolum på 50 ml i en 250 ml Erlenmeyer shake kolbe. Hvis du bruker MSX, må du avslutte tilskuddet etter første gang.</li>
		<li>Passasjeceller 2x i tillegg til opptining.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfeksjon<ol>
<li>Vurder celletettheten og sørg for at celle levedyktigheten er større enn 90%.</li>
		<li>Rengjør biosikkerhetsskapet og alt utstyr forsiktig med 70% (v / v) etanol og en RNase-hemmerløsning for å unngå forurensning.</li>
		<li>Pelletsceller på 100 x g i 5 minutter og resuspend i forvarsel medium til en levedyktig celletetthet på 5 x 106 celler·mL-1.</li>
		<li>Overfør 8 μL (tilsvarende 1 μM) av DsiRNA master mix eller kontroll til en steril (0,4 cm) elektroporering cuvette. Overfør deretter 800 μL av celleopphenget (tilsvarende 4 x 106 celler) til samme cuvette og sørg for at begge komponentene blandes.</li>
		<li>Lever følgende pulsforhold: 1200 V, 0,1 ms, firkantet bølgeform.</li>
		<li>Overfør cellefjæringen fra cuvette til en brønn av en 6-brønns plate, pass på å unngå skumlignende materiale. Gjenopprett cellene i inkubatoren (36,5 °C, 5 % CO2) uten å riste i 10 minutter.</li>
		<li>Tilsett 800 μL forhåndsvarslet medium for å lage et sluttvolum på 1,6 ml per brønn og returner de transfekterte cellene til inkubatoren for vekst (36,5 °C, 5 % CO2) mens du rister ved 150 o/min (16 mm bane).</li>
		<li>Høst supernatantene og cellene ved 48 timer etter transfeksjon. Stoppested: Cellekulturens supernatant kan holdes ved -20 °C; Det anbefales imidlertid at cellelyset utføres umiddelbart etter cellepelletsoppsamling for å unngå proteinforringelse. Supernatanter brukes i trinn 3, trinn 4 og trinn 5, mens cellepellets brukes i trinn 6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IgG kvantifisering og rensing
<ol><li>Mål IgG-konsentrasjon ved hjelp av biolagsinterferometri eller en annen valgfri metode.<ol>
<li>Hydratprotein En biosensorspiss i prøve fortynningsmiddel i 10-30 min. I mellomtiden overfører du cellesuspensjoner til 15 ml sentrifugerør og pelletsceller ved 100 x g i 5 minutter eller fjerner celler ved filtrering gjennom et 0,45 μm nitrocellulosefilter.</li>
		<li>Uten å forstyrre pelletsen, overfør forsiktig det isolerte supernatantet som inneholder IgG til et rent sentrifugerør.</li>
		<li>Bruk følgende innstillinger for biolayer interferometri: shaker hastighet, 2200 rpm; kjøretid, 60 s. Disse parameterne brukes til å måle alle prøver og kontroller.</li>
		<li>Når biosensorspissene er hydrert, lager du en standardkurve ved hjelp av en IgG-standard (4 μL av hver konsentrasjon).</li>
		<li>Kvantiser prøvekonsentrasjoner ved å laste 4 μL av cellen supernatant. Rengjør apparatet med lofrie våtservietter mellom hver prøve.</li>
		<li>Koble standardkurven til de ukjente prøvene for å interpolere bindingshastigheten for de ukjente prøvene. Lagre dataene og eksporter som en CSV- eller PDF-fil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG-rensing<ol>
<li>Klargjør elutionbufferen som inneholder 0,2 M glycin (pH 2,5) og steriliser ved å passere gjennom et 0,22 μm filter.</li>
		<li>Filtrer 1 ml av det isolerte supernatantet ved romtemperatur ved hjelp av 0,22 μm mikrocentrifuge filterrør til hele supernatanten strømmer gjennom.</li>
		<li>Pellet 150-200 μL protein A agarose perler i 1,5 ml sentrifugerør ved 100 x g i 3 minutter og kast supernatanten. Vask deretter proteinet A perler med 150-200 μL cellekulturmedium og gjenta sentrifugering. Kast supernatanten.</li>
		<li>Resuspend det likevektede proteinet A perler med 1 ml av de tilberedte supernatantene fra trinn 3.2.3. og last inn i et 1 ml polypropylenrør. Fest polypropylenrøret til en roterende mikser (15 mm bane) og spinn ved 30 o/min i 60-90 minutter ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.</li>
		<li>Etter at inkubasjonen er fullført, samle gjennomstrømningen og vask perlene med 1 ml 1x PBS for å fjerne ubundne proteiner. Samle vaskefraksjonen også.</li>
		<li>Elute IgG fra protein A perler ved å legge 3 ml elution buffer til polypropylen kolonnen. Samle sekvensielle fraksjoner som drenerer fra kolonnen (500 μL hver) i merkede rør.</li>
		<li>Valgfritt: Hvis det rensede antistoffet skal lagres, nøytraliserer du elutionbufferen ved å tilsette 25 μL 1 M Tris pH 9,5. Hopp over dette trinnet hvis antistoffet vil bli behandlet umiddelbart via bufferutveksling, etc. MERK: Alle deler av rensingen (gjennomstrømning, vask og alle elutionfraksjoner) bør holdes for å sikre at målproteinet ikke går tapt. Disse eksemplene kan også hjelpe under feilsøking hvis rensingen ikke lykkes.</li>
		<li>Bruk den første elution (elution A) for nedstrøms behandling, men behold alle andre brøker hvis de kreves i fremtiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Bufferutveksling og prøvekonsentrasjon
<ol><li>Exchange IgG-elutionbuffer med 1x PBS.<ol>
<li>Last elution A på en 3 kDa molekylvekt cutoff sentrifugalkonsentrator. Se produsentens veiledning når du velger en passende MWCO-kolonne. I dette eksperimentet sikrer en mindre porestørrelse maksimal oppbevaring av utskilt protein, men øker også sentrifugeringstiden.</li>
		<li>Sentrifuge ved 13.300 x g i 40-50 min ved 4 °C. Sentrifugering er fullført når restvolumet er lik eller mindre enn 50 μL.</li>
		<li>Kast gjennomstrømningen og tilsett 500 μL prechilled (4 °C) 1x PBS for å fortynne resterende supernatant. Sentrifuger prøven igjen ved hjelp av de samme forholdene (13 300 x g i 40-50 min ved 4 °C) til 50 μL gjenværende supernatant gjenstår.</li>
		<li>Tilsett 500 μL prechilled (4 °C) 1x PBS for å fortynne gjenværende supernatant og gjenta sentrifugeringsprosessen igjen for å oppnå en 100x fortynning av supernatanten.</li>
		<li>Konsentrer supernatanten til en endelig konsentrasjon på ~ 2,5 g· L-1 i 40 μL eller mindre for å sikre kompatibilitet med glykananalysemetoden. MERK: 100 μg må lastes for glykananalyse. Stoppested: Den konsentrerte IgG (i 1x PBS) kan lagres ved −20 °C og tines før glykananalyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Glykansk analyse
<ol><li>Utfør glykananalyse ved hjelp av kapillær gelelektroforese i henhold til produsentens instruksjoner.<ol>
<li>Overfør 200 μL av den magnetiske perleløsningen til et 0,2 ml PCR-rør og plasser det magnetiske stativet for å skille perlene fra supernatanten.</li>
		<li>Fjern forsiktig supernatanten og fjern rørene fra det magnetiske stativet. Tilsett renset proteinprøve og virvel for å sikre fullstendig blanding.</li>
		<li>Tilsett denatureringsbuffer (følger med) i prøverøret og inkuber i 8 minutter ved 60 °C. Hold prøverørene åpne for optimal reaksjonsytelse.</li>
		<li>Tilsett PNGase F (500 enheter per prøve) og inkuber i 20 minutter ved 60 °C for å holde glykaner fra de rensede antistoffene.</li>
		<li>Lukk prøverøret og virvelen etter frigjøring av N-glykaner. Tilsett acetonitril, virvel og inkuber ved romtemperatur i 1 min.</li>
		<li>Plasser prøverørene i det magnetiske stativet for å skille perlene fra løsningen. Bruk en pipette for å fjerne supernatanten forsiktig uten å berøre perlene.</li>
		<li>I en avtrekkshette tilsetter du glykanetikettløsningen som inneholder fluorofor i prøven. Vortex for å sikre tilstrekkelig blanding og inkubering ved 60 °C i 20 minutter (åpne lokk).</li>
		<li>Vask prøven 3x i acetonitril for å fjerne overflødig fargestoff. Deretter unngår du de merkede glykanene i DDI-vann (følger med).</li>
		<li>Plasser prøverøret i det magnetiske stativet for å skille perlene fra supernatanten som inneholder rensede og merkede glykaner.</li>
		<li>Forbered og last glukose stigestandarden, alternative standarder og prøver i de angitte brettposisjonene. Kjør glykananalyseprotokollen.</li>
		<li>Bruk passende programvare for å analysere og identifisere glykanene som finnes i eksemplet. MERK: Sørg for at temperaturen i varmeblokken er nøyaktig for effektiv inkubasjon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Vestlig blott
<ol><li>Kvantifisere knockdown effektivitet ved hjelp av vestlig blot analyse med en anti-α-1,6-fucosyltransferase antistoff. Polyakrylamidgeler og bufferoppskrifter er tilgjengelige fra kommersielle leverandører38,39.<ol>
<li>Ved 48 h etter transfeksjon teller cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert celleteller og bestemmer volumet av celleoppheng tilsvarende 5 x 106 celler.</li>
		<li>Overfør riktig volum cellefjæring fra hver eksperimentell tilstand til et sterilt 1,5 ml sentrifugerør og pellets ved 13 200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.</li>
		<li>Lyse cellene med 200 μL lysisbuffer (egnet for utvinning av proteiner fra pattedyrceller) som inneholder 1% v / v proteasehemmercocktail ved romtemperatur i 10 minutter. Rist blandingen forsiktig under inkubasjon (50 rpm, 16 mm bane).</li>
		<li>For å fjerne cellulært rusk, sentrifugerer du lysatet ved 13 200 x g i 10 minutter og overfører deretter det ryddede lysatet til et sterilt 1,5 ml rør.</li>
		<li>Mål proteinkonsentrasjonen av hvert lysat ved hjelp av et spektrofotometer ved 280 nm. Deretter forbereder du aliquots av hver prøve justert for å ha samme proteinkonsentrasjon.</li>
		<li>Denaturer proteinprøvene ved inkubasjon ved 100 °C i 10-15 min i DTT-SDS prøvelastefargestoff; den endelige fargekonsentrasjonen er 1x.</li>
		<li>Last 15 μL av de denaturerte prøvene og 5 μL prestained protein stige i en SDS-PAGE gel med 12,5% løse gel for effektiv separasjon. Kjør prøvene på 25 mA per gel i 90 min eller til fargefronten når enden av gelen.</li>
		<li>Fjern gelen forsiktig fra kassetten og inkuber i 1x overføringsbuffer som inneholder metanol.</li>
		<li>Forbered det våte overføringssystemet og aktiver en PVDF-membran med metanol. Monter gel- og PVDF-membranen for våt overføring, legg en isblokk i overføringstanken, og senk hele tanken i is for å sikre at overføringsforholdene forblir kalde. Kjør på 350 mA/100 V i 60 min.</li>
		<li>Blokker membranen ved å inkubere i en blokkeringsløsning i 30 minutter ved romtemperatur mens du rister forsiktig på en orbital shaker ved 50 rpm (16 mm bane).</li>
		<li>Skyll membranen med sterilt vann i 5 min og gjenta. Bruk deretter en ren skalpell for å forsiktig kutte membranen horisontalt ved ~ 50 kDa, ved hjelp av den synlige proteinstigen som guide.</li>
		<li>Inkuber membranen som inneholder proteiner større enn 50 kDa med anti-α-1,6-fucosyltransferase antistoff ved 1:1000 i en antistoff fortynningsbuffer. Inkuber membranen med immobiliserte proteiner mindre enn 50 kDa med anti-GAPDH ved 1:10.000 i fortynningsbuffer. Membraner kan inkuberes i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.</li>
		<li>Vask membranene i 5 min (x3) og inkuber deretter med et passende sekundært antistoff i minst 30 minutter ved romtemperatur.</li>
		<li>Utfør 3x vasker med en vaskebuffer i 5 min, etterfulgt av 3x vasker med vann. Deretter utvikler du membranen med et kromogent substrat (eller passende deteksjonsreagens) til båndene vises (1-60 min).</li>
		<li>Skyll membranen 2x med vann, og la den tørke. Ta et bilde av membranen og utfør densitometrisk analyse40.</li>
		<li>Hvis du vil beregne det relative proteinuttrykket i hver prøve, må du først beregne forholdet mellom GAPDH-signalet i prøver. Dette er normaliseringsfaktoren for hvert utvalg som korrigerer for avvik i prøvelasting. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63872/63872eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		<li>Del FUT8-signalintensiteten (for hver bane) på normaliseringsfaktoren for den tilsvarende banen for å oppnå det relative FUT8-proteinuttrykket. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63872/63872eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Glykosyleringsveier innebærer et komplekst metabolsk nettverk av enzymer og tilbehørsproteiner. Dissekering av funksjonen til veibestanddeler er skremmende hvis du er avhengig av konvensjonell knockout eller knockin genteknologiske strategier alene. En alternativ tilnærming er å foreløpig screene medlemmer av en vei ved hjelp av en forbigående tap av funksjon analyse. For dette formål ble to raske protokoller kombinert, RNAi og CGE-LIF deteksjon, for å skape en mer effektiv måte å karakterisere glykosyleringsgener på. Metoden som er beskrevet krever 5-7 dager for ferdigstillelse sammenlignet med konvensjonelle metoder som potensielt kan ta flere uker for ferdigstillelse. Videre kan forskningsmiljøer med automatiseringsfunksjoner utnytte denne metoden til å screene flere genkandidater enn mulig med manuell håndtering.
Suksessen til en forbigående glykoengineeringskampanje er i stor grad avhengig av siRNA-designen. Tilpassede DsiRNA-design må følge reglene som tidligere er skissert, eller for enkelhets skyld, brukere kan velge kommersielt tilgjengelige forhåndsdesignede sekvenser. I likhet med andre genmodifiseringsstrategier har RNAi potensial for off-target effekter. Derfor oppfordres brukere til å vurdere utilsiktet genmålretting ved beregningsmetoder41. Eksperimentelle designvalg kan også bidra til å begrense off-target effekter. Kittler et al. viste at multiplekset levering av siRNA førte til en reduksjon i off-target effekter42. Selv om dette virker kontraintuitivt, foreslås det at en mesterblanding reduserer konsentrasjonen av hver siRNA-konstruksjon, og dermed begrenser muligheten for off-target genaktivering. En annen fordel er at samtidig transfeksjon av siRNA-strukturer som retter seg mot det samme genet øker sannsynligheten for vellykket RNAi. Bruken av en mastermiks sikrer også konsistens mellom prøver og replikerer og fremskynder transfeksjonsprosessen. Etter en innledende skjerm med blandede siRNA-konstruksjoner, kan et annet eksperiment utføres ved hjelp av individuelle konstruksjoner for å fastslå RNAi-effektiviteten til hver sekvens. I denne og andre knockdown-studier har opptil tre siRNA blitt samlet og levert til cellene 43,44,45. Det kan imidlertid være ønskelig å screene mer enn tre siRNA samtidig for effektivt å målrette mot et enkelt gen eller å målrette mot flere gener. Faktisk viste en studie multiplekset siRNA-mediert silencing av opptil seks gener på nivåer som kan sammenlignes med silencing av individuelle gener46. Imidlertid er det nødvendig med ytterligere studier for å bestemme maksimalt antall siRNA-konstruksjoner som kan brukes i et basseng uten at det går på bekostning av silencingeffektiviteten. Multiplex-strategien ble foreslått av Martin et al. for å forbedre tempoet i RNAi-bibliotekets screeningeksperimenter46, og et lignende konsept kan være nyttig for å screene glykosyleringsgener.
Protokollen som beskrives her, fungerer som et konseptbevis med forventning om at påfølgende eksperimenter vil bli utført for å validere andre glykosyleringsgener. Nye gener av interesse kan være ukarakteriserte eller mindre populære enn Fut8, og primære antistoffer for å oppdage genaktivering kan være dårlige eller utilgjengelige. I dette scenariet kan alternative metoder som RT-PCR brukes til å kvantifisere genaktivering47, men det bør bemerkes at RT-PCR oppdager mRNA i stedet for protein. Når antistoffer for vestlig blotting er tilgjengelige, er et vanlig problem dårlig deteksjon eller tilstedeværelse av ikke-spesifikke bånd. Feilsøkingsveiledninger for å hjelpe brukere med å løse vanlige problemer er tilgjengelige, og disse har en tendens til å inkludere en rekke løsninger som primær antistofftitrering, alternativ blokkering og deteksjonsforhold48,49. I denne studien dukket FUT8 uventet opp som et dobbeltband på ~ 65 og ~ 70 kDa. Det er mulig at ~70 kDa-båndet representerer glykosylert FUT8. Litteraturbevis fra menneskelige cellelinjer beskriver O-koblet glykosylering ved Thr 564 50,51, et nettsted som er bevart i kinesisk hamster, og CHO K1 FUT8-sekvenser.
Som tidligere nevnt involverer glykosyleringsveier ofte et komplekst utvalg av enzymer. Den nåværende protokollen er utviklet, optimalisert og demonstrert ved hjelp av en monogen glykosyleringsreaksjon kontrollert av Fut8. Derfor er det nødvendig med ytterligere studier for å bekrefte robustheten til denne metoden når målgenet koder et enzym med alternative kinetikk- og uttrykksnivåer eller en vei regulert av isoenzymer med overflødige funksjoner.
Samlet sett er evnen til raskt å kneble gener og oppdage modifiserte IgG-glykoprofiler et nyttig verktøy i arbeidet mot tilpassede glykoengineered antistoffer. Innsikt fra lignende kortsiktige studier kan anvendes for å generere stabile glykoengineered celler for bruk i langsiktige analyser som fed-batch kultur. Utenfor den farmasøytiske konteksten bidrar denne metoden til studiet av glykanbiologi og fremhever glykanenes viktige funksjon i utvikling, helse og sykdom.

N-koblet glykosylering er en enzymatisk prosess der oligosakkaridmoieties er kovalent knyttet til Asn-rester. I motsetning til de novoproteinsyntese er glykansyntese en ikke-mald reaksjon som resulterer i heterogen glykosylering av proteiner. Strukturen, sammensetningen og fordelingen av glykaner kan påvirke proteinkonformasjon og funksjon. Faktisk regulerer N-glykosylering i det krystalliliserbare fragmentet (Fc) regionen immunoglobulin G (IgG) den terapeutiske effekten, immunogenisiteten og halveringstiden til antistoffet1. Som sådan identifiserer kvaliteten etter design (QbD) paradigme for utvikling av rekombinante bioterapeutiske proteinprodukter naturlig glykosylering som en kritisk kvalitetsattributt (CQA) 2,3. Pattedyrceller er ofte de foretrukne uttrykkssystemene da de iboende produserer menneskelignende glykosyleringsmønstre nærmere enn bakterier, gjær, insekt eller planteceller. Videre velges kinesiske hamsterovarieceller (CHO) over andre pattedyrcellelinjer fordi de er motstandsdyktige mot menneskelig virusinfeksjon, utskiller produkter ved høye titere, og kan dyrkes i suspensjonskultur til høye levedyktige celletettheter4. Når det gjelder glykandannelse, genererer ikke-CHO murinproduksjonsceller immunogene glykaner (α(1-3)-koblet galaktose [α(1-3)-Gal] og N-glykolylneuraminsyre [NeuGc]) som hindrer sikker bruk av monoklonale antistoffer (mAbs)5. Disse fordelene gjør CHO-cellene til det fremste uttrykkssystemet, ansvarlig for produksjon av over 80% av nye biotherapeutics mellom 2014 og 20186. Maluavhengig glykosylering er imidlertid en konservert mekanisme som fører til CHO-avledet bioterapeutikk med en rekke glykoformer.
Bioterapeutiske utviklingsstrategier tar sikte på å kontrollere heterogenitet i CHO-celler ved genteknologi. Noen litteratureksempler inkluderer nedslag av sialidaser (Neu1, Neu3)7, BNP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) knockout8, og overekspression av glykosyltransferaser (GnTIII)9. Fremskritt innen glykoengineering er mulig på grunn av en kombinasjon av offentlig tilgjengelige ressurser, som CHO-genomet10, og den pågående utviklingen av genteknologiske verktøy, for eksempel transkripsjonsaktivatorlignende effektorkjerner (TALENer), sinkfingerkjerner (ZFNer) og grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)-assosiert protein 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Disse verktøyene leveres vanligvis til CHO-celler som plasmid-DNA eller som rensede ribonukleoproteinkomplekser (RNP). Omvendt er RNA-interferens (RNAi) en genteknologi som i sin enkleste form bare krever levering av rensede korte forstyrrende RNA (siRNA) oligonukleotider. Endogene proteiner behandler dobbeltstrenget siRNA i enkeltstrenger, og kjernen, RNA-indusert silencing kompleks (RISC), danner et kompleks med siRNA for å cleave mål mRNA sekvenser 15,16,17. Genaktivering via denne metoden er forbigående på grunn av RNA ustabilitet, men undersøkelsen heri utnytter denne funksjonen for å hjelpe rask screening.
Modellenzymet som er valgt ut for den nåværende studien, α1,6-fucosyltransferase (FUT8), produserer N-glykaner med α-1,6 kjernebundet L-fucose (Fuc). Denne modifikasjonen er et primært determinant for antistoffavhengig cellecytotoksisitet (ADCC) aktivitet, som det fremgår av studier av kommersielle antistoffer. I fravær av kjernefukosylering øker Rituximab (anti-CD20 IgG1) ADCC 50 ganger og øker ADCC i Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) ved å forbedre FcgRIIIa binding18,19. Kjernefukosylering anses derfor som et uønsket trekk ved mAbs som garanterer innsats for å reversere denne fenotypen. Det er eksempler på vellykket Fut8 genmålretting ved hjelp av siRNA med samtidige økninger i ADCC 20,21,22, selv om disse eksemplene leverer Fut8 siRNA kodet på plasmid DNA. Slike eksperimenter genererer stabil genaktivering som plasmid DNA fungerer som en mal for siRNA syntese. Dette gjør det mulig for celler å fylle opp siRNA-molekyler som er degradert av intracellulære RNaser og fosfater. Omvendt tillater levering av eksogen syntetisk siRNA bare forbigående genaktivering, da siRNA ikke kan etterfylles på grunn av mangel på en intracellulær mal. Dermed bør brukerne vurdere om eksperimentelle design er kompatible med plasmid-avledet eller syntetisk siRNA. For eksempel kan studier fokusert på topp mAb-produksjon, vanligvis dag seks av kulturen 23,24, velge syntetisk siRNA som kan leveres til celler noen dager før topputtrykk. Fordelene med en forbigående tilnærming ved hjelp av syntetisk siRNA inkluderer evnen til å outsource produksjon og det faktum at flere siRNA-konstruksjoner kan genereres i en brøkdel av tiden det tar å generere konstruksjoner i plasmider. Videre er syntetisk siRNA effektiv, noe som fremgår av litteratureksempler på Fut8-genaktivering som er tilstrekkelig til å redusere FUT8-proteinuttrykk25 og gi afukosylerte IgG-er med økt FCgRIIIa-binding og ADCC26.
Suksessen til denne glykoengineering protokollen ble bestemt av graden av Fc glykosylering. Massespektrometri er normalt den valgte metoden for glykomiske analyser; Kapillær gelelektroforese og laserindusert fluorescensdeteksjon (CGE-LIF) er imidlertid perfekt egnet til å løse glykoprofil av rensede IgGs og har fordelen av større hurtighet og enkelhet. Massespektrometriprotokoller må kombinere passende kromatografiske og avledningsmetoder, ioniseringskilder og masseanalysatorer 27,28,29. I tillegg til å kreve en utdannet spesialist, er massespektrometriprotokoller lange, og mangfoldet av metoder gjør data vanskelig å sammenligne mellom laboratorier med forskjellige oppsett. I forbindelse med biofarmasøytiske stoffer er CGE-LIF en sensitiv metode som kan gi tilstrekkelige detaljer om en antistoffglykoprofil og er lett skalerbar for høygjennomstrømningsmetoder. For lav overflod, svært komplekse blandinger med dårlig karakteriserte glykoproteiner, kan fordelene med massespektrometri forbli. Imidlertid tjener høyoppløselig og høysensitiv mAb-analyse gitt av CGE-LIF-basert N-glykananalyse som en begrunnelse for å prøve denne metoden. Videre er prøveforberedelse og analyse fullført på bare noen få timer30. Nyere studier har vist at CGE-LIF kan brukes til å overvåke glykaner avledet fra human plasma31, mus32 og CHO IgGs33. Disse studiene fremhever bruken av CGE-LIF for høygjennomstrømningsprøveanalyse og små utvalgsvolumer.
CGE-LIF-metoden har begrensninger som bør tas i betraktning. Kostnad er en betydelig barriere for bruk av dette og andre enheter for glykananalyse. Disse kostnadene er imidlertid typiske innen feltet, og CGE-LIF antas å være et kostnadseffektivt alternativ34. Laboratorier med mindre budsjetter kan finne det mer praktisk å leie maskiner eller outsource prøveanalyse. En annen vurdering av enhver analytisk metode er repeterbarhet. Evaluering av CGE-LIF ble utført ved hjelp av 48 replikeringer av samme utvalg som ble analysert på forskjellige dager. Det relative standardavviket per kapillær ble bestemt for intrabatch og interbatch repeterbarhet. Intrabatch-sammenligningen av replikeringer ble funnet å ha et relativt standardavvik på 6,2%, noe som indikerer at kapillær ytelse ikke er jevn. Videre viste en sammenligning av interbatch-data et relativt standardavvik på 15,8% 31, noe som indikerer at kapillærytelsen endres over tid. De operasjonelle manglene som er identifisert, gjelder kanskje ikke i den aktuelle studien, som bruker forskjellige maskiner og proprietære reagenser. Hvis brukere har tenkt å utvikle en intern protokoll, ville det være verdt å vurdere studien av Ruhaak et al. 31, som nøye evaluerte reagensene for CGE-LIF. Som sådan, reagenser for prøve injeksjon (Hi-Di Formamide og DMSO), glykan merking (NaBH3CN eller 2-picoline borane)31, og andre har blitt optimalisert.
Denne studien presenterer en tidseffektiv glykoengineeringsprotokoll som kombinerer hurtigheten til direkte RNAi med nedstrøms glykomisk analyse. Metodikken er illustrert ved hjelp av Fut8-genet som mål av årsakene som er skissert ovenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

Rekombinante monoklonale antistoffer binder spesifikke molekylære mål og induserer deretter en immunrespons eller hemmer bindingen av andre ligander. Imidlertid kan monoklonal antistofffunksjonalitet og halveringstid reduseres ved type og distribusjon av vertsspesifikk glykosylering. Forsøk på å produsere overlegne antistoffer har inspirert utviklingen av genmodifiserte produsentceller som syntetiserer glykooptimaliserte antistoffer. Glykoengineering krever vanligvis generering av en stabil knockout eller knockin celle linje ved hjelp av metoder som klynger regelmessig interspaced korte palindromic repetisjoner (CRISPR)-assosiert protein 9. Monoklonale antistoffer produsert av konstruerte celler blir deretter karakterisert ved hjelp av massespektrometriske metoder for å avgjøre om ønsket glykoprofil er oppnådd. Denne strategien er tidkrevende, teknisk utfordrende og krever spesialister. Derfor kan en alternativ strategi som benytter strømlinjeformede protokoller for genetisk glykoengineering og glykandeteksjon hjelpe bestrebelser mot optimale antistoffer. I denne konseptgodkjenningsstudien fungerte en IgG-produserende kinesisk hamsterovariecelle som en ideell vert for å optimalisere glykoengineering. Kort forstyrrende RNA rettet mot Fut8-genet ble levert til kinesiske hamsterovarieceller, og de resulterende endringene i FUT8-proteinuttrykket ble kvantifisert. Resultatene indikerer at knockdown med denne metoden var effektiv, noe som førte til en reduksjon på ~ 60% i FUT8. Komplementær analyse av antistoffglykoprofil ble utført ved hjelp av en rask, men svært følsom teknikk: kapillær geleelektroforese og laserindusert fluorescensdeteksjon. Alle knockdown-eksperimenter viste en økning i afukosylerte glykaner; Imidlertid var det største skiftet oppnådd i denne studien ~ 20%. Denne protokollen forenkler glykoengineering innsats ved å utnytte i silico design verktøy, kommersielt syntetisert gen rettet mot reagenser, og rask kvantifisering analyser som ikke krever omfattende tidligere erfaring. Som sådan kan tidseffektiviteten som tilbys av denne protokollen hjelpe undersøkelser av nye genmål.

Vestlig blotanalyse viste redusert FUT8-proteinuttrykk i celler transfektert med en blanding av tre Fut8 DsiRNA-konstruksjoner. I kontrollprøver transfektert med ikke-målrettede DsiRNA, dukket FUT8 opp som et dobbeltbånd på ~ 65 og 70 kDa. Siden den anslåtte molekylvekten til FUT8 er 66 kDa, indikerer en reduksjon i signalintensiteten til det lavere molekylvektbåndet genaktivering. For å bekrefte og kvantifisere genaktivering ble nivået av FUT8-protein normalisert til det relative GAPDH-proteinnivået. Western blot analyse oppdaget to bånd for GAPDH på ~ 37 og 35 kDa. Det høyere molekylvektbåndet tilsvarer den anslåtte proteinstørrelsen og brukes derfor i normaliseringsberegninger. Når det ble normalisert mot GAPDH-proteinnivåer, ble FUT8-proteinuttrykket redusert med opptil 60 % (figur 1).
I tråd med observasjonen av gennedslag ved 48 timers posttransfeksjon ble tilsvarende mAb-prøver behandlet for analyse av CGE-LIF. Glykanstrukturer fra knockdown-celler viste en reduksjon i fukosylering. Denne trenden var mest markert i agalakosylerte strukturer (G0F) og observert i mindre grad i galaktosylerte strukturer (G1F, G1F' og G2F). Fra dette datasettet ble den totale IgG-kjernefukosylering redusert til ~75 %, ned fra ~95 % kjernefukosylering som ble observert for den negative kontrolltilstanden (figur 2). En større reduksjon i kjernefukosylering ble forventet gitt ~60% reduksjon i FUT8 proteinnivåer. Ved refleksjon er det bemerkelsesverdig at glykoprofil representerer glykosylerte mAbs som akkumulerte over en periode på 48 timer siden transfeksjon, mens genaktivering representerer proteinnivåer som bare er tilstede på tidspunktet for høsting.
Videre gransking av denne knockdown-metoden innebar å variere DsiRNA-konsentrasjonen, høsttiden og elektroporasjonsforholdene. Hver faktor ble individuelt undersøkt for å bestemme relevansen. Effekten av elektroporasjonspulsforhold på kjernefukosylering og celle levedyktighet fanges opp i eksperimenter B, C, D og E. Disse resultatene viser en todelt reduksjon i kjernefukosylering fra elektroporasjon ved hjelp av to firkantede bølgepulser (eksperiment C) sammenlignet med en enkelt kvadratisk bølgepuls (eksperiment B), uten signifikante forskjeller i celle levedyktighet (tabell 2). Elektroporasjonstilstand e3 (eksperiment D) førte til den laveste celle levedyktigheten (~ 90%) og IgG-utbyttet på dette tidspunktet. Celler som overlevde elektroporasjonshendelsen ble imidlertid moderat transfektert, noe som fremgår av ~10% reduksjon i kjernefukosylering (tabell 2). Interessant nok brukte eksperiment D elektroporasjonsforhold som ga størst reduksjon i kjernefukosylering (14,7%), men var tydeligvis skadelig for celle levedyktighet (91% -93% levedyktighet). Dette begrensede settet med eksperimenter illustrerer behovet for å bestemme elektroporasjonsinnstillinger som muliggjør tilstrekkelig permeabilisering av cellemembranen uten å forårsake ugjenkallelig skade. Det er også interessant å merke seg rollen som siRNA-konsentrasjon og høsttid på kjernefukosylering. Totalt sett har økende siRNA-konsentrasjon større innflytelse på kjernefukosylering enn å øke høsttiden (Eksperimenter B, F, G versus Eksperimenter A, B, H). I fremtidige eksperimenter ville det være interessant å titrate siRNA-konsentrasjonene levert av elektroporasjonsmetoden e2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> Figur 1. Eksperimentelt flytskjema. Trinnene for glykoengineering og eksempelanalyse vises med den tilknyttede tiden som kreves for hvert trinn. SiRNA-design tar noen timer, avhengig av antall genmål eller konstruksjoner per genmål. CHO celletransfeksjon med siRNA er fullført om noen timer, og transformerte celler blir igjen for å vokse i 48 timer. Cellepellets og supernatanter høstes innen få timer. Cellepellets lyser, og de intracellulære proteinene separeres på en SDS PAGE og deretter blottet og undersøkt med antistoffer mot målgenet. Glykaner er spaltet fra rensede antistoffer og analysert av CGE-LIF. Disse analysene kan kreve 1 dag hver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> Figur 2. Bekreftelse av RNA-interferens. Vestlig flekkdeteksjon av α-1,6-fucosyltransferase (FUT8) proteinnivåer i prøver behandlet med Fut8 eller ikke-målrettende kontroll DsiRNA. Bånd som tilsvarer FUT8 er mer intense i kontroll enn Fut8-knockdown-prøver. GAPDH-proteinnivået ble også vurdert for å normalisere målgenuttrykket. Alle prøver ble tatt fra eksperiment G (se tabell 2). Gjengitt fra Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> Figur 3. Effekten av Fut8-knockdown på kumulativ IgG-glykosylering ved 48 timer. Et skifte i glykandistribusjon oppdages i knockdown-prøver. Spesielt reduseres den relative overfloden av de viktigste kjernefukosylerte strukturene (G0F) mens de afukosylerte artene økes i knockdown-eksperimentet. Målinger ble utført fra eksperiment G-prøver (se tabell 2). Biologiske triplikater utført for hvert eksperiment ble blandet etter høsting for å redusere byrden av nedstrømsanalyse. Gjengitt fra Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Navn på eksperiment</td>
			<td colspan="2">Elektroporasjonsmetode</td>
			<td colspan="2">DsiRNA-konsentrasjon (nΜ)</td>
			<td>Innhøstingstid (h)</td>
			<td>Levedyktighet (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 celler·ml-1)</td>
			<td>IgG-titer (mg· L-1)</td>
			<td colspan="2">Forskjell i kjernefukosylering (%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2. Optimalisering av transfeksjon. Iterative modifikasjoner av elektroporasjonsmetoden, DsiRNA-konsentrasjonen og høsttiden førte til endringer i celle levedyktighet, levedyktig celletetthet, IgG-titer på høsttidspunktet og forskjeller i kjernefukosylering. Hvert eksperiment sammenlignet knockdown og den respektive negative kontrollen for å avgjøre om modifikasjonen gir ønsket effekt (dvs. en reduksjon i fukosylering). Elektroporasjonsinnstillinger var som følger: e1: 1200 V, 0,1 ms, firkantet bølgeform; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s mellom pulser, firkantet bølgeform; e3: 150 V, 20 ms, firkantet bølgeform; e4: 250 V, 500 μF, eksponentiell forfall. Gjengitt fra Kotidis et al. 52.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Glykosyleringsmønsteret til et antistoff bestemmer dens kliniske ytelse, og dermed vedvarer industriell og akademisk innsats for å kontrollere glykosylering. Siden typiske glykoengineeringskampanjer er tids- og arbeidskrevende, vil genereringen av en rask protokoll for å karakterisere effekten av glykosyleringsgener ved hjelp av forbigående silencing være nyttig.

Rask antistoffglykoengineering i kinesiske hamsterovarieceller

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Denne protokollen kan brukes til å screene effekten av flere glykosyleringsenzymer på glykoprofilen til et målprotein og bidra til en bedre forståelse av enzymets funksjonalitet. Protokollens natur tillater screening av glykosyleringsenzymer på en forbigående, men likevel høy gjennomstrømningsmåte. Endrede glykosyleringsprofiler kan føre til forbedrede antistoffaktiviteter, og dermed øke effekten av sluttproduktet.Biofarmasøytiske selskaper overvåker nøye glykosylering som en kritisk kvalitetsattributt. En avvikende glykosylering er et kjennetegn på sykdommer som kreft. Derfor er denne metoden relevant for farmakologisk og biomedisinsk forskning.Protokollen antar at brukerne har erfaring med flere eksperimentelle teknikker, inkludert pattedyrcelletransfeksjon og vestlige flekker. Det er bedre å starte med færre prøver og bruke stoppepunkter i første omgang. Begynn med å vurdere tettheten og levedyktigheten til de kinesiske hamsterovariecellene.Rengjør deretter biosikkerhetsskapet og alt utstyr forsiktig med 70% etanol og en RNase-hemmerløsning for å unngå forurensning. Deretter pellet cellene på 100 ganger G i fem minutter og resuspend dem i et forvarmet medium med en celletetthet på fem ganger 10 til de seks cellene per milliliter. Overfør åtte mikroliter av DsiRNA master mix eller kontroll til en steril elektroporering cuvette.Tilsett 800 mikroliter av cellefjæringen i samme cuvette, bland og lever elektroporasjonspulsen. Overfør deretter cellefjæringen fra cuvette til en brønn av en seksbrønnsplate, og unngå skumlignende materiale. Inkuber cellene i 10 minutter uten å riste.Etter inkubasjon legger du til 800 mikroliter forhåndsvarmede medier for å lage et sluttvolum på 1,6 milliliter per brønn. Utvid de transfekterte cellene i inkubatoren mens du rister ved 150 RPM. Etter 48 timer, høst supernatant og celler.Etter IgG rensing, legge elution A på en tre kilodalton molekylvekt cutoff sentrifugal konsentrator, og sentrifuge på 13, 300 ganger G i 40 til 50 minutter ved fire grader Celsius. Sentrifugering er fullført når restvolumet er lik eller mindre enn 50 mikroliter. Kast gjennomstrømningen og tilsett 500 mikroliter forhåndskjølte 1X PBS for å fortynne resterende supernatant.Sentrifuger prøven igjen ved hjelp av de samme forholdene til 50 mikroliter gjenværende supernatant gjenstår. For å oppnå en 100X fortynning av supernatanten, tilsett 500 mikroliter forhåndskjølt 1X PBS og gjenta sentrifugeringsprosessen. Konsentrer supernatanten til en endelig konsentrasjon på ca. 2,5 gram per liter i 40 mikroliter for å sikre kompatibilitet med glykananalysemetoden.For glykananalyse, overfør 200 mikroliter av den magnetiske perleløsningen til et 2 milliliter PCR-rør. Plasser den på magnetstativet for å skille perlene fra supernatanten og fjern supernatanten forsiktig. Fjern deretter rørene fra det magnetiske stativet og legg til renset proteinprøve og virvel.Deretter legger du til forsynings denatureringsbufferen i prøverøret og inkuberer i åtte minutter ved 60 grader Celsius. Hold prøverørene åpne for optimal reaksjonsytelse. Etter inkubasjon, legg til PNGase F og inkuber i ytterligere 20 minutter ved 60 grader Celsius for å holde glykaner fra de rensede antistoffene.Etter frigjøring av N-glykaner, lukk prøverøret og virvelen. Deretter legger du acetonitril til prøverøret, virvelen og inkuberer ved romtemperatur i ett minutt. Plasser prøverørene i det magnetiske stativet for å skille perlene fra løsningen.Deretter, ved hjelp av en pipette, fjern forsiktig supernatanten uten å berøre perlene. Tilsett den fluoroforholdige glykanetikettløsningen i prøven i en avtrekkshette og bland ved virvel. Etter en 20 minutters inkubasjon ved 60 grader Celsius med åpne lokk, fjern overflødig fargestoff ved å vaske prøven tre ganger i acetonitril.Deretter unngår du de merkede glykanene i dobbeltdestillert vann. Plasser prøverøret i det magnetiske stativet og samle supernatanten beriket med rensede og merkede glykaner. Deretter forbereder og legger du alle nødvendige standarder og prøver i de angitte skuffeposisjonene.Kjør glykananalyseprotokollen og analyser og identifiser glykanene som finnes i eksemplet ved hjelp av riktig programvare. Vestlig blotanalyse viste redusert Fut8 proteinuttrykk i celler transfektert med en blanding av tre Fut8 DsiRNA-konstruksjoner. Glykanstrukturer fra knockdown-cellene viste også redusert fukosylering.Denne trenden var mest markert i agalakosylerte strukturer og observert i mindre grad i galaktosylerte strukturer. En todelt reduksjon i kjernefukosylering ble observert fra elektroporasjon ved hjelp av to kvadratbølgepulser sammenlignet med en enkelt kvadratbølgepuls uten signifikante forskjeller i celle levedyktighet. Totalt sett har økende kortre interferenserende RNA-konsentrasjon en stor forstyrrelse på kjernefukosylering enn å øke høsttiden.Forholdet mellom vann og acetonitril bestemmer om glykaner er i løsning eller en del av perlene. Det er viktig å huske under vasketrinnene for å unngå utilsiktet fjerning av de merkede glykanene fra løsningen. Et oppfølgingseksperiment kan innebære karakterisering av rensede monoklonale antistoffer ved hjelp av cellebaserte analyser for å kvantifisere antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet og komplementavhengig cytotoksisitet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Rask Isolering av Levedyktige sirkulerende tumorceller fra pasient Blodprøver

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Bestilling av enkeltceller og enkelt Embryoet i 3D Confinement: En ny enhet for høyt innhold Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Åpner nye muligheter for Imaging Fysiologisk viktige parametere<em&gt; I Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisere angiogenese av Multiphoton mikroskopi I Vivo i genmodifiserte 3D-PLGA/nHAp stillaset Calvarial kritisk bein defekt reparasjon

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolsk Glycoengineering Sialic syre med N-acyl-endret Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

En rask bildebasert bakteriell virulens analysen bruker Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Prosessoptimalisering ved hjelp av høy gjennomstrømning automatiserte mikrobioreaktorer i kinesisk hamster eggstokk celle dyrking

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...