Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

PK благодарит Департамент химической инженерии Имперского колледжа Лондона за его стипендию. RD благодарит Исследовательский совет По биотехнологии и биологическим наукам Великобритании за его студенчество. MM финансируется Исследовательским советом по биотехнологии и биологическим наукам Великобритании (ссылка на грант: BB/S006206/1). IAG благодарит Ирландский исследовательский совет (стипендия No. GOIPG/2017/1049) и CONACyT (стипендия No 438330).

Авторам нечего раскрывать.

Пути гликозилирования включают сложную метаболическую сеть ферментов и вспомогательных белков. Препарирование функции составляющих путей является сложным, если полагаться только на обычные стратегии нокаута или нокаута генной инженерии. Альтернативный подход заключается в предварительном скрининге членов пути с использованием переходного анализа потери функции. С этой целью были объединены два быстрых протокола, RNAi и обнаружение CGE-LIF, чтобы создать более эффективный способ характеристики генов гликозилирования. Описанный метод требует 5-7 дней для завершения по сравнению с обычными методами, которые потенциально занимают несколько недель для завершения. Кроме того, исследовательские среды с возможностями автоматизации могут использовать этот метод для скрининга большего количества кандидатов генов, чем это возможно при ручном обращении.
Успех переходной гликоинженерной кампании во многом зависит от конструкции siRNA. Пользовательские конструкции DsiRNA должны соответствовать правилам, изложенным ранее, или для простоты пользователи могут выбрать коммерчески доступные предварительно разработанные последовательности. Как и другие стратегии модификации генов, РНКи обладает потенциалом для нецелевых эффектов. Поэтому пользователям рекомендуется оценивать непреднамеренное нацеливание генов вычислительными методами41. Выбор экспериментального дизайна также может помочь ограничить нецелевые эффекты. Kittler et al. показали, что мультиплексированная доставка siRNA приводила к снижению нецелевых эффектов42. Хотя это кажется нелогичным, предполагается, что мастер-микс снижает концентрацию каждой конструкции siRNA, тем самым ограничивая возможность замалчивания генов вне цели. Еще одним преимуществом является то, что одновременная трансфекция структур siRNA, которые нацелены на один и тот же ген, увеличивает вероятность успешного RNAi. Использование мастер-микса также обеспечивает согласованность между образцами и репликами и ускоряет процесс трансфекции. После начального скрининга смешанных конструкций siRNA может быть проведен другой эксперимент с использованием отдельных конструкций для определения эффективности РНКи каждой последовательности. В этом и других нокдаун-исследованиях до трех siRNA были объединены и доставлены в клетки 43,44,45. Тем не менее, может быть желательно провести скрининг более трех siRNA одновременно, чтобы эффективно нацеливаться на один ген или нацеливаться на несколько генов. Действительно, одно исследование продемонстрировало мультиплексированное siRNA-опосредованное глушение до шести генов на уровнях, сопоставимых с глушением отдельных генов46. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для определения максимального количества конструкций siRNA, которые могут быть использованы в бассейне без ущерба для эффективности глушения. Мультиплексная стратегия была предложена Мартином и др. для повышения темпов экспериментов по скринингу библиотеки РНКи46, и аналогичная концепция может оказаться полезной для скрининга генов гликозилирования.
Протокол, описанный в настоящем описании, служит доказательством концепции с расчетом на то, что будут проведены последующие эксперименты для проверки других генов гликозилирования. Новые гены, представляющие интерес, могут быть нехарактеризованными или менее популярными, чем Fut8, а первичные антитела для обнаружения глушения генов могут быть плохими или недоступными. В этом сценарии альтернативные методы, такие как ОТ-ПЦР, могут быть использованы для количественной оценки глушения генов47, но следует отметить, что ОТ-ПЦР обнаруживает мРНК, а не белок. Когда антитела для западного блоттинга доступны, общей проблемой является плохое обнаружение или наличие неспецифических полос. Доступны руководства по устранению неполадок, помогающие пользователям решать распространенные проблемы, и они, как правило, включают в себя ряд решений, таких как первичное титрование антител, альтернативная блокировка и условия обнаружения48,49. В этом исследовании FUT8 неожиданно появился в виде двойной полосы при ~65 и ~70 кДа. Возможно, что диапазон ~70 кДа представляет собой гликозилированный FUT8. Литературные данные из клеточных линий человека описывают O-связанное гликозилирование при Thr 56450,51, участке, который сохраняется у китайского хомяка, и последовательности CHO K1 FUT8.
Как упоминалось ранее, пути гликозилирования часто включают сложный набор ферментов. Текущий протокол был разработан, оптимизирован и продемонстрирован с использованием моногенной реакции гликозилирования, контролируемой Fut8. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для подтверждения надежности этого метода, когда ген-мишень кодирует фермент с альтернативной кинетикой и уровнями экспрессии или путь, регулируемый изоферментами с избыточными функциями.
Взятые вместе, способность быстро заглушать гены и обнаруживать модифицированные гликопрофили IgG является полезным инструментом в усилиях по созданию пользовательских гликоинженерных антител. Результаты аналогичных краткосрочных исследований могут быть применены для создания стабильных гликоинженерных клеток для использования в долгосрочных анализах, таких как культурная культура. Вне фармацевтического контекста этот метод способствует изучению биологии гликана и подчеркивает важную функцию гликанов в развитии, здоровье и болезнях.

N-связанное гликозилирование представляет собой ферментативный процесс, посредством которого олигосахаридные фрагменты ковалентно связаны с остатками Asn. В отличие от синтеза белка de novo, синтез гликана представляет собой нешаблонную реакцию, которая приводит к гетерогенному гликозилированию белков. Структура, состав и распределение гликанов могут влиять на конформацию и функцию белка. Действительно, N-гликозилирование в области кристаллизующегося фрагмента (Fc) иммуноглобулина G (IgG) регулирует терапевтическую эффективность, иммуногенность и период полувыведения антитела1. Таким образом, парадигма качества по дизайну (QbD) для разработки рекомбинантных биотерапевтических белковых продуктов естественным образом идентифицирует гликозилирование как критический атрибут качества (CQA)2,3. Клетки млекопитающих часто являются предпочтительными системами экспрессии, поскольку они по своей природе производят подобные человеку паттерны гликозилирования более тесно, чем бактерии, дрожжи, насекомые или растительные клетки. Кроме того, клетки яичников китайских хомячков (CHO) выбираются по сравнению с другими клеточными линиями млекопитающих, потому что они устойчивы к вирусной инфекции человека, секретируют продукты с высокими титрами и могут быть выращены в культуре суспензии до высокой жизнеспособной плотности клеток4. Что касается образования гликанов, не-CHO мышиные продуцирующие клетки генерируют иммуногенные гликаны (α(1-3)-связанная галактоза [α(1-3)-Gal] и N-гликолилнейраминовая кислота [NeuGc]), которые влияют на безопасное использование моноклональных антител (mAbs)5. Эти преимущества делают клетки CHO передовой системой экспрессии, ответственной за производство более 80% новых биотерапевтических средств в период с 2014 по 2018год 6. Тем не менее, шаблонно-независимое гликозилирование является консервативным механизмом, который приводит к биотерапевтическим средствам, полученным из CHO, с массивом гликоформ.
Стратегии биотерапевтического развития направлены на контроль гетерогенности в клетках CHO с помощью генной инженерии. Некоторые литературные примеры включают нокдаун сиалидаз (Neu1, Neu3)7, нокаут GDP-маннозы 4,6-дегидратазы (GMD)8 и гиперэкспрессию гликозилтрансфераз (GnTIII)9. Достижения в области гликоинженерии возможны благодаря сочетанию общедоступных ресурсов, таких как геном CHO10, и продолжающемуся развитию инструментов генной инженерии, таких как активатор транскрипционно-подобные эффекторные нуклеазы (TALENs), нуклеазы цинкового пальца (ZFN) и кластеризованные регулярно взаимосвязанные короткие палиндромные повторы (CRISPR)-ассоциированный белок 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Эти инструменты обычно доставляются в клетки CHO в виде плазмидной ДНК или в виде очищенных комплексов рибонуклеопротеинов (RNP). И наоборот, РНК-интерференция (РНКи) является технологией генной инженерии, которая в своей простейшей форме требует только доставки очищенных коротких интерферирующих РНК (siRNA) олигонуклеотидов. Эндогенные белки перерабатывают двухцепочечную siRNA в одноцепочечные, а нуклеаза, Индуцированный РНК комплекс глушения (RISC), образует комплекс с siRNA для расщепления целевых последовательностей мРНК 15,16,17. Глушение генов с помощью этого метода является преходящим из-за нестабильности РНК, но исследование здесь использует эту функцию для содействия быстрому скринингу.
Модельный фермент, выбранный для текущего исследования, α1,6-фукозилтрансфераза (FUT8), продуцирует N-гликаны с α-1,6 L-фукозой, связанной с ядром (Fuc). Эта модификация является первичным детерминантом антителозависимой активности цитотоксичности клеток (ADCC), о чем свидетельствуют исследования коммерческих антител. При отсутствии фукозилирования ядра Ритуксимаб (анти-CD20 IgG1) увеличивает ADCC в 50 раз и увеличивает ADCC в Трастузумабе (анти-Her2 IgG1) за счет улучшения связывания FcgRIIIa18,19. Таким образом, фукозилирование ядра считается нежелательной особенностью mAbs, которая оправдывает усилия по обращению вспять этого фенотипа. Существуют примеры успешного нацеливания гена Fut8 с использованием siRNA с сопутствующим увеличением ADCC 20,21,22, хотя эти примеры доставляют Fut8 siRNA, закодированную на плазмидной ДНК. Такие эксперименты генерируют стабильное глушение генов, поскольку плазмидная ДНК служит шаблоном для синтеза siRNA. Это позволяет клеткам пополнять молекулы siRNA, которые разлагаются внутриклеточными РНКазами и фосфатазами. И наоборот, доставка экзогенной синтетической siRNA позволяет только заглушать преходящие гены, поскольку siRNA не может быть восполнена из-за отсутствия внутриклеточного шаблона. Таким образом, пользователям следует подумать о том, совместимы ли экспериментальные конструкции с плазмидной или синтетической siRNA. Например, исследования, ориентированные на пиковое производство mAb, обычно шестой день культуры23,24, могут выбрать синтетическую siRNA, которая может быть доставлена в клетки за несколько дней до пика экспрессии. Преимущества переходного подхода с использованием синтетической siRNA включают возможность аутсорсинга производства и тот факт, что несколько конструкций siRNA могут быть сгенерированы за долю времени, затрачиваемого на генерацию конструкций в плазмидах. Кроме того, синтетическая siRNA эффективна, о чем свидетельствуют литературные примеры глушения гена Fut8, которые достаточны для снижения экспрессии белка FUT825 и получения афукозилированных IgGs с повышенным связыванием FCgRIIAIa и ADCC26.
Успех этого протокола гликоинженерии определялся степенью гликозилирования Fc. Масс-спектрометрия обычно является методом выбора для гликомического анализа; однако электрофорез капиллярного геля и лазерно-индуцированное флуоресцентное обнаружение (CGE-LIF) прекрасно поддаются разрешению гликопрофиля очищенных IgG и имеют преимущество большей быстроты и простоты. Протоколы масс-спектрометрии должны сочетать соответствующие методы хроматографии и дериватизации, источники ионизации и анализаторы массы 27,28,29. В дополнение к требованию квалифицированного специалиста, протоколы масс-спектрометрии являются длинными, а разнообразие методов затрудняет сравнение данных между лабораториями с различными установками. В контексте биофармацевтических препаратов CGE-LIF является чувствительным методом, который может обеспечить достаточную детализацию гликопрофиля антител и легко масштабируется для методов с высокой пропускной способностью. Для низкой численности, очень сложных смесей с плохо охарактеризованными гликопротеинами преимущества масс-спектрометрии могут остаться. Тем не менее, аналитика mAb с высоким разрешением и высокой чувствительностью, предоставляемая анализом N-гликана на основе CGE-LIF, служит обоснованием для испытания этого метода. Кроме того, подготовка и анализ образцов завершаются всего за несколько часов30. Недавние исследования показали, что CGE-LIF можно использовать для мониторинга гликанов, полученных из плазмы человека31, мыши32 и CHO IgGs33. В этих исследованиях подчеркивается использование CGE-LIF для высокопроизводительного анализа проб и небольших объемов образцов.
Метод CGE-LIF имеет ограничения, которые следует учитывать. Стоимость является существенным барьером для использования этого и других устройств для анализа гликана. Однако эти расходы являются типичными в полевых условиях, и CGE-LIF считается экономически эффективным вариантом34. Лаборатории с меньшими бюджетами могут счесть более практичным арендовать оборудование или передать анализ образцов на аутсорсинг. Другим соображением любого аналитического метода является повторяемость. Оценка CGE-LIF проводилась с использованием 48 реплик одного и того же образца, которые были проанализированы в разные дни. Относительное стандартное отклонение на капилляр определяли для интрабатч- и интербэтч-повторяемости. Было обнаружено, что внутрибатч-сравнение реплик имеет относительное стандартное отклонение 6,2%, что указывает на то, что капиллярная производительность не является однородной. Кроме того, сравнение данных interbatch показало относительное стандартное отклонение 15,8% 31, что указывает на то, что производительность капилляров изменяется с течением времени. Выявленные эксплуатационные недостатки могут не применяться в текущем исследовании, в котором используются различные механизмы и запатентованные реагенты. Если пользователи намерены разработать собственный протокол, стоит рассмотреть исследование Ruhaak et al. 31, в котором тщательно оценивались реагенты для CGE-LIF. Таким образом, были оптимизированы реагенты для инъекции образцов (Hi-Di Formamide и DMSO), маркировки гликанов (NaBH3CN или 2-пиколин боран)31 и другие.
В этом исследовании представлен эффективный по времени протокол гликоинженерии, который сочетает в себе скорость прямой РНКИ с последующим гликомическим анализом. Методология проиллюстрирована с использованием гена Fut8 в качестве мишени по причинам, изложенным выше.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

Рекомбинантные моноклональные антитела связывают специфические молекулярные мишени и, впоследствии, индуцируют иммунный ответ или ингибируют связывание других лигандов. Однако функциональность моноклональных антител и период полувыведения могут быть снижены типом и распределением специфического для хозяина гликозилирования. Попытки вырабатывать превосходные антитела вдохновили на разработку генетически модифицированных клеток-продуцентов, которые синтезируют гликооптимизированные антитела. Гликоинженерия обычно требует генерации стабильной нокаутной или нокаутной клеточной линии с использованием таких методов, как кластеризованный регулярно чередующийся короткий палиндромный повтор (CRISPR), ассоциированный белок 9. Моноклональные антитела, продуцируемые инженерными клетками, затем характеризуются с использованием масс-спектрометрических методов, чтобы определить, был ли получен желаемый гликопрофиль. Эта стратегия отнимает много времени, технически сложна и требует специалистов. Таким образом, альтернативная стратегия, которая использует оптимизированные протоколы для генетической гликоинженерии и обнаружения гликанов, может помочь усилиям по достижению оптимальных антител. В этом экспериментальном исследовании клетка яичника китайского хомяка, продуцирующая IgG, служила идеальным хозяином для оптимизации гликоинженерии. Короткая интерферирующая РНК, нацеленная на ген Fut8 , была доставлена в клетки яичников китайского хомяка, и в результате изменения в экспрессии белка FUT8 были количественно определены. Результаты показывают, что нокдаун этим методом был эффективным, что привело к снижению FUT8 на ~ 60%. Комплементарный анализ гликопроли антител проводили с использованием быстрой, но высокочувствительной методики: капиллярного гелевого электрофореза и лазерно-индуцированного флуоресцентного обнаружения. Все эксперименты с нокдауном показали увеличение афукозилированных гликанов; однако наибольший сдвиг, достигнутый в этом исследовании, составил ~ 20%. Этот протокол упрощает усилия по гликоинженерии, используя инструменты проектирования silico , коммерчески синтезированные реагенты, нацеленные на гены, и быстрые количественные анализы, которые не требуют обширного предварительного опыта. Таким образом, эффективность времени, предлагаемая этим протоколом, может помочь исследованиям новых генных мишеней.

Анализ вестерн-блоттинга показал снижение экспрессии белка FUT8 в клетках, трансфектированных смесью трех конструкций Fut8 DsiRNA. В контрольных образцах, трансфектированных нецелевой DsiRNA, FUT8 появился в виде двойной полосы при ~65 и 70 кДа. Поскольку предсказанная молекулярная масса FUT8 составляет 66 кДа, снижение интенсивности сигнала в нижнемолекулярном диапазоне свидетельствует о глушении генов. Для подтверждения и количественной оценки глушения генов уровень белка FUT8 был нормализован до относительного уровня белка GAPDH. Анализ вестерн-блот обнаружил две полосы для GAPDH при ~37 и 35 кДа. Более высокая молекулярно-весовая полоса соответствует прогнозируемому размеру белка и, следовательно, используется в расчетах нормализации. При нормализации по отношению к уровням белка GAPDH экспрессия белка FUT8 снижалась до 60% (рисунок 1).
В соответствии с наблюдением за нокдауном гена через 48 ч после трансфекции, соответствующие образцы mAb были обработаны для анализа CGE-LIF. Гликановые структуры из нокдаун-клеток показали снижение фукозилирования. Эта тенденция была наиболее выражена в агалактозилированных структурах (G0F) и наблюдалась в меньшей степени в галактозилированных структурах (G1F, G1F' и G2F). Из этого набора данных общее фукозилирование ядра IgG снизилось до ~ 75%, по сравнению с ~ 95% фукозилирования ядра, наблюдаемого для отрицательного контрольного состояния (рисунок 2). Ожидалось большее снижение фукозилирования ядра, учитывая снижение уровня белка FUT8 на ~ 60%. При размышлении примечательно, что гликопрофиль представляет собой гликозилированные mAbs, которые накапливались в течение 48 ч с момента трансфекции, в то время как глушение генов представляет собой уровни белка, присутствующие только во время сбора.
Дальнейшее изучение этого метода нокдауна включало изменение концентрации DsiRNA, времени сбора и условий электропорации. Каждый фактор был индивидуально исследован для определения его актуальности. Влияние импульсных состояний электропорации на фукозилирование ядра и жизнеспособность клеток отражено в экспериментах B, C, D и E. Эти результаты демонстрируют двукратное снижение фукозилирования ядра от электропорации с использованием двух импульсов квадратной волны (эксперимент C) по сравнению с одним импульсом квадратной волны (эксперимент B), без существенных различий в жизнеспособности клеток (таблица 2). Состояние электропорации e3 (эксперимент D) привело к самой низкой жизнеспособности клеток (~90%) и выходу IgG в этот момент времени. Однако клетки, пережившие событие электропорации, были умеренно трансфектированы, о чем свидетельствует ~ 10% снижение фукозилирования ядра (таблица 2). Интересно, что в эксперименте D использовались условия электропорации, которые обеспечивали наибольшее снижение фукозилирования ядра (14,7%), но, очевидно, наносили ущерб жизнеспособности клеток (жизнеспособность 91%-93%). Этот ограниченный набор экспериментов иллюстрирует необходимость определения параметров электропорации, которые обеспечивают достаточную проницаемость клеточной мембраны, не вызывая необратимого повреждения. Также интересно отметить роль концентрации siRNA и времени сбора в фукозилировании ядра. В целом, увеличение концентрации siRNA оказывает большее влияние на фукозилирование ядра, чем увеличение времени сбора (эксперименты B, F, G против экспериментов A, B, H). В будущих экспериментах было бы интересно титровать концентрации siRNA, полученные методом электропорации e2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> Рисунок 1. Экспериментальная блок-схема. Этапы гликоинженерии и анализа образцов показаны с соответствующим временем, необходимым для каждого этапа. Проектирование SiRNA занимает несколько часов, в зависимости от количества генных мишеней или конструкций на генную мишень. Трансфекция клеток CHO с siRNA завершается через несколько часов, а трансформированные клетки остаются расти в течение 48 ч. Клеточные гранулы и супернатанты собирают в течение нескольких часов. Клеточные гранулы лизируются, а внутриклеточные белки отделяются на SDS PAGE и впоследствии промокаются и исследуются антителами против гена-мишени. Гликаны расщепляются из очищенных антител и анализируются CGE-LIF. Эти анализы могут потребовать 1 день каждый. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> Рисунок 2. Подтверждение РНК-интерференции. Обнаружение вестерн-блоттинга уровней белка α-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8) в образцах, обработанных Fut8 или нецелевой контрольной DsiRNA. Полосы, соответствующие FUT8, более интенсивны в контроле, чем нокдаун-сэмплы Fut8. Уровень белка GAPDH также оценивали с целью нормализации экспрессии генов-мишеней. Все образцы были взяты из эксперимента G (см. таблицу 2). Перепечатано из Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> Рисунок 3. Влияние нокдауна Fut8 на кумулятивное гликозилирование IgG через 48 ч. Сдвиг в распределении гликанов обнаруживается в нокдаун-образцах. В частности, относительная численность основных ядро-фукозилированных структур (G0F) уменьшается, в то время как афукозилированные виды увеличиваются в эксперименте по нокдауну. Измерения проводились на основе образцов эксперимента G (см. таблицу 2). Биологические трипликаты, выполненные для каждого эксперимента, были смешаны после сбора урожая, чтобы уменьшить бремя последующего анализа. Перепечатано из Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Название эксперимента</td>
			<td colspan="2">Метод электропорации</td>
			<td colspan="2">Концентрация ДсиРНК (нМК)</td>
			<td>Время сбора урожая (ч)</td>
			<td>Жизнеспособность (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 клеток·мл-1)</td>
			<td>Титр IgG (мг· Л-1)</td>
			<td colspan="2">Разница в сердечнике фукозилирования (%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">е2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">е3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">е4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">е1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 2. Оптимизация трансфекции. Итеративные модификации метода электропорации, концентрации DsiRNA и времени сбора привели к изменениям жизнеспособности клеток, жизнеспособной плотности клеток, титру IgG во время сбора и различиям в фукозилировании ядра. Каждый эксперимент сравнивал нокдаун и соответствующий отрицательный контроль, чтобы определить, производит ли модификация желаемый эффект (т.е. снижение фукозилирования). Настройки электропорации были следующими: e1: 1200 В, 0,1 мс, квадратная форма сигнала; e2: 1200 В, 2x 0,1 мс, 5 с между импульсами, квадратная форма сигнала; e3: 150 В, 20 мс, квадратная форма сигнала; e4: 250 В, 500 мкФ, экспоненциальный распад. Перепечатано из Kotidis et al. 52.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Паттерн гликозилирования антитела определяет его клиническую эффективность, поэтому продолжаются промышленные и академические усилия по контролю гликозилирования. Поскольку типичные гликоинженерные кампании являются трудоемкими и трудоемкими, создание быстрого протокола для характеристики воздействия генов гликозилирования с использованием переходного глушения окажется полезным.

Быстрая гликоинженерия антител в клетках яичников китайского хомяка

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Этот протокол может быть использован для скрининга влияния нескольких ферментов гликозилирования на глико-профиль белка-мишени и способствовать лучшему пониманию функциональных возможностей фермента. Характер протокола позволяет проводить скрининг ферментов гликозилирования переходным, но высокопроизводительным способом. Измененные профили гликозилирования могут привести к улучшению активности антител и, следовательно, к повышению эффективности конечного продукта.Биофармацевтические компании внимательно следят за гликозилированием как критическим атрибутом качества. Аберрантное гликозилирование является отличительной чертой таких заболеваний, как рак. Поэтому данный метод актуален для фармакологических и биомедицинских исследований.Протокол предполагает, что пользователи имеют опыт работы с несколькими экспериментальными методами, включая трансфекцию клеток млекопитающих и вестерн-блоты. Лучше начать с меньшего количества образцов и использовать остановочные точки в первую очередь. Начните с оценки плотности и жизнеспособности клеток яичников китайского хомяка.Затем тщательно очистите шкаф биобезопасности и все оборудование 70% этанолом и раствором ингибитора РНКазы, чтобы избежать загрязнения. Затем гранулируют клетки в 100 раз G в течение пяти минут и повторно суспендируют их в предварительно нагретой среде при плотности клеток от пяти раз 10 до шести клеток на миллилитр. Переведите восемь микролитров главной смеси или управления DsiRNA в стерильную электропорационную кювету.Добавьте 800 микролитров клеточной суспензии в ту же кювету, перемешайте и подайте импульс электропорации. Затем перенесите клеточную суспензию из кюветы в одну лунку из шестилуночной пластины, избегая пеноподобного материала. Инкубировать клетки в течение 10 минут без встряхивания.После инкубации добавьте 800 микролитров предварительно нагретой среды, чтобы получить конечный объем 1,6 миллилитра на лунку. Выращивайте трансфектированные клетки в инкубаторе, встряхивая при 150 оборотах в минуту. Через 48 часов собирают супернатант и клетки.После очистки IgG добавьте элюирование A на центробежный концентратор с отсечкой молекулярной массы с тремя килодальтонами и центрифугу в 13, 300 раз G в течение 40-50 минут при четырех градусах Цельсия. Центрифугирование завершается после того, как остаточный объем равен или меньше 50 микролитров. Отбросьте сквозной поток и добавьте 500 микролитров предварительно охлажденного 1X PBS, чтобы разбавить остаточный супернатант.Центрифугирование образца снова с использованием тех же условий до тех пор, пока не останется 50 микролитров остаточного супернатанта. Чтобы получить 100-кратное разбавление супернатанта, добавьте 500 микролитров предварительно охлажденного 1X PBS и повторите процесс центрифугирования. Сконцентрируйте супернатант в конечной концентрации приблизительно 2,5 грамма на литр в 40 микролитрах для обеспечения совместимости с методом анализа гликана.Для анализа гликана переложите 200 микролитров раствора магнитного шарика в 2-миллилитровую ПЦР-трубку. Поместите его на магнитную подставку, чтобы отделить бусины от супернатанта и осторожно удалите супернатант. Затем снимите трубки с магнитного стенда и добавьте очищенный образец белка и вихрь.Затем добавьте буфер денатурации в пробирку и инкубируйте в течение восьми минут при температуре 60 градусов Цельсия. Держите пробки открытыми для оптимальной эффективности реакции. После инкубации добавьте PNGase F и инкубируйте еще 20 минут при 60 градусах Цельсия, чтобы отделить гликаны от очищенных антител.После высвобождения N-гликанов закройте пробу и вихрь. Затем добавьте ацетонитрил в пробирку, вихрь и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты. Поместите пробирки для образцов в магнитную подставку, чтобы отделить шарики от раствора.Затем, используя пипетку, аккуратно удалите супернатант, не касаясь бусин. Добавьте флуорофорсодержащий раствор для маркировки гликана к образцу в вытяжной вытяжке и перемешайте путем вихря. После 20-минутной инкубации при температуре 60 градусов Цельсия с открытыми крышками удалите лишний краситель, промыв образец три раза в ацетонитриле.Затем элюируйте меченые гликаны в дважды дистиллированной воде. Поместите пробирку в магнитный стенд и соберите супернатант, обогащенный очищенными и мечеными гликанами. Затем подготовьте и загрузите все необходимые стандарты и образцы в назначенные положения лотка.Запустите протокол анализа гликана и проанализируйте и идентифицируйте гликаны, присутствующие в образце, с помощью соответствующего программного обеспечения. Анализ вестерн-блоттинга показал снижение экспрессии белка Fut8 в клетках, трансфектированных смесью трех конструкций Fut8 DsiRNA. Гликановые структуры из нокдаун-клеток также показали снижение фукозилирования.Эта тенденция была наиболее выражена в агалактозилированных структурах и наблюдалась в меньшей степени в галактозилированных структурах. Двукратное снижение фукозилирования ядра наблюдалось при электропорации с использованием двух импульсов квадратной волны по сравнению с одним импульсом квадратной волны без существенных различий в жизнеспособности клеток. В целом, увеличение концентрации короткоинтерферирующей РНК оказывает большое вмешательство в фукозилирование ядра, чем увеличение времени сбора.Соотношение между водой и ацетонитрилом определяет, находятся ли гликаны в растворе или в составе шариков. Это важно помнить во время этапов стирки, чтобы избежать случайного удаления меченых гликанов из раствора. Последующий эксперимент может включать характеристику очищенных моноклональных антител с использованием клеточных анализов для количественной оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности и комплементазависимой цитотоксичности.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Разработка пользовательских яичника китайского хомячка, клетки-хозяина белка Анализы использованием Акустические технологии, микрочастицы Мембранные

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Быстрое выделение жизнеспособного циркулирующих опухолевых клеток из образцов крови пациентов

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Заказ отдельных клеток и Single зародышами в 3D конфайнмента: Новое устройство для высокого содержания скрининга

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Быстрое сканирование электронного парамагнитного резонанса открывает новые возможности для обработки изображений Физиологически Важные параметры<em&gt; В Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Визуализация ангиогенеза путем микроскопии Multiphoton In Vivo в генетически модифицированных 3D-PLGA/nHAp эшафот подвздошную критических ремонта дефекта кости

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Метаболизм Glycoengineering, сиаловые кислоты, с помощью N-ацил-изменение Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Быстрое на основе образа бактериальных вирулентности Assay, используя амебы

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Очистка и аналитика моноклонального антитела от китайских яичников хомяка с помощью автоматизированной системы микробиореактора

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Оптимизация процесса с использованием высокой пропускной связи Автоматизированные микро-биореакторы в китайском Хомстер яичников культивирования клеток

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...