Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
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PK agradece al Departamento de Ingeniería Química del Imperial College de Londres por su beca. RD agradece al Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas del Reino Unido por su beca. MM está financiado por el Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas del Reino Unido (Referencia de la subvención: BB/S006206/1). IAG agradece al Consejo Irlandés de Investigación (Beca No. GOIPG/2017/1049) y CONACyT (Beca N° 438330).

Los autores no tienen nada que revelar.

Las vías de glicosilación implican una compleja red metabólica de enzimas y proteínas accesorias. Diseccionar la función de los constituyentes de la vía es desalentador si depende solo de estrategias convencionales de ingeniería genética de knockout o knockin. Un enfoque alternativo es examinar preliminarmente los miembros de una vía utilizando un ensayo transitorio de pérdida de función. Con este fin, se combinaron dos protocolos rápidos, RNAi y detección de CGE-LIF, para crear una forma más eficiente de caracterizar los genes de glicosilación. El método descrito requiere de 5 a 7 días para su finalización en comparación con los métodos convencionales que potencialmente tardan varias semanas en completarse. Además, los entornos de investigación con capacidades de automatización podrían explotar este método para detectar más candidatos genéticos de lo que es posible con el manejo manual.
El éxito de una campaña transitoria de glicoingeniería depende en gran medida del diseño de siRNA. Los diseños personalizados de DsiRNA deben seguir las reglas descritas anteriormente, o para mayor facilidad, los usuarios pueden optar por secuencias prediseñadas disponibles comercialmente. Al igual que otras estrategias de modificación genética, el ARNi tiene el potencial de efectos fuera del objetivo. Por lo tanto, se anima a los usuarios a evaluar la orientación genética no intencional mediante métodos computacionales41. Las opciones de diseño experimental también pueden ayudar a limitar los efectos fuera del objetivo. Kittler et al. mostraron que la entrega multiplexada de siRNA condujo a una reducción en los efectos fuera del objetivo42. Aunque esto parece contradictorio, se sugiere que una mezcla maestra reduce la concentración de cada construcción de siRNA, limitando así la oportunidad de silenciamiento de genes fuera del objetivo. Otro beneficio es que la transfección simultánea de estructuras de siRNA que se dirigen al mismo gen aumenta la probabilidad de arNi exitoso. El uso de una mezcla maestra también garantiza la consistencia entre las muestras y las réplicas y acelera el proceso de transfección. Después de una selección inicial de construcciones mixtas de siRNA, se puede realizar otro experimento utilizando construcciones individuales para determinar la eficiencia del ARNi de cada secuencia. En este y otros estudios de derribo, se han agrupado hasta tres siRNA y se han entregado a las células 43,44,45. Sin embargo, puede ser deseable detectar más de tres siRNA simultáneamente para dirigirse de manera eficiente a un solo gen o para dirigirse a varios genes. De hecho, un estudio demostró el silenciamiento multiplexado mediado por siRNA de hasta seis genes a niveles comparables al silenciamiento de genes individuales46. Sin embargo, se necesitan más estudios para determinar el número máximo de construcciones de siRNA que se pueden utilizar en un grupo sin comprometer la eficiencia de silenciamiento. La estrategia multiplex fue propuesta por Martin et al. para mejorar el ritmo de los experimentos de detección de bibliotecas de ARNi46, y un concepto similar puede resultar útil para detectar genes de glicosilación.
El protocolo descrito en este documento sirve como una prueba de concepto con la expectativa de que se realicen experimentos posteriores para validar otros genes de glicosilación. Los nuevos genes de interés pueden no ser caracterizados o menos populares que Fut8, y los anticuerpos primarios para detectar el silenciamiento génico pueden ser pobres o no estar disponibles. En este escenario, se pueden utilizar métodos alternativos como la RT-PCR para cuantificar el silenciamiento génico47, pero debe tenerse en cuenta que la RT-PCR detecta el ARNm en lugar de la proteína. Cuando los anticuerpos para el western blotting están disponibles, un problema común es la mala detección o la presencia de bandas no específicas. Hay disponibles guías de solución de problemas para ayudar a los usuarios a resolver problemas comunes, y estas tienden a incluir una variedad de soluciones como la titulación primaria de anticuerpos, el bloqueo alternativo y las condiciones de detección48,49. En este estudio, FUT8 apareció inesperadamente como una banda doble a ~ 65 y ~ 70 kDa. Es posible que la banda de ~70 kDa represente FUT8 glicosilado. La evidencia bibliográfica de líneas celulares humanas describe la glicosilación ligada a O en Thr 564 50,51, un sitio que se conserva en las secuencias de hámster chino, y CHO K1 FUT8.
Como se mencionó anteriormente, las vías de glicosilación a menudo involucran una compleja gama de enzimas. El protocolo actual ha sido desarrollado, optimizado y demostrado utilizando una reacción de glicosilación monogénica controlada por Fut8. Por lo tanto, se requieren más estudios para confirmar la robustez de este método cuando el gen objetivo codifica una enzima con cinética y niveles de expresión alternativos o una vía regulada por isoenzimas con funciones redundantes.
En conjunto, la capacidad de silenciar rápidamente los genes y detectar glicoperfiles IgG modificados es una herramienta útil en el esfuerzo hacia anticuerpos glicofenieros personalizados. Los conocimientos de estudios similares a corto plazo se pueden aplicar para generar células de glicoingeniería estables para su uso en ensayos a largo plazo como el cultivo por lotes alimentados. Fuera del contexto farmacéutico, este método contribuye al estudio de la biología de los glicanos y destaca la importante función de los glicanos en el desarrollo, la salud y la enfermedad.

La glicosilación ligada a N es un proceso enzimático por el cual las fracciones de oligosacáridos se unen covalentemente a los residuos de Asn. A diferencia de la síntesis de proteínas de novo, la síntesis de glicanos es una reacción sin plantillas que resulta en una glicosilación heterogénea de las proteínas. La estructura, composición y distribución de los glicanos pueden afectar la conformación y función de las proteínas. De hecho, la N-glicosilación en la región del fragmento cristalizable (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) regula la eficacia terapéutica, la inmunogenicidad y la vida media del anticuerpo1. Como tal, el paradigma de calidad por diseño (QbD) para el desarrollo de productos proteicos bioterapéuticos recombinantes identifica naturalmente la glicosilación como un atributo de calidad crítico (CQA)2,3. Las células de mamíferos son a menudo los sistemas de expresión preferidos, ya que producen inherentemente patrones de glicosilación similares a los humanos más cerca que las bacterias, levaduras, insectos o células vegetales. Además, las células de ovario de hámster chino (CHO) se seleccionan sobre otras líneas celulares de mamíferos porque son resistentes a la infección por virus humanos, secretan productos en títulos altos y se pueden cultivar en cultivo en suspensión a altas densidades celulares viables4. Con respecto a la formación de glicanos, las células de producción murina no CHO generan glicanos inmunogénicos (galactosa ligada a la α(1-3)[α(1-3)-Gal] y ácido N-glicolilneuramínico [NeuGc]) que inciden en el uso seguro de anticuerpos monoclonales (mAbs)5. Estos beneficios convierten a las células CHO en el principal sistema de expresión, responsable de la producción de más del 80% de los nuevos bioterapéuticos entre 2014 y 20186. Sin embargo, la glicosilación independiente de la plantilla es un mecanismo conservado que conduce a la bioterapéutica derivada de CHO con una serie de glicoformas.
Las estrategias de desarrollo bioterapéutico tienen como objetivo controlar la heterogeneidad en las células CHO mediante ingeniería genética. Algunos ejemplos de literatura incluyen la eliminación de sialidasas (Neu1, Neu3)7, GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD) knockout8, y la sobreexpresión de glicosiltransferasas (GnTIII)9. Los avances en la glicoingeniería son posibles gracias a una combinación de recursos disponibles públicamente, como el genoma CHO10, y el desarrollo continuo de herramientas de ingeniería genética, como las nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) y la proteína 9 asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR)11,12,13,14 . Estas herramientas generalmente se administran a las células CHO como ADN plásmido o como complejos de ribonucleoproteína purificada (RNP). Por el contrario, la interferencia de ARN (ARNi) es una tecnología de ingeniería genética que, en su forma más simple, solo requiere la entrega de oligonucleótidos de ARN interferente corto (siRNA) purificados. Las proteínas endógenas procesan el siRNA de doble cadena en hebras simples, y la nucleasa, el complejo silenciador inducido por ARN (RISC), forma un complejo con siRNA para escindir secuencias de ARNm objetivo 15,16,17. El silenciamiento de genes a través de este método es transitorio debido a la inestabilidad del ARN, pero la investigación aquí aprovecha esta característica para ayudar a la detección rápida.
La enzima modelo seleccionada para el estudio actual, la α1,6-fucosiltransferasa (FUT8), produce N-glicanos con L-fucosa ligada al núcleo α-1,6 (Fuc). Esta modificación es un determinante primario de la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), como lo demuestran los estudios de anticuerpos comerciales. En ausencia de fucosilación central, Rituximab (anti-CD20 IgG1) aumenta ADCC 50 veces y aumenta ADCC en Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) al mejorar la unión a FcgRIIIa18,19. Por lo tanto, la fucosilación del núcleo se considera una característica indeseable de los mAbs que justifica los esfuerzos para revertir este fenotipo. Hay ejemplos de dianas exitosas del gen Fut8 utilizando siRNA con aumentos concomitantes en ADCC 20,21,22, aunque estos ejemplos entregan siRNA Fut8 codificado en ADN plásmido. Tales experimentos generan silenciamiento génico estable, ya que el ADN plásmido sirve como plantilla para la síntesis de siRNA. Esto permite a las células reponer las moléculas de siRNA que son degradadas por las RNasas intracelulares y las fosfatasas. Por el contrario, la entrega de siRNA sintético exógeno solo permite el silenciamiento génico transitorio, ya que el siRNA no se puede reponer debido a la falta de una plantilla intracelular. Por lo tanto, los usuarios deben considerar si los diseños experimentales son compatibles con el siRNA sintético o derivado de plásmidos. Por ejemplo, los estudios centrados en el pico de producción de mAb, típicamente el sexto día del cultivo23,24, pueden optar por siRNA sintético que se puede administrar a las células unos días antes de la expresión máxima. Los beneficios de un enfoque transitorio que utiliza siRNA sintético incluyen la capacidad de externalizar la producción y el hecho de que se pueden generar múltiples construcciones de siRNA en una fracción del tiempo necesario para generar construcciones en plásmidos. Además, el siRNA sintético es eficaz, como lo demuestran los ejemplos bibliográficos de silenciamiento del gen Fut8 que son suficientes para reducir la expresión de la proteína FUT825 y producir IgGs afucosiladas con mayor unión a FCgRIIIa y ADCC26.
El éxito de este protocolo de gliconingeniería fue determinado por el grado de glicosilación Fc. La espectrometría de masas es normalmente el método de elección para los análisis glucómicos; sin embargo, la electroforesis capilar en gel y la detección de fluorescencia inducida por láser (CGE-LIF) son perfectamente susceptibles de resolver el glicoperfil de igG purificados y tienen la ventaja de una mayor rapidez y simplicidad. Los protocolos de espectrometría de masas deben combinar los métodos cromatográficos y de derivatización adecuados, las fuentes de ionización y los analizadores de masas 27,28,29. Además de requerir un especialista capacitado, los protocolos de espectrometría de masas son largos y la diversidad de métodos hace que los datos sean difíciles de comparar entre laboratorios con diferentes configuraciones. En el contexto de los productos biofarmacéuticos, CGE-LIF es un método sensible que puede proporcionar suficientes detalles de un glicoperfil de anticuerpos y es fácilmente escalable para métodos de alto rendimiento. Para mezclas de baja abundancia y altamente complejas con glicoproteínas mal caracterizadas, las ventajas de la espectrometría de masas podrían permanecer. Sin embargo, el análisis de mAb de alta resolución y alta sensibilidad que ofrece el análisis de N-glicano basado en CGE-LIF sirve como justificación para probar este método. Además, la preparación y el análisis de la muestra se completan en solo unas pocas horas30. Estudios recientes han demostrado que CGE-LIF se puede utilizar para monitorear glicanos derivados de plasma humano31, ratón32 y CHO IgGs33. Estos estudios destacan el uso de CGE-LIF para el análisis de muestras de alto rendimiento y pequeños volúmenes de muestras.
El método CGE-LIF tiene limitaciones que deben tenerse en cuenta. El costo es una barrera significativa para el uso de este y otros dispositivos para el análisis de glicanos. Sin embargo, estos costos son típicos dentro del campo, y se cree que CGE-LIF es una opción rentable34. Los laboratorios con presupuestos más pequeños pueden encontrar más práctico arrendar maquinaria o subcontratar el análisis de muestras. Otra consideración de cualquier método analítico es la repetibilidad. La evaluación de CGE-LIF se realizó utilizando 48 réplicas de la misma muestra que se ensayaron en diferentes días. La desviación estándar relativa por capilar se determinó para la repetibilidad intrabatch e interbatch. Se encontró que la comparación intrabatch de réplicas tenía una desviación estándar relativa de 6.2%, lo que indica que el rendimiento capilar no es uniforme. Además, una comparación de los datos de entrelazado mostró una desviación estándar relativa del 15,8%31, lo que indica que el rendimiento capilar cambia con el tiempo. Las deficiencias operativas identificadas pueden no aplicarse en el presente estudio, que utiliza diferentes maquinarias y reactivos patentados. Si los usuarios tienen la intención de desarrollar un protocolo interno, valdría la pena considerar el estudio de Ruhaak et al. 31, que evaluó cuidadosamente los reactivos para CGE-LIF. Como tal, se han optimizado los reactivos para inyección de muestra (Hi-Di Formamida y DMSO), etiquetado de glicanos (NaBH3CN o 2 picoline borane)31 y otros.
Este estudio presenta un protocolo de glicoingeniería eficiente en el tiempo que combina la rapidez del ARNi directo con el análisis glucómico aguas abajo. La metodología se ilustra utilizando el gen Fut8 como objetivo por las razones descritas anteriormente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

Los anticuerpos monoclonales recombinantes se unen a dianas moleculares específicas y, posteriormente, inducen una respuesta inmune o inhiben la unión de otros ligandos. Sin embargo, la funcionalidad de los anticuerpos monoclonales y la vida media pueden verse reducidas por el tipo y la distribución de la glicosilación específica del huésped. Los intentos de producir anticuerpos superiores han inspirado el desarrollo de células productoras modificadas genéticamente que sintetizan anticuerpos glicooptimizados. La glicoingeniería generalmente requiere la generación de una línea celular estable de knockout o knockin utilizando métodos como la proteína 9 asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR). Los anticuerpos monoclonales producidos por células modificadas se caracterizan utilizando métodos espectrométricos de masas para determinar si se ha obtenido el glicoperfil deseado. Esta estrategia requiere mucho tiempo, es técnicamente desafiante y requiere especialistas. Por lo tanto, una estrategia alternativa que utilice protocolos simplificados para la glicoingeniería genética y la detección de glicanos puede ayudar a los esfuerzos hacia anticuerpos óptimos. En este estudio de prueba de concepto, una célula de ovario de hámster chino productora de IgG sirvió como un huésped ideal para optimizar la glucoingeniería. El ARN de interferencia corta dirigido al gen Fut8 se entregó a las células de ovario de hámster chino, y se cuantificaron los cambios resultantes en la expresión de la proteína FUT8. Los resultados indican que el derribo por este método fue eficiente, lo que llevó a una reducción de ~ 60% en FUT8. El análisis complementario del glicoperfil de anticuerpos se realizó mediante una técnica rápida pero altamente sensible: electroforesis capilar en gel y detección de fluorescencia inducida por láser. Todos los experimentos de derribo mostraron un aumento en los glicanos afucosilados; sin embargo, el mayor cambio logrado en este estudio fue de ~ 20%. Este protocolo simplifica los esfuerzos de glicoingeniería al aprovechar las herramientas de diseño in silico , los reactivos dirigidos a genes sintetizados comercialmente y los ensayos de cuantificación rápida que no requieren una amplia experiencia previa. Como tal, las eficiencias de tiempo ofrecidas por este protocolo pueden ayudar a las investigaciones sobre nuevos objetivos genéticos.

El análisis de Western blot mostró una reducción de la expresión de la proteína FUT8 en células transfectadas con una mezcla de tres construcciones de DsiRNA Fut8 . En muestras de control transfectadas con DsiRNA no dirigido, FUT8 apareció como una doble banda a ~ 65 y 70 kDa. Dado que el peso molecular previsto de FUT8 es de 66 kDa, una reducción en la intensidad de la señal de la banda de menor peso molecular es indicativa de silenciamiento génico. Para confirmar y cuantificar el silenciamiento génico, el nivel de proteína FUT8 se normalizó al nivel relativo de proteína GAPDH. El análisis de Western blot detectó dos bandas para GAPDH a ~37 y 35 kDa. La banda de mayor peso molecular corresponde al tamaño de proteína predicho y, por lo tanto, se utiliza en los cálculos de normalización. Cuando se normalizó contra los niveles de proteína GAPDH, la expresión de la proteína FUT8 se redujo hasta en un 60% (Figura 1).
En línea con la observación de la eliminación de genes a las 48 h después de la transfección, las muestras de mAb correspondientes se procesaron para su análisis por CGE-LIF. Las estructuras de glicanos de las células de derribo mostraron una disminución en la fucosilación. Esta tendencia fue más pronunciada en estructuras agalactosiladas (G0F) y observada en menor medida en estructuras galactosiladas (G1F, G1F' y G2F). A partir de este conjunto de datos, la fucosilación total del núcleo igG disminuyó a ~ 75%, por debajo de ~ 95% de fucosilación del núcleo observada para la condición de control negativa (Figura 2). Se anticipó una mayor reducción en la fucosilación del núcleo dada la disminución de ~ 60% en los niveles de proteína FUT8. Tras la reflexión, cabe destacar que el glicoperfil representa mAbs glicosilados que se acumularon durante un período de 48 h desde la transfección, mientras que el silenciamiento génico representa los niveles de proteína presentes solo en el momento de la recolección.
Un mayor escrutinio de este método de derribo implicó variar la concentración de DsiRNA, el tiempo de cosecha y las condiciones de electroporación. Cada factor fue sondeado individualmente para determinar su relevancia. El impacto de las condiciones de pulso de electroporación en la fucosilación del núcleo y la viabilidad celular se captura en los experimentos B, C, D y E. Estos resultados demuestran una reducción de dos veces en la fucosilación del núcleo por electroporación utilizando dos pulsos de onda cuadrada (Experimento C) en comparación con un solo pulso de onda cuadrada (Experimento B), sin diferencias significativas en la viabilidad celular (Tabla 2). La condición de electroporación e3 (Experimento D) condujo a la viabilidad de celda más baja (~ 90%) y al rendimiento de IgG en este punto de tiempo. Sin embargo, las células que sobrevivieron al evento de electroporación fueron moderadamente transfectadas, como lo demuestra la disminución de ~ 10% en la fucosilación del núcleo (Tabla 2). Curiosamente, el Experimento D utilizó condiciones de electroporación que proporcionaron la mayor reducción en la fucosilación del núcleo (14,7%), pero fueron evidentemente perjudiciales para la viabilidad celular (91% -93% de viabilidad). Este conjunto limitado de experimentos ilustra la necesidad de determinar los ajustes de electroporación que permitan una permeabilización suficiente de la membrana celular sin causar daños irrevocables. También es interesante observar el papel de la concentración de siRNA y el tiempo de cosecha en la fucosilación del núcleo. En general, el aumento de la concentración de siRNA tiene una mayor influencia en la fucosilación del núcleo que el aumento del tiempo de cosecha (Experimentos B, F, G versus Experimentos A, B, H). En futuros experimentos, sería interesante valorar las concentraciones de siRNA entregadas por el método de electroporación e2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> Figura 1. Diagrama de flujo experimental. Los pasos de glicoingeniería y análisis de muestras se representan con el tiempo asociado requerido para cada paso. El diseño de SiRNA toma unas pocas horas, dependiendo del número de objetivos o construcciones de genes por objetivo genético. La transfección de células CHO con siRNA se completa en unas pocas horas, y las células transformadas se dejan crecer durante 48 h. Los gránulos celulares y los sobrenadantes se cosechan en unas pocas horas. Los gránulos celulares se lisan, y las proteínas intracelulares se separan en un SDS PAGE y posteriormente se borran y se sondean con anticuerpos contra el gen objetivo. Los glicanos se separan de los anticuerpos purificados y se analizan por CGE-LIF. Estos ensayos pueden requerir 1 día cada uno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> Figura 2. Confirmación de la interferencia de ARN. Detección de Western blot de los niveles de proteína α-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) en muestras tratadas con Fut8 o DsiRNA de control no dirigido. Las bandas correspondientes a FUT8 son más intensas en control que las muestras de derribo de Fut8. También se evaluó el nivel de proteína GAPDH para normalizar la expresión génica objetivo. Todas las muestras fueron tomadas del Experimento G (ver Tabla 2). Reimpreso de Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> Figura 3. Efecto del knockdown de Fut8 sobre la glicosilación acumulativa de IgG a las 48 h. Se detecta un cambio en la distribución de glicanos en las muestras de derribo. En particular, la abundancia relativa de las principales estructuras fucosiladas del núcleo (G0F) se reduce mientras que las especies afucosiladas aumentan en el experimento de derribo. Las mediciones se realizaron a partir de muestras del Experimento G (ver Tabla 2). Los triplicatos biológicos realizados para cada experimento se mezclaron después de la cosecha para reducir la carga del análisis aguas abajo. Reimpreso de Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Nombre del experimento</td>
			<td colspan="2">Método de electroporación</td>
			<td colspan="2">Concentración de DsiRNA (nΜ)</td>
			<td>Tiempo de cosecha (h)</td>
			<td>Viabilidad (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 células·mL-1)</td>
			<td>Título de IgG (mg· L-1)</td>
			<td colspan="2">Diferencia en la fucosilación del núcleo (%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2. Optimización de la transfección. Las modificaciones iterativas del método de electroporación, la concentración de DsiRNA y el tiempo de cosecha condujeron a cambios en la viabilidad celular, la densidad celular viable, el título de IgG en el momento de la cosecha y las diferencias en la fucosilación del núcleo. Cada experimento comparó el derribo y el control negativo respectivo para determinar si la modificación produce el efecto deseado (es decir, una disminución en la fucosilación). Los ajustes de electroporación fueron los siguientes: e1: 1200 V, 0,1 ms, forma de onda cuadrada; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s entre pulsos, forma de onda cuadrada; e3: 150 V, 20 ms, forma de onda cuadrada; e4: 250 V, 500 μF, decaimiento exponencial. Reimpreso de Kotidis et al. 52.

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Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

El patrón de glicosilación de un anticuerpo determina su rendimiento clínico, por lo que persisten los esfuerzos industriales y académicos para controlar la glicosilación. Dado que las campañas típicas de glicoingeniería requieren mucho tiempo y mano de obra, la generación de un protocolo rápido para caracterizar el impacto de los genes de glicosilación utilizando silenciamiento transitorio resultaría útil.

Glicoingeniería rápida de anticuerpos en células de ovario de hámster chino

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Este protocolo se puede utilizar para detectar el efecto de múltiples enzimas de glicosilación en el perfil glicosilado de una proteína objetivo y contribuir a una mejor comprensión de las funcionalidades de la enzima. La naturaleza del protocolo permite el cribado de enzimas de glicosilación de una manera transitoria, pero de alto rendimiento. Los perfiles de glicosilación alterados pueden conducir a una mejora de las actividades de anticuerpos y, por lo tanto, aumentar la eficacia del producto final.Las compañías biofarmacéuticas monitorean de cerca la glicosilación como un atributo crítico de calidad. Una glicosilación aberrante es un sello distintivo de enfermedades como el cáncer. Por lo tanto, este método es relevante para la investigación farmacológica y biomédica.El protocolo asume que los usuarios tienen experiencia en varias técnicas experimentales, incluida la transfección de células de mamíferos y Western blots. Es mejor comenzar con menos muestras y usar puntos de parada en primera instancia. Comience por evaluar la densidad y la viabilidad de las células de ovario de hámster chino.Luego, limpie cuidadosamente el gabinete de bioseguridad y todo el equipo con etanol al 70% y una solución inhibidora de la RNasa para evitar la contaminación. A continuación, peletizar las células a 100 veces G durante cinco minutos y volver a suspenderlas en un medio precalentado a una densidad celular de cinco veces 10 a las seis células por mililitro. Transfiera ocho microlitros de la mezcla maestra de DsiRNA o control a una cubeta de electroporación estéril.Agregue 800 microlitros de la suspensión de la celda a la misma cubeta, mezcle y entregue el pulso de electroporación. Luego, transfiera la suspensión celular de la cubeta a un pocillo de una placa de seis pocillos, evitando el material similar a la espuma. Incubar las células durante 10 minutos sin agitar.Después de la incubación, agregue 800 microlitros de medios precalentados para hacer un volumen final de 1.6 mililitros por pozo. Cultive las células transfectadas en la incubadora mientras agita a 150 RPM. Después de 48 horas, cosecha el sobrenadante y las células.Después de la purificación de IgG, agregue la elución A a un concentrador centrífugo de corte de peso molecular de tres kilodalton y centrífique a 13, 300 veces G durante 40 a 50 minutos a cuatro grados Celsius. La centrifugación se completa una vez que el volumen residual es igual o inferior a 50 microlitros. Deseche el flujo continuo y agregue 500 microlitros de PBS 1X preenfriado para diluir el sobrenadante residual.Centrifugar la muestra de nuevo utilizando las mismas condiciones hasta que queden 50 microlitros de sobrenadante residual. Para obtener una dilución de 100X del sobrenadante, agregue 500 microlitros de PBS 1X preenfriado y repita el proceso de centrifugación. Concentre el sobrenadante en una concentración final de aproximadamente 2,5 gramos por litro en 40 microlitros para garantizar la compatibilidad con el método de análisis de glicanos.Para el análisis de glicanos, transfiera 200 microlitros de la solución de perla magnética a un tubo de PCR de 2 mililitros. Colóquelo en el soporte magnético para separar las cuentas del sobrenadante y retire el sobrenadante con cuidado. Luego, retire los tubos del soporte magnético y agregue la muestra de proteína purificada y el vórtice.A continuación, agregue el tampón de desnaturalización de suministro al tubo de muestra e incube durante ocho minutos a 60 grados centígrados. Mantenga los tubos de muestra abiertos para un rendimiento de reacción óptimo. Después de la incubación, agregue PNGase F e incube durante otros 20 minutos a 60 grados Celsius para separar los glicanos de los anticuerpos purificados.Después de la liberación de N-glicanos, cierre el tubo de muestra y el vórtice. Luego, agregue acetonitrilo al tubo de muestra, vórtice e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Coloque los tubos de muestra en el soporte magnético para separar las perlas de la solución.Luego, usando una pipeta, retire cuidadosamente el sobrenadante sin tocar las cuentas. Agregue la solución de etiquetado de glicanos que contiene fluoróforo a la muestra en una campana extractora de humos y mezcle mediante vórtice. Después de una incubación de 20 minutos a 60 grados centígrados con tapas abiertas, retire el exceso de tinte lavando la muestra tres veces en acetonitrilo.Luego, eluya los glicanos etiquetados en agua de doble destilación. Coloque el tubo de muestra en el soporte magnético y recoja el sobrenadante enriquecido con glicanos purificados y etiquetados. A continuación, prepare y cargue todos los estándares y muestras requeridos en las posiciones de bandeja designadas.Ejecute el protocolo de análisis de glicanos y analice e identifique los glicanos presentes en la muestra utilizando el software adecuado. El análisis de Western blot mostró una reducción de la expresión de la proteína Fut8 en células transfectadas con una mezcla de tres construcciones de DsiRNA Fut8. Las estructuras de glicanos de las células de derribo también mostraron una disminución de la fucosilación.Esta tendencia fue más pronunciada en estructuras agalactosiladas y observada en menor medida en estructuras galactosiladas. Se observó una reducción de dos veces en la fucosilación del núcleo a partir de la electroporación utilizando dos pulsos de onda cuadrada en comparación con un solo pulso de onda cuadrada sin diferencias significativas en la viabilidad celular. En general, el aumento de la concentración de ARN de interferencia corta tiene una gran interferencia en la fucosilación del núcleo que el aumento del tiempo de cosecha.La relación entre el agua y el acetonitrilo determina si los glicanos están en solución o son parte de las perlas. Eso es crucial recordar durante los pasos de lavado para evitar la eliminación accidental de los glicanos etiquetados de la solución. Un experimento de seguimiento podría implicar la caracterización de anticuerpos monoclonales purificados utilizando ensayos basados en células para cuantificar la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos y la citotoxicidad dependiente del complemento.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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