Name: rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

PK tackar Institutionen för kemiteknik, Imperial College London, för hans stipendium. RD tackar Storbritanniens forskningsråd för bioteknik och biologiska vetenskaper för hans studentskap. MM finansieras av U.K. Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Bidragsreferens: BB/S006206/1). IAG tackar Irish Research Council (stipendium nr. GOIPG/2017/1049) och CONACyT (stipendium nr 438330).

1. DsiRNA-design och rekonstituering
<ol><li>Använd Safari, Firefox eller Microsoft Edge för att komma åt IDT-webbplatsen (https://eu.idtdna.com). På startsidan väljer du fliken Produkter och tjänster följt av RNA-interferens. Om du vill generera anpassade dicer-substrat (DsiRNA) -konstruktioner som riktar sig mot Fut8-genen väljer du Designverktyg följt av fliken Generera anpassat DsiRNA .<ol>
<li>Ange Fut8-anslutningsnumret eller ange gensekvensen manuellt för att börja. I denna studie erhölls de föreslagna Fut8-sekvenserna från både "CHO-K1" och "Chinese Hamster" -poster från https://chogenome.org och användes för att generera DsiRNA. De flesta gener har flera transkriptvarianter, och det är viktigt att verifiera att DsiRNA skulle vara aktivt på alla rapporterade varianter i den aktuella enheten.</li>
		<li>Välj alternativet för att utföra en "Manuell BLAST" -sökning eftersom CHO-cellgenomet för närvarande inte är tillgängligt som ett "referensgenom" på IDT-webbplatsen. Detta steg söker efter matchningar mellan anpassade DsiRNA-sekvenser och genomet av intresse.</li>
		<li>Klicka på Sök för att generera DsiRNA-sekvenser.</li>
		<li>I sin tur bedöma specificiteten för varje DsiRNA med hjälp av funktionen "Manuell BLAST" med skatte-id: 10029 (CHO-cellinjer och kinesisk hamster). Resultat för frågetäckning indikerar att DsiRNA-konstruktioner matchar Fut8 (inklusive Fut8-transkriptvarianter ) vid 100%, medan komplementaritet mot oavsiktliga mål är ≤76%35.</li>
		<li>Kontrollera att DsiRNA specifikt riktar sig till Fut8 för att säkerställa att GC-innehållet är mellan 30% -50%. Ett lågt GC-innehåll är förknippat med svag och ospecifik bindning, medan ett högt GC-innehåll hämmar siRNA-avveckling och laddning i RISC-komplexet36.</li>
		<li>Välj tre DsiRNA för användning i transfektionsstudier (tabell 1), var och en inriktad på en annan plats för Fut8-genen . Köp ett fördesignat icke-riktat eller krypterat DsiRNA från IDT för kontrollexperiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vid ankomsten centrifugerar du DsiRNA vid 13 300 x g i 1 min till pellet innan röret öppnas. Rekonstituera varje frystorkat DsiRNA i nukleasfri duplexbuffert (tillhandahållen av IDT) till en 100 μM stamlösning. Tillsätt till exempel 20 μl buffert till 2 nmol DsiRNA för att erhålla ett 100 μM lager.<ol>
<li>För att säkerställa tillräcklig blandning, inkubera stamlösningarna vid rumstemperatur i 30 minuter medan du skakar försiktigt på en orbitalskakare (50 rpm, 16 mm omloppsbana).</li>
		<li>Skapa en huvudblandning genom att kombinera 20 μL av varje DsiRNA-konstruktion som riktar sig mot Fut8 (100 μM av varje DsiRNA). Förbered alikvoter och förvara vid −20 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>DsiRNA-mål</td>
			<td colspan="3">Sekvens</td>
			<td>Gc (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Struktur A</td>
			<td colspan="3">5'GAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUACC 3'</td>
			<td rowspan="2">36%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">5' GGUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUCUC 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Struktur B</td>
			<td colspan="3">5' AGAAUGAGAAUGGAUGUUUUUCCTT 3'</td>
			<td rowspan="2">32%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">5' AAGGAAAAACAUCCAUUCUCAUUCUGA 3'</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Struktur C</td>
			<td colspan="3">5' AGAGAAGAUAGAAACAGUCAAAUAC 3'</td>
			<td rowspan="2">32%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">5' GUAUUUGACUGUUUCUAUCUUCUCUCG 3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. DsiRNA-sekvenser som används för Fut8-knockdown. Sekvenser genererade av IDT som riktar sig mot Fut8 i kinesiska hamster- och CHO K1-cellgenom. Sense- och antisense-sekvenserna för varje konstruktion visas (respektive) och GC-innehållet i varje struktur visas. Omtryckt från Kotidis et al. 52.
2. DsiRNA-transfektion
<ol><li>Återuppliva CHO-celler som uttrycker en IgG monoklonal antikropp37 med användning av odlingsförhållanden som är lämpliga för cellinjen av intresse. OBS: Cellerna som användes i denna studie genererades med hjälp av glutaminsyntetas (GS) -systemet, där endogen GS hämmas av L-metioninsulfoximin (MSX) för att förbättra urvalet av sällsynta högproducerande kloner. Använd därför endast MSX om det krävs av den valda cellinjen.<ol>
<li>Tina upp en injektionsflaska med celler i 2-3 minuter i ett vattenbad inställt på 37 °C. Rengör injektionsflaskans utsida med 70% (v/v) etanol och fortsätt allt arbete i ett klass II biosäkerhetsskåp.</li>
		<li>Överför cellsuspensionen till ett 15 ml centrifugrör som innehåller 9 ml förvärmt medium som är lämpligt för den valda cellinjen. Pelletera cellerna genom centrifugering vid 100 x g i 5 min.</li>
		<li>Ta försiktigt bort och kassera mediet utan att störa cellpelleten. Resuspendera sedan cellpelleten i 10 ml förvärmt medium och ta en alikvot för räkning.</li>
		<li>Färga cellerna med Trypan blå om du räknar med en hemocytometer, eller en lämplig fläck för att skilja levande / döda celler när du använder en automatiserad cellräknare.</li>
		<li>Efter någon av uppräkningsmetoderna överför en lämplig volym cellsuspension till en 125 ml Erlenmeyer-skakkolv med en viabel celltäthet på 3 x 105 celler·ml-1 i 30 ml medium (med valfritt tillskott på 50 μM MSX).</li>
		<li>Överför celler till en inkubator inställd på 36,5 °C, 5%CO2 och placera på en skakningsplattform vid 150 rpm (16 mm omloppsbana).</li>
		<li>Passageceller var 3-4: e dag med en sådddensitet på 2 x 105 celler · ml-1 och en arbetsvolym på 50 ml i en 250 ml Erlenmeyer-skakkolv. Om du använder MSX, avbryta tillskott efter den första passagen.</li>
		<li>Passageceller 2x förutom upptining.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfektion<ol>
<li>Bedöm celldensiteten och se till att cellviabiliteten är större än 90%.</li>
		<li>Rengör noggrant biosäkerhetsskåpet och all utrustning med 70% (v / v) etanol och en RNase-hämmare för att undvika kontaminering.</li>
		<li>Pelletsceller vid 100 x g i 5 min och återsuspenderas i förvärmt medium till en livskraftig celltäthet på 5 x 106 celler·ml-1.</li>
		<li>Överför 8 μL (motsvarande 1 μM) av DsiRNA-masterblandningen eller kontrollen till en steril (0,4 cm) elektroporationskuvett. Överför sedan 800 μL av cellsuspensionen (motsvarande 4 x 106 celler) till samma kyvett och se till att båda komponenterna blandas.</li>
		<li>Leverera följande pulsförhållanden: 1200 V, 0,1 ms, kvadratisk vågform.</li>
		<li>Överför cellsuspensionen från kyvetten till en brunn på en 6-brunnsplatta, var noga med att undvika skumliknande material. Återvinn cellerna i inkubatorn (36,5 °C, 5 % CO2) utan att skaka i 10 minuter.</li>
		<li>Tillsätt 800 μL förvärmda medier för att göra en slutlig volym på 1,6 ml per brunn och återför de transfekterade cellerna till inkubatorn för tillväxt (36,5 ° C, 5% CO2) medan du skakar vid 150 rpm (16 mm omloppsbana).</li>
		<li>Skörda supernatanterna och cellerna vid 48 h efter transfektion. Stopppunkt: Cellodlingssupnatanten kan hållas vid -20 °C; Det är dock tillrådligt att celllys bör utföras omedelbart efter cellpelletsuppsamling för att undvika proteinnedbrytning. Supernatanter används i steg 3, steg 4 och steg 5, medan cellpellets används i steg 6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IgG-kvantifiering och rening
<ol><li>Mät IgG-koncentrationen med hjälp av biolagerinterferometri eller annan valfri metod.<ol>
<li>Hydratprotein En biosensor spetsar i provutspädningsmedel i 10-30 min. Under tiden överför cellsuspensioner till 15 ml centrifugrör och pelletsceller vid 100 x g i 5 minuter eller avlägsna celler genom filtrering genom ett 0,45 μm nitrocellulosafilter.</li>
		<li>Utan att störa pelleten, överför försiktigt den isolerade supernatanten som innehåller IgG till ett rent centrifugrör.</li>
		<li>Använd följande inställningar för biolagerinterferometri: skakhastighet, 2200 rpm; körtid, 60 s. Dessa parametrar kommer att användas för att mäta alla prover och kontroller.</li>
		<li>När biosensorspetsarna är hydratiserade, skapa en standardkurva med en IgG-standard (4 μL av varje koncentration).</li>
		<li>Kvantifiera provkoncentrationerna genom att ladda 4 μl av cellsupernatanten. Rengör apparaten med luddfria våtservetter mellan varje prov.</li>
		<li>Länka standardkurvan till de okända proverna för att interpolera bindningshastigheten för de okända proverna. Spara data och exportera som en csv- eller PDF-fil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG-rening<ol>
<li>Förbered elueringsbuffert innehållande 0,2 M glycin (pH 2,5) och sterilisera genom att passera genom ett 0,22 μm filter.</li>
		<li>Filtrera 1 ml av den isolerade supernatanten vid rumstemperatur med 0,22 μm mikrocentrifugfilterrör tills hela supernatanten strömmar igenom.</li>
		<li>Pellet 150-200 μL protein A-agarospärlor i 1,5 ml centrifugrör vid 100 x g i 3 min och kassera supernatanten. Tvätta sedan protein A-pärlorna med 150-200 μl cellodlingsmedium och upprepa centrifugering. Kassera supernatanten.</li>
		<li>Återsuspendera de ekvilibrerade protein A-pärlorna med 1 ml av de beredda supernatanterna från steg 3.2.3. och ladda i ett 1 ml polypropenrör. Fäst polypropylenröret på en roterande mixer (15 mm omloppsbana) och snurra vid 30 rpm i 60-90 min vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.</li>
		<li>När inkubationen är klar, samla upp genomströmningen och tvätta pärlorna med 1 ml 1x PBS för att avlägsna eventuella obundna proteiner. Samla tvättfraktionen också.</li>
		<li>Eluera IgG från protein A-pärlorna genom att tillsätta 3 ml elueringsbuffert till polypropenkolonnen. Samla sekventiella fraktioner som dränerar från kolonnen (500 μL vardera) till märkta rör.</li>
		<li>Valfritt: Om den renade antikroppen ska förvaras, neutralisera elueringsbufferten genom att tillsätta 25 μL 1 M Tris pH 9,5. Hoppa över detta steg om antikroppen kommer att behandlas omedelbart via buffertutbyte etc. OBS: Alla delar av reningen (genomströmning, tvättar och alla elueringsfraktioner) bör hållas och se till att målproteinet inte går förlorat. Dessa prover kan också hjälpa till under felsökning om reningen inte lyckas.</li>
		<li>Använd den första elueringen (eluering A) för bearbetning nedströms men behåll alla andra fraktioner om de skulle behövas i framtiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Buffertutbyte och provkoncentration
<ol><li>Byt IgG elueringsbuffert mot 1x PBS.<ol>
<li>Ladda eluering A på en 3 kDa molekylviktsavgränsad centrifugalkoncentrator. Se tillverkarens guide när du väljer en lämplig MWCO-kolumn. I detta experiment säkerställer en mindre porstorlek maximal retention av utsöndrat protein men ökar också centrifugeringstiden.</li>
		<li>Centrifugera vid 13 300 x g i 40–50 min vid 4 °C. Centrifugeringen är klar när restvolymen är lika med eller mindre än 50 μl.</li>
		<li>Kassera genomströmningen och tillsätt 500 μL försprutad (4 °C) 1x PBS för att späda ut den återstående supernatanten. Centrifugera provet igen under samma förhållanden (13 300 x g i 40–50 min vid 4 °C) tills 50 μl kvarvarande supernatant återstår.</li>
		<li>Tillsätt 500 μl försprutad (4 °C) 1x PBS för att späda ut den återstående supernatanten och upprepa centrifugeringsprocessen igen för att erhålla en 100x utspädning av supernatanten.</li>
		<li>Koncentrera supernatanten till en slutlig koncentration av ~2,5 g· L-1 i 40 μl eller mindre för att säkerställa kompatibilitet med glykananalysmetoden. OBS: 100 μg måste laddas för glykananalys. Stopppunkt: Den koncentrerade IgG (i 1x PBS) kan lagras vid −20 °C och tinas före glykananalys.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Glykananalys
<ol><li>Utför glykananalys med kapillärgelelektrofores enligt tillverkarens instruktioner.<ol>
<li>Överför 200 μL av den magnetiska pärllösningen till ett 0,2 ml PCR-rör och placera på magnetstället för att separera pärlorna från supernatanten.</li>
		<li>Ta försiktigt bort supernatanten och ta bort rören från magnetstället. Tillsätt det renade proteinprovet och virveln för att säkerställa fullständig blandning.</li>
		<li>Tillsätt denatureringsbuffert (medföljer) till provröret och inkubera i 8 minuter vid 60 °C. Håll provrören öppna för optimal reaktionsprestanda.</li>
		<li>Tillsätt PNGase F (500 enheter per prov) och inkubera i 20 min vid 60 °C för att klyva glykaner från de renade antikropparna.</li>
		<li>Efter frisättning av N-glykaner, stäng provröret och virveln. Tillsätt acetonitril, virvel och inkubera vid rumstemperatur i 1 min.</li>
		<li>Placera provrören i magnetstativet för att separera pärlorna från lösningen. Använd en pipett för att försiktigt ta bort supernatanten utan att röra pärlorna.</li>
		<li>I en dragskåp, tillsätt glykanmärkningslösningen som innehåller en fluorofor till provet. Virvel för att säkerställa tillräcklig blandning och inkubera vid 60 °C i 20 min (öppna lock).</li>
		<li>Tvätta provet 3x i acetonitril för att avlägsna överflödigt färgämne. Elue sedan de märkta glykanerna i DDI-vatten (medföljer).</li>
		<li>Placera provröret i magnetstativet för att separera pärlorna från supernatanten som innehåller renade och märkta glykaner.</li>
		<li>Förbered och ladda glukosstegestandarden, fäststandarderna och proverna i de angivna fackpositionerna. Kör glykananalysprotokollet.</li>
		<li>Använd lämplig programvara för att analysera och identifiera de glykaner som finns i provet. OBS: Se till att temperaturen i värmeblocket är korrekt för effektiv inkubation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Västra fläcken
<ol><li>Kvantifiera knockdown-effektivitet med hjälp av western blot-analys med en anti-α-1,6-fukosyltransferas-antikropp. Polyakrylamidgeler och buffertrecept finns tillgängliga från kommersiella leverantörer38,39.<ol>
<li>Vid 48 h efter transfektion, räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare och bestäm volymen av cellsuspension motsvarande 5 x 106 celler.</li>
		<li>Överför lämplig volym cellsuspension från varje experimentellt tillstånd till ett sterilt 1,5 ml centrifugrör och pellet vid 13 200 x g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten.</li>
		<li>Lysa cellerna med 200 μl lysbuffert (lämplig för extraktion av proteiner från däggdjursceller) innehållande 1% v/v proteashämmarecocktail vid rumstemperatur i 10 min. Skaka blandningen försiktigt under inkubation (50 rpm, 16 mm omlopp).</li>
		<li>För att avlägsna cellresterna, centrifugera lysaten vid 13 200 x g i 10 minuter och överför sedan den rensade lysaten till ett sterilt 1,5 ml rör.</li>
		<li>Mät proteinkoncentrationen för varje lysat med hjälp av en spektrofotometer vid 280 nm. Därefter bereda alikvoter av varje prov justerat för att ha samma proteinkoncentration.</li>
		<li>Denaturera proteinproverna genom inkubation vid 100 °C i 10–15 minuter i DTT-SDS-provladdningsfärgämne. den slutliga färgkoncentrationen är 1x.</li>
		<li>Ladda 15 μL av de denaturerade proverna och 5 μL förspänd proteinstege i en SDS-PAGE-gel med 12,5% upplösande gel för effektiv separation. Kör proverna vid 25 mA per gel i 90 min eller tills färgämnesfronten når slutet av gelén.</li>
		<li>Ta försiktigt bort gelén från kassetten och inkubera i 1x överföringsbuffert som innehåller metanol.</li>
		<li>Förbered våtöverföringssystemet och aktivera ett PVDF-membran med metanol. Montera gelén och PVDF-membranet för våt överföring, placera ett isblock i överföringstanken och sänk ner hela tanken i is för att säkerställa att överföringsförhållandena förblir kalla. Kör på 350 mA/100 V i 60 min.</li>
		<li>Blockera membranet genom att inkubera i en blockerande lösning i 30 minuter vid rumstemperatur medan du skakar försiktigt på en orbitalskakare vid 50 rpm (16 mm omloppsbana).</li>
		<li>Skölj membranet med sterilt vatten i 5 minuter och upprepa. Använd sedan en ren skalpell för att försiktigt skära membranet horisontellt vid ~ 50 kDa, med den synliga proteinstegen som vägledning.</li>
		<li>Inkubera membranet som hyser proteiner större än 50 kDa med anti-α-1,6-fukosyltransferasantikropp vid 1:1000 i en antikroppsutspädningsbuffert. Inkubera membranet med immobiliserade proteiner mindre än 50 kDa med anti-GAPDH vid 1:10 000 i spädningsbuffert. Membran kan inkuberas i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.</li>
		<li>Tvätta membranen i 5 min (x3) och inkubera sedan med en lämplig sekundär antikropp i minst 30 minuter vid rumstemperatur.</li>
		<li>Utför 3x tvättar med en tvättbuffert i 5 min, följt av 3x tvättar med vatten. Utveckla sedan membranet med ett kromogent substrat (eller lämpligt detektionsreagens) tills band uppträder (1-60 min).</li>
		<li>Skölj membranet 2x med vatten och låt det torka. Ta en bild av membranet och utför densitometrisk analys40.</li>
		<li>För att beräkna det relativa proteinuttrycket i varje prov, beräkna först förhållandet mellan GAPDH-signalen i prover. Detta är normaliseringsfaktorn för varje prov som korrigerar för avvikelser i provbelastningen. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63872/63872eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		<li>Dela FUT8-signalintensiteten (för varje körfält) med normaliseringsfaktorn för motsvarande körfält för att erhålla det relativa FUT8-proteinuttrycket. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63872/63872eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Glykosyleringsvägar involverar ett komplext metaboliskt nätverk av enzymer och tillbehörsproteiner. Att dissekera funktionen hos vägbeståndsdelar är skrämmande om man är beroende av konventionella knockout- eller knockingenteknikstrategier ensam. Ett alternativt tillvägagångssätt är att preliminärt screena medlemmar av en väg med hjälp av en övergående funktionsnedsättningsanalys. För detta ändamål kombinerades två snabba protokoll, RNAi och CGE-LIF-detektion, för att skapa ett mer effektivt sätt att karakterisera glykosyleringsgener. Den beskrivna metoden kräver 5-7 dagar för slutförande jämfört med konventionella metoder som potentiellt tar flera veckor för slutförande. Vidare kan forskningsmiljöer med automatiseringskapacitet utnyttja denna metod för att screena fler genkandidater än vad som är möjligt med manuell hantering.
Framgången för en övergående glykoengineeringskampanj är till stor del beroende av siRNA-designen. Anpassade DsiRNA-mönster måste följa de regler som tidigare beskrivits, eller för enkelhetens skull kan användare välja kommersiellt tillgängliga fördesignade sekvenser. Liksom andra genmodifieringsstrategier har RNAi potential för off-target effekter. Därför uppmuntras användare att bedöma oavsiktlig geninriktning med beräkningsmetoder41. Experimentella designval kan också hjälpa till att begränsa effekter utanför målet. visade att den multiplexerade leveransen av siRNA ledde till en minskning av off-target effekter42. Även om detta verkar kontraintuitivt, föreslås det att en masterblandning minskar koncentrationen av varje siRNA-konstruktion, vilket begränsar möjligheten till off-target gendämpning. En ytterligare fördel är att samtidig transfektion av siRNA-strukturer som riktar sig mot samma gen ökar sannolikheten för framgångsrik RNAi. Användningen av en mastermix säkerställer också konsistens mellan prover och replikat och påskyndar transfektionsprocessen. Efter en inledande skärm av blandade siRNA-konstruktioner kan ett annat experiment utföras med hjälp av enskilda konstruktioner för att fastställa RNAi-effektiviteten för varje sekvens. I denna och andra knockdown-studier har upp till tre siRNA slagits samman och levererats till cellerna 43,44,45. Det kan dock vara önskvärt att screena mer än tre siRNA samtidigt för att effektivt rikta in sig på en enda gen eller för att rikta in sig på flera gener. Faktum är att en studie visade multiplexerad siRNA-medierad tystnad av upp till sex gener på nivåer som är jämförbara med tystnaden av enskilda gener46. Ytterligare studier behövs dock för att bestämma det maximala antalet siRNA-konstruktioner som kan användas i en pool utan att kompromissa med ljuddämpningseffektiviteten. Multiplexstrategin föreslogs av Martin m.fl. för att öka takten i RNAi-biblioteksscreeningsexperiment46, och ett liknande koncept kan visa sig vara användbart för att screena glykosyleringsgener.
Protokollet som beskrivs häri fungerar som ett bevis på konceptet med förväntan att efterföljande experiment kommer att utföras för att validera andra glykosyleringsgener. Nya gener av intresse kan vara okarakteriserade eller mindre populära än Fut8, och primära antikroppar för att upptäcka gendämpning kan vara dåliga eller otillgängliga. I detta scenario kan alternativa metoder som RT-PCR användas för att kvantifiera gendämpning47, men det bör noteras att RT-PCR detekterar mRNA snarare än protein. När antikroppar för western blotting är tillgängliga är ett vanligt problem dålig detektion eller närvaron av icke-specifika band. Felsökningsguider för att hjälpa användare att lösa vanliga problem finns tillgängliga, och dessa tenderar att innehålla en rad lösningar som primär antikroppstitrering, alternativ blockering och detekteringsvillkor48,49. I denna studie uppträdde FUT8 oväntat som ett dubbelband på ~65 och ~70 kDa. Det är möjligt att ~70 kDa-bandet representerar glykosylerad FUT8. Litteraturbevis från mänskliga cellinjer beskriver O-länkad glykosylering vid Thr 564 50,51, en plats som bevaras i kinesisk hamster och CHO K1 FUT8-sekvenser.
Som tidigare nämnts involverar glykosyleringsvägar ofta en komplex uppsättning enzymer. Det nuvarande protokollet har utvecklats, optimerats och demonstrerats med hjälp av en monogen glykosyleringsreaktion kontrollerad av Fut8. Därför krävs ytterligare studier för att bekräfta robustheten hos denna metod när målgenen kodar för ett enzym med alternativa kinetik- och uttrycksnivåer eller en väg som regleras av isoenzymer med redundanta funktioner.
Sammantaget är förmågan att snabbt tysta gener och detektera modifierade IgG-glykoprofiler ett användbart verktyg i arbetet mot anpassade glykoengineererade antikroppar. Insikter från liknande korttidsstudier kan tillämpas för att generera stabila glykoengineered celler för användning i långsiktiga analyser som fed-batch-odling. Utanför det farmaceutiska sammanhanget bidrar denna metod till studien av glykanbiologi och belyser glykanernas viktiga funktion i utveckling, hälsa och sjukdom.

N-länkad glykosylering är en enzymatisk process genom vilken oligosackariddelar är kovalent kopplade till Asn-rester. Till skillnad från de novo-proteinsyntes är glykansyntes en icke-mallad reaktion som resulterar i heterogen glykosylering av proteiner. Strukturen, sammansättningen och fördelningen av glykaner kan påverka proteinkonformation och funktion. Faktum är att N-glykosylering i det kristallifierbara fragmentet (Fc) av immunoglobulin G (IgG) reglerar den terapeutiska effekten, immunogeniciteten och halveringstiden för antikroppen1. Som sådan identifierar QbD-paradigmet (quality by design) för utveckling av rekombinanta bioterapeutiska proteinprodukter naturligt glykosylering som ett kritiskt kvalitetsattribut (CQA)2,3. Däggdjursceller är ofta de föredragna uttryckssystemen eftersom de i sig producerar människoliknande glykosyleringsmönster närmare än bakterier, jäst, insekter eller växtceller. Dessutom väljs kinesiska hamsteräggstocksceller (CHO) över andra däggdjurscellinjer eftersom de är resistenta mot human virusinfektion, utsöndrar produkter vid höga titrar och kan odlas i suspensionskultur till höga livskraftiga celltätheter4. När det gäller glykanbildning genererar icke-CHO-murinproduktionsceller immunogena glykaner (α(1-3)-länkad galaktos [α(1-3)-Gal] och N-glykolylneuraminsyra [NeuGc]) som påverkar säker användning av monoklonala antikroppar (mAbs)5. Dessa fördelar gör CHO-celler till det främsta uttryckssystemet, som ansvarar för produktionen av över 80% av nya bioterapeutiska medel mellan 2014 och 20186. Malloberoende glykosylering är emellertid en bevarad mekanism som leder till CHO-härledd bioterapeutik med en rad glykoformer.
Bioterapeutiska utvecklingsstrategier syftar till att kontrollera heterogenitet i CHO-celler genom genteknik. Några litteraturexempel inkluderar knockdown av sialidaser (Neu1, Neu3)7, BNP-mannos 4,6-dehydratas (GMD) knockout8 och överuttryck av glykosyltransferaser (GnTIII)9. Framsteg inom glykoengineering är möjliga på grund av en kombination av offentligt tillgängliga resurser, som CHO-genomet10, och den pågående utvecklingen av gentekniska verktyg, såsom transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser (TALEN), zinkfingernukleaser (ZFNs) och grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitioner (CRISPR) -associerade protein 9 (CRISPR-Cas9) 11,12,13,14 . Dessa verktyg levereras vanligtvis till CHO-celler som plasmid-DNA eller som renade ribonukleoprotein (RNP) -komplex. Omvänt är RNA-interferens (RNAi) en genteknik som i sin enklaste form endast kräver leverans av renade kortstörande RNA (siRNA) oligonukleotider. Endogena proteiner bearbetar dubbelsträngat siRNA till enkla strängar, och nukleaset, RNA-inducerat ljuddämpningskomplex (RISC), bildar ett komplex med siRNA för att klyva mål-mRNA-sekvenser 15,16,17. Gendämpning via denna metod är övergående på grund av RNA-instabilitet, men undersökningen här utnyttjar denna funktion för att underlätta snabb screening.
Modellenzymet som valts ut för den aktuella studien, α1,6-fukosyltransferas (FUT8), producerar N-glykaner med α-1,6 kärnbunden L-fukos (Fuc). Denna modifiering är en primär determinant för antikroppsberoende cellcytotoxicitet (ADCC) aktivitet, vilket framgår av studier av kommersiella antikroppar. I avsaknad av kärnfukosylering ökar Rituximab (anti-CD20 IgG1) ADCC 50 gånger och ökar ADCC i Trastuzumab (anti-Her2 IgG1) genom att förbättra FcgRIIIa-bindningen18,19. Kärnfukosylering anses således vara en oönskad egenskap hos mAbs som motiverar ansträngningar för att vända denna fenotyp. Det finns exempel på framgångsrik Fut8-geninriktning med siRNA med samtidiga ökningar av ADCC 20,21,22, även om dessa exempel levererar Fut8 siRNA kodat på plasmid-DNA. Sådana experiment genererar stabil gendämpning eftersom plasmid-DNA fungerar som en mall för siRNA-syntes. Detta gör det möjligt för celler att fylla på siRNA-molekyler som bryts ned av intracellulära RNaser och fosfataser. Omvänt tillåter leveransen av exogent syntetiskt siRNA endast övergående gendämpning eftersom siRNA inte kan fyllas på på grund av bristen på en intracellulär mall. Således bör användare överväga om experimentella mönster är kompatibla med plasmid-härledd eller syntetisk siRNA. Till exempel kan studier som fokuserar på topp mAb-produktion, vanligtvis dag sex i kulturen23,24, välja syntetiskt siRNA som kan levereras till celler några dagar före topputtryck. Fördelarna med ett övergående tillvägagångssätt med syntetiskt siRNA inkluderar förmågan att outsourca produktion och det faktum att flera siRNA-konstruktioner kan genereras på en bråkdel av den tid det tar att generera konstruktioner i plasmider. Dessutom är syntetiskt siRNA effektivt, vilket framgår av litteraturexempel på Fut8-gendämpning som är tillräckliga för att minska FUT8-proteinuttryck25 och ge afukosylerade IgG med ökad FCgRIIIa-bindning och ADCC26.
Framgången för detta glykoengineeringsprotokoll bestämdes av graden av Fc-glykosylering. Masspektrometri är normalt den metod som valts för glykomiska analyser; kapillärgelelektrofores och laserinducerad fluorescensdetektering (CGE-LIF) är emellertid helt mottaglig för att lösa glykoprofilen för renade IgG och har fördelen av större snabbhet och enkelhet. Masspektrometriprotokoll måste kombinera lämpliga kromatografiska och derivatiseringsmetoder, joniseringskällor och massanalysatorer 27,28,29. Förutom att kräva en utbildad specialist är masspektrometriprotokoll långa, och mångfalden av metoder gör data svåra att jämföra mellan laboratorier med olika inställningar. I samband med biologiska läkemedel är CGE-LIF en känslig metod som kan ge tillräckliga detaljer om en antikroppsglykoprofil och är lätt skalbar för metoder med hög genomströmning. För låg överflöd, mycket komplexa blandningar med dåligt karakteriserade glykoproteiner, kan fördelarna med masspektrometri kvarstå. Den högupplösta och högkänsliga mAb-analysen som erbjuds av CGE-LIF-baserad N-glykananalys fungerar dock som en motivering för att testa denna metod. Dessutom är provberedning och analys klar på bara några timmar30. Nya studier har visat att CGE-LIF kan användas för att övervaka glykaner härrörande från human plasma31, mus32 och CHO IgG33. Dessa studier belyser användningen av CGE-LIF för provanalys med hög genomströmning och små provvolymer.
CGE-LIF-metoden har begränsningar som bör beaktas. Kostnaden är ett betydande hinder för användningen av denna och andra anordningar för glykananalys. Dessa kostnader är dock typiska inom området, och CGE-LIF anses vara ett kostnadseffektivt alternativ34. Laboratorier med mindre budgetar kan tycka att det är mer praktiskt att hyra maskiner eller lägga ut provanalys. En annan övervägande av någon analytisk metod är repeterbarhet. Utvärdering av CGE-LIF utfördes med hjälp av 48 replikat av samma prov som analyserades på olika dagar. Den relativa standardavvikelsen per kapillär bestämdes för intrabatch och interbatch repeterbarhet. Intrabatchjämförelsen av replikat visade sig ha en relativ standardavvikelse på 6,2 %, vilket indikerar att kapillärprestandan inte är enhetlig. Vidare visade en jämförelse av interbatchdata en relativ standardavvikelse på 15,8%31, vilket indikerar att kapillärprestandan förändras över tiden. De identifierade operativa bristerna kanske inte är tillämpliga i den aktuella studien, som använder olika maskiner och proprietära reagenser. Om användare tänker utveckla ett internt protokoll skulle det vara värt att överväga studien av Ruhaak et al. 31, som noggrant utvärderade reagenserna för CGE-LIF. Som sådan har reagenserna för provinjektion (Hi-Di Formamid och DMSO), glykanmärkning (NaBH3CN eller 2-picolinboran)31 och andra optimerats.
Denna studie presenterar ett tidseffektivt glykoengineeringsprotokoll som kombinerar snabbheten hos direkt RNAi med nedströms glykomisk analys. Metoden illustreras med Fut8-genen som måltavla av de skäl som beskrivs ovan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32 Karat software</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Software for glycan data acquisition and analysis using the Fast Glycan analysis protocol and separation method.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-FUT8 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab198741</td>
			<td>Rabbit polycloncal to Fut8. Use this antibody to quantify Fut8 protein expression; replace this antibody if using siRNA targeting a different gene.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab181602</td>
			<td>Rabbit monoclonal to GAPDH. Alternative housekeeping genes exist and might be preferred by the user.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDrop Spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>80 3006 55</td>
			<td>Instrument used to quantify protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLItz</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>45 5000</td>
			<td>Instrument. Label-Free Protein Analysis System.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Haemocytometer</td>
			<td>Sigma Alrich</td>
			<td>BR717810</td>
			<td>Counting chamber device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary cartridge</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>A55625</td>
			<td>Pre-assembled capillary cartridge with window (30 cm total length, 375 &#181;m outer diameter (o.d), x 50 &#181;m inner diameter (i.d).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C100HT Glycan analysis&#8212;capillary electrophoresis</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Capillary gel electrophoresis instrument, the CESI 8000 Plus instrument is now used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD CHO Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10743029</td>
			<td>Replace this with a culture medium appropriate for the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>188261</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>227270</td>
			<td>Sterile polypropylene tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO IgG</td>
			<td>MedImmune</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Chinese Hamster Ovary cells expressing an IgG monoclonal antibody (CHO T127). Created using the GS system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>1x PBS, without calcium or magnesium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 125 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431143</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks with Vent Cap, 250 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431144</td>
			<td>Replace this with a culture vessel suitable for growing the cell line of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Glycan Labelling and Analysis kit</td>
			<td>SCIEX</td>
			<td>B94499PTO</td>
			<td>Labels N-glycans with APTS and then uses a magnetic-bead based clean up system to remove excess APTS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fut8 DsiRNA</td>
			<td>IDT</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Custom designed DsiRNA targetting Fut8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser cuvettes, 0.4 cm</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652088</td>
			<td>Electroporation cuvette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Eukaryotic System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165 2661</td>
			<td>Insturment. Xcell main unit with Capacitance Extender (CE) Mocdule and ShockPod.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF&#160; membrane</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Immunoblot transfer membrane, low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Methionine sulfoximine (MSX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5379</td>
			<td>Only necessary for CHO cell lines using the glutamine synthetase (GS) selection system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10623111</td>
			<td>Low-lint, high absorbency and chemically inert wipes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78505</td>
			<td>Alternative lysis buffers such as RIPA are also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10365710</td>
			<td>Solvent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>616201</td>
			<td>Autoclavable tubes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658035FC</td>
			<td>Instrument. 4-gel capacity, for 1.0 mm thick handcast gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac HC Power Supply.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NC-Slide A8</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>942 0003</td>
			<td>8-chamber slide for use with NucleoCounter NC 250.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control DsiRNA, 5 nmol</td>
			<td>IDT</td>
			<td>51 01 14 04</td>
			<td>Non-targeting DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free duplex buffer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>11-01-03-01</td>
			<td>Reconstitution buffer for DsiRNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoCounter NC-250</td>
			<td>Chemometec</td>
			<td>contact manufacturer</td>
			<td>Instrument. Automated Cell Analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page-Ruler ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>Mixed blue, orange and green protein standards for SDS PAGE and western blotting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>608281</td>
			<td>Autoclavable tubes for DsiRNA aliqouts and glycan preparation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filter tips sterilised&#160; (10, 200, 1000 &#181;L)</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>F171203, F171503, F171703</td>
			<td>Sterile filter tips to avoid RNA contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNGase F enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0704S</td>
			<td>Enzymatic cleavage of glycans from glycoproteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene columns, 1 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>34924</td>
			<td>Columns for gravity-flow chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8340</td>
			<td>Inhibition of serine, cysteine, aspartic proteases and aminopeptidases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A Agarose Beads</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>16 125</td>
			<td>For purification of human, mouse and rabbit immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-A biosensor</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 5010</td>
			<td>Tips functionalised with Protein A for rapid antibody quantification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td>Removes RNAse contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample dilutent</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18 1104</td>
			<td>Activate Protein A tips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets (5, 10, 25 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487, 4488, 4489</td>
			<td>Used for sterile cell culture tecniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cyanoborohydride solution 1 M in THF</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>296813</td>
			<td>Reducing agent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution 18</td>
			<td>ChemoMetec</td>
			<td>910-3018</td>
			<td>Staining reagent containing acridine orange (AO) and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td>&#160;0.22 &#181;m pore, Cellulose Acetate membrane.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension plate with lid, 6-well</td>
			<td>Greiner Bio</td>
			<td>657 185</td>
			<td>Hydrophobic culture plate for growth of suspension cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters,&#160; 0.22 &#956;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>514 7011</td>
			<td>Surfactant-free cellulose acetate (SFCA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes with Luer lock tip, 20 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10569215</td>
			<td>For secure connection with syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Stains dead and dying cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500, 3,000 MWCO</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0191</td>
			<td>Polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>WB7105</td>
			<td>Western blot detection kit, alternative blocking buffers and antibody diluents can be made by the user using recipes available online.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid antibody glycoengineering in chinese hamster ovary cells

Rekombinanta monoklonala antikroppar binder specifika molekylära mål och inducerar därefter ett immunsvar eller hämmar bindningen av andra ligander. Monoklonal antikroppsfunktionalitet och halveringstid kan dock minskas genom typ och fördelning av värdspecifik glykosylering. Försök att producera överlägsna antikroppar har inspirerat utvecklingen av genetiskt modifierade producentceller som syntetiserar glykooptimerade antikroppar. Glykoengineering kräver vanligtvis generering av en stabil knockout- eller knockincelllinje med hjälp av metoder som grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitioner (CRISPR) -associerat protein 9. Monoklonala antikroppar framställda av konstruerade celler karakteriseras sedan med användning av masspektrometriska metoder för att bestämma om den önskade glykoprofilen har erhållits. Denna strategi är tidskrävande, tekniskt utmanande och kräver specialister. Därför kan en alternativ strategi som använder strömlinjeformade protokoll för genetisk glykoengineering och glykandetektering hjälpa strävanden mot optimala antikroppar. I denna proof-of-concept-studie fungerade en IgG-producerande kinesisk hamsteräggcell som en idealisk värd för att optimera glykoengineering. Kort störande RNA riktat mot Fut8-genen levererades till kinesiska hamsteräggceller, och de resulterande förändringarna i FUT8-proteinuttryck kvantifierades. Resultaten indikerar att knockdown med denna metod var effektiv, vilket ledde till en minskning av FUT8 med ~ 60%. Kompletterande analys av antikroppsglykoprofilen utfördes med hjälp av en snabb men ändå mycket känslig teknik: kapillärgelelektrofores och laserinducerad fluorescensdetektering. Alla knockdown-experiment visade en ökning av afukosylerade glykaner; den största förändringen som uppnåddes i denna studie var dock ~ 20%. Detta protokoll förenklar glykoengineeringsinsatser genom att utnyttja silico-designverktyg , kommersiellt syntetiserade geninriktningsreagenser och snabba kvantifieringsanalyser som inte kräver omfattande tidigare erfarenhet. Som sådan kan de tidseffektiviteter som erbjuds av detta protokoll hjälpa till med undersökningar av nya genmål.

Western blot-analys visade minskat FUT8-proteinuttryck i celler transfekterade med en blandning av tre Fut8 DsiRNA-konstruktioner. I kontrollprover transfekterade med icke-riktat DsiRNA uppträdde FUT8 som ett dubbelband vid ~ 65 och 70 kDa. Eftersom den förutsagda molekylvikten för FUT8 är 66 kDa, är en minskning av signalintensiteten hos det lägre molekylviktsbandet ett tecken på gendämpning. För att bekräfta och kvantifiera gendämpning normaliserades nivån av FUT8-protein till den relativa GAPDH-proteinnivån. Western blot-analys detekterade två band för GAPDH vid ~ 37 och 35 kDa. Det högre molekylviktsbandet motsvarar den förutsagda proteinstorleken och används därför i normaliseringsberäkningar. När FUT8-proteinuttrycket normaliserades mot GAPDH-proteinnivåer minskade med upp till 60% (figur 1).
I linje med observationen av gen knockdown vid 48 h efter transfektion bearbetades motsvarande mAb-prover för analys av CGE- LIF. Glykanstrukturer från knockdown-celler visade en minskning av fukosylering. Denna trend var mest uttalad i agalaktosylerade strukturer (G0F) och observerades i mindre utsträckning i galaktosylerade strukturer (G1F, G1F ' och G2F). Från denna datauppsättning minskade den totala IgG-kärnfukosyleringen till ~ 75%, ned från ~ 95% kärnfukosylering observerad för det negativa kontrolltillståndet (Figur 2). En större minskning av kärnfukosylering förväntades med tanke på ~ 60% minskning av FUT8-proteinnivåerna. Vid reflektion är det anmärkningsvärt att glykoprofilen representerar glykosylerade mAbs som ackumulerats under en period av 48 timmar sedan transfektion, medan gendämpning endast representerar proteinnivåer som endast finns vid skördetidpunkten.
Ytterligare granskning av denna knockdown-metod involverade att variera DsiRNA-koncentrationen, skördetiden och elektroporeringsförhållandena. Varje faktor undersöktes individuellt för att bestämma dess relevans. Effekten av elektroporeringspulsförhållanden på kärnfukosylering och cellviabilitet fångas i experiment B, C, D och E. Dessa resultat visar en tvåfaldig minskning av kärnfukosylering från elektroporering med två fyrkantsvågspulser (experiment C) jämfört med en enda fyrkantsvågspuls (experiment B), utan signifikanta skillnader i cellviabilitet (tabell 2). Elektroporeringstillstånd e3 (experiment D) ledde till den lägsta cellviabiliteten (~ 90%) och IgG-utbytet vid denna tidpunkt. Celler som överlevde elektroporeringshändelsen transfekterades emellertid måttligt, vilket framgår av ~ 10% minskning av kärnfukosylering (tabell 2). Intressant nog använde experiment D elektroporeringsförhållanden som gav den största minskningen av kärnfukosylering (14,7%) men som uppenbarligen var skadliga för cellviabiliteten (91% -93% livskraft). Denna begränsade uppsättning experiment illustrerar behovet av att bestämma elektroporeringsinställningar som möjliggör tillräcklig permeabilisering av cellmembranet utan att orsaka oåterkallelig skada. Det är också intressant att notera rollen som siRNA-koncentration och skördetid på kärnfukosylering. Sammantaget har ökad siRNA-koncentration ett större inflytande på kärnfukosylering än att öka skördetiden (experiment B, F, G kontra experiment A, B, H). I framtida experiment skulle det vara intressant att titrera siRNA-koncentrationerna som levereras med elektroporeringsmetoden e2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> Figur 1. Experimentellt flödesschema. Glykoengineerings- och provanalysstegen visas med tillhörande tid som krävs för varje steg. SiRNA-design tar några timmar, beroende på antalet genmål eller konstruktioner per genmål. CHO-celltransfektion med siRNA är klar på några timmar, och transformerade celler får växa i 48 timmar. Cellpellets och supernatanter skördas inom några timmar. Cellpellets lyseras och de intracellulära proteinerna separeras på en SDS PAGE och blottas därefter och undersöks med antikroppar mot målgenen. Glykaner klyvs från renade antikroppar och analyseras av CGE-LIF. Dessa analyser kan kräva 1 dag vardera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> Figur 2. Bekräftelse av RNA-interferens. Western blot-detektion av α-1,6-fukosyltransferas (FUT8) proteinnivåer i prover behandlade med Fut8 eller icke-riktad kontroll DsiRNA. Band som motsvarar FUT8 har mer kontroll än Fut8-knockdown-samplingar. GAPDH-proteinnivån bedömdes också för att normalisera målgenuttrycket. Alla prover togs från experiment G (se tabell 2). Omtryckt från Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> Figur 3. Effekt av Fut8 knockdown på kumulativ IgG-glykosylering vid 48 h. En förskjutning i glykanfördelningen detekteras i knockdown-prover. I synnerhet reduceras den relativa förekomsten av de huvudsakliga kärnfukosylerade strukturerna (G0F) medan de afukosylerade arterna ökar i knockdown-experimentet. Mätningar utfördes från experiment G-prover (se tabell 2). Biologiska tredubblingar som utfördes för varje experiment blandades efter skörd för att minska bördan av nedströmsanalys. Omtryckt från Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Experimentets namn</td>
			<td colspan="2">Elektroporeringsmetod</td>
			<td colspan="2">DsiRNA-koncentration (nΜ)</td>
			<td>Skördetid (h)</td>
			<td>Lönsamhet (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 celler·ml-1)</td>
			<td>IgG titer (mg· L-1)</td>
			<td colspan="2">Skillnad i kärnfukosylering (%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2. Transfektion optimering. Iterativa modifieringar av elektroporeringsmetoden, DsiRNA-koncentration och skördetid ledde till förändringar i cellviabilitet, livskraftig celltäthet, IgG-titer vid skördetiden och skillnader i kärnfukosylering. Varje experiment jämförde knockdown och respektive negativ kontroll för att avgöra om modifieringen ger önskad effekt (dvs en minskning av fukosylering). Elektroporeringsinställningarna var följande: e1: 1200 V, 0,1 ms, kvadratisk vågform; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s mellan pulser, kvadratisk vågform; e3: 150 V, 20 ms, kvadratisk vågform; e4: 250 V, 500 μF, exponentiellt sönderfall. Omtryckt från Kotidis et al. 52.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells at JoVE.com

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Glykosyleringsmönstret för en antikropp bestämmer dess kliniska prestanda, vilket innebär att industriella och akademiska ansträngningar för att kontrollera glykosylering kvarstår. Eftersom typiska glykoengineeringskampanjer är tids- och arbetsintensiva, skulle genereringen av ett snabbt protokoll för att karakterisera effekterna av glykosyleringsgener med övergående tystnad visa sig vara användbar.

Snabb antikroppsglyknning i kinesiska hamsteräggceller

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Detta protokoll kan användas för att screena effekten av flera glykosyleringsenzymer på glykoprofilen hos ett målprotein och bidra till en bättre förståelse av enzymets funktioner. Protokollets natur möjliggör screening av glykosyleringsenzymer på ett övergående men ändå genomgående sätt. Förändrade glykosyleringsprofiler kan leda till förbättrade antikroppsaktiviteter och därmed öka slutproduktens effekt.Biofarmaceutiska företag övervakar noggrant glykosylering som ett kritiskt kvalitetsattribut. En avvikande glykosylering är ett kännetecken för sjukdomar som cancer. Därför är denna metod relevant för farmakologisk och biomedicinsk forskning.Protokollet förutsätter att användare har erfarenhet av flera experimentella tekniker, inklusive däggdjurscelltransfektion och western blotts. Det är bättre att börja med färre prover och använda stopppunkter i första hand. Börja med att bedöma densiteten och livskraften hos de kinesiska hamsteräggcellerna.Rengör sedan noggrant biosäkerhetsskåpet och all utrustning med 70% etanol och en RNase-hämmare för att undvika kontaminering. Därefter pelleterar cellerna vid 100 gånger G i fem minuter och återsuspenderar dem i ett förvärmt medium vid en celltäthet av fem gånger 10 till de sex cellerna per milliliter. Överför åtta mikroliter av DsiRNA-mastermixen eller styrningen till en steril elektroporeringskuvett.Tillsätt 800 mikroliter av cellsuspensionen till samma kyvett, blanda och leverera elektroporeringspulsen. Överför sedan cellsuspensionen från kyvetten till en brunn på en sexbrunnsplatta och undvik skumliknande material. Inkubera cellerna i 10 minuter utan att skaka.Efter inkubation tillsätt 800 mikroliter förvärmda medier för att göra en slutlig volym på 1,6 ml per brunn. Odla de transfekterade cellerna i inkubatorn medan du skakar vid 150 RPM. Efter 48 timmar, skörda supernatanten och cellerna.Efter IgG-rening, tillsätt eluation A på en tre kilodalton molekylviktavskuren centrifugalkoncentrator och centrifugera vid 13 300 gånger G i 40 till 50 minuter vid fyra grader Celsius. Centrifugeringen är klar när restvolymen är lika med eller mindre än 50 mikroliter. Kassera genomströmningen och tillsätt 500 mikroliter förkyld 1X PBS för att späda ut den återstående supernatanten.Centrifugera provet igen under samma förhållanden tills 50 mikroliter kvarvarande supernatant återstår. För att erhålla en 100X utspädning av supernatanten, tillsätt 500 mikroliter förkyld 1X PBS och upprepa centrifugeringsprocessen. Koncentrera supernatanten till en slutlig koncentration av cirka 2,5 gram per liter i 40 mikroliter för att säkerställa kompatibilitet med glykananalysmetoden.För glykananalys, överför 200 mikroliter av den magnetiska pärllösningen till ett 2-milliliter PCR-rör. Placera den på magnetstativet för att separera pärlorna från supernatanten och ta bort supernatanten försiktigt. Ta sedan bort rören från magnetstället och tillsätt det renade proteinprovet och virveln.Tillsätt sedan tillförseldenatureringsbufferten till provröret och inkubera i åtta minuter vid 60 grader Celsius. Håll provrören öppna för optimal reaktionsprestanda. Efter inkubation tillsätt PNGase F och inkubera i ytterligare 20 minuter vid 60 grader Celsius för att klyva glykaner från de renade antikropparna.Efter frisättning av N-glykaner, stäng provröret och virveln. Tillsätt sedan acetonitril till provröret, virveln och inkubera vid rumstemperatur i en minut. Placera provrören i magnetstativet för att separera pärlorna från lösningen.Ta sedan försiktigt bort supernatanten med en pipett utan att röra pärlorna. Tillsätt den fluoroforavande glykanmärkningslösningen till provet i en dragskåp och blanda genom virvel. Efter en 20 minuters inkubation vid 60 grader Celsius med öppna lock, avlägsna överflödigt färgämne genom att tvätta provet tre gånger i acetonitril.Eluera sedan de märkta glykanerna i dubbeldestillerat vatten. Placera provröret i magnetstativet och samla supernatanten berikad med renade och märkta glykaner. Förbered och ladda sedan alla nödvändiga standarder och prover i de angivna fackpositionerna.Kör glykananalysprotokollet och analysera och identifiera de glykaner som finns i provet med lämplig programvara. Western blot-analys visade minskat Fut8-proteinuttryck i celler transfekterade med en blandning av tre Fut8 DsiRNA-konstruktioner. Glykanstrukturer från knockdown-cellerna visade också minskad fukosylering.Denna trend var mest uttalad i agalaktosylerade strukturer och observerades i mindre utsträckning i galaktosylerade strukturer. En tvåfaldig minskning av kärnfukosylering observerades från elektroporering med användning av två fyrkantsvågspulser jämfört med en enda fyrkantsvågspuls utan signifikanta skillnader i cellviabilitet. Sammantaget har ökad kortstörande RNA-koncentration en stor störning på kärnfukosylering än att öka skördetiden.Förhållandet mellan vatten och acetonitril avgör om glykaner är i lösning eller en del av pärlorna. Det är viktigt att komma ihåg under tvättstegen för att undvika oavsiktlig borttagning av de märkta glykanerna från lösningen. Ett uppföljningsexperiment kan involvera karakterisering av renade monoklonala antikroppar med hjälp av cellbaserade analyser för att kvantifiera antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet och komplementberoende cytotoxicitet.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Utveckla anpassade kinesisk hamster-host cellprotein analyser med hjälp av akustisk teknik Membran mikropartikelenzymimmunoassay

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Snabb Isolering av livsdugliga cirkulerande tumörceller från patientblodprover

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Beställa enskilda celler och Single Embryon i 3D Förlossning: En ny enhet för hög halt Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

Snabb Scan elektronspinnresonans öppnar nya vägar för Imaging fysiologiskt viktiga parametrar<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisera angiogenes av Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetiskt modifierade 3D-PLGA/nHAp byggnadsställning för Calvarial kritiska ben defekt reparation

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Metaboliska Glycoengineering av Sialic Acid använder N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

En snabb Image-baserad bakteriell virulens analys med hjälp av amöba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rening och analys av en monoklonal antikropp från äggstocksceller från kinesisk hamster med hjälp av ett automatiserat Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Processoptimering med hög genomströmning Automatiserad Mikro-Bioreaktorer i kinesisk hamster äggstockscellodling

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...