Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Dette papir er støttet af bevillinger fra Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) og CFF-støttet forskning EHRE20XX0.

I den foreliggende undersøgelse blev prøver indsamlet under en klinisk indiceret bronkoskopi efter at have opnået informeret samtykke i henhold til en protokol godkendt af UNC Institutional Review Board.
1. Opsamling og opbevaring af sputum/slim
<ol><li>Saml luftvejsslim via sputumopsamling eller bronkoskopi aspiration.<ol>
<li>Saml sputum enten via spontan ekspektorering eller inducer sputum ved 3% hypertonisk saltvandsindånding. Alternativt aspirerer ...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus,+mucins,+and+cystic+fibrosis.">Mucus, mucins, and cystic fibrosis.</a> Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).</li><li>Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Human+Airway+Mucus.">Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus.</a> Physiological Reviews. , (2022).</li><li>Lin, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+mucus+viscosity+and+airway+dehydration+impact+COPD+airway+clearance.">Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance.</a> European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li><li>Tomaiuolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+improve+the+clinical+evaluation+of+cystic+fibrosis+patients+by+mucus+viscoelastic+properties.">A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties.</a> PloS One. 9 (1), 82297 (2014).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).</li><li>Zahm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+in+vitro+effect+of+recombinant+human+DNase+on+rheological+and+transport+properties+of+cystic+fibrosis+respiratory+mucus.">Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus.</a> The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).</li><li>Fuchs, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aerosolized+recombinant+human+DNase+on+exacerbations+of+respiratory+symptoms+and+on+pulmonary+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.+The+Pulmozyme+Study+Group.">Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group.</a> The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).</li><li>Hubbard, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+study+of+aerosolized+recombinant+human+deoxyribonuclease+I+in+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis.</a> The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).</li><li>Shak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolized+recombinant+human+DNase+I+for+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis.</a> Chest. 107, 65-70 (1995).</li><li>Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+sputum+rheology+correlates+with+both+acute+and+longitudinal+changes+in+lung+function.">Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function.</a> Chest. 154 (2), 370-377 (2018).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+plugs+in+patients+with+asthma+linked+to+eosinophilia+and+airflow+obstruction.">Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+inhaled+mucolytic+to+treat+airway+muco-obstructive+diseases.">An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cystic+fibrosis+airway+cells+with+CFTR+modulators+reverses+aberrant+mucus+properties+via+hydration.">Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration.</a> The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).</li><li>Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+transport+properties+of+airway+secretions+in+cystic+fibrosis-relationships+with+the+degree+of+infection+and+severity+of+the+disease.">Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease.</a> European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+controlling+mucociliary+frequency+and+respiratory+mucus+transport.">Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport.</a> Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).</li><li>Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

Slimets unikke viskoelastiske egenskaber er afgørende for at opretholde sunde luftveje. Interne og eksterne faktorer kan ændre luftvejsslim biofysiske egenskaber, hvilket forårsager kliniske komplikationer, der er karakteristiske for muco-obstruktive sygdomme. Derfor kan overvågning af ændringer i slimviskoselasticitet overvejes under vurderinger af sygdomsstatus og udforskning af terapier, der reducerer slimviskoselasticitet. Empiriske undersøgelser fra 1980'erne viste en stærk sammenhæng mellem slimreologi og l...

Muco-obstruktive luftvejssygdomme, herunder astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), cystisk fibrose (CF) og andre luftvejssygdomme, såsom viral og bakteriel lungebetændelse, er udbredte sundhedsmæssige bekymringer over hele verden. Mens patofysiologien varierer meget mellem hver tilstand, er et fælles nøgletræk unormal mucociliær clearance. I sunde lunger linjer slim luftvejsepitelet for at fange indåndede partikler og tilvejebringe en fysisk barriere mod patogener. Når det er udskilt, transporteres luftvejsslim, der består af ~ 97,5% vand, 0,9% salt, ~ 1,1% kugleformede proteiner og ~ 0,5% muciner, gradvist mod glottis ved den koordinerede slag af cilia 1,2. Slimhinder er store O-bundne glycoproteiner, der interagerer via ikke-kovalente og kovalente bindinger for at tilvejebringe slimets forskellige viskoelastiske egenskaber, hvilket er nødvendigt for effektiv transport3. Ændringer i slimhinnetværkets ultrastruktur forårsaget af ændret iontransport, mucinudfoldning, elektrostatiske interaktioner, tværbinding eller ændringer i sammensætning kan påvirke slimviskosiciteten betydeligt og forringe slimhindeclearance 4,5. Derfor er det afgørende at identificere ændringer i luftvejsslimets biofysiske egenskaber for at forstå sygdomspatogenese og teste nye mukoaktive forbindelser6.
Forskellige faktorer kan føre til produktion af afvigende slim i lungerne. Ved KOL udløser kronisk indånding af cigaretrøg slimhypersekretion som følge af bægercellemetaplasi samt luftvejsdehydrering via nedregulering af cystisk fibrose transmembrankonduktansregulator (CFTR) kanal, hvilket forårsager slimhyperkoncentration og små luftvejsobstruktion 7,8. Tilsvarende er CF, en genetisk lidelse forbundet med mutationer i CFTR-genet, karakteriseret ved produktion af tyktflydende, klæbende slim, der er utilstrækkeligt til transport 8,9. Kort fortalt inducerer CFTR-dysfunktion væskeudtømning af luftvejene, polymer mucinindfiltring og øgede biokemiske interaktioner, hvilket resulterer i kronisk inflammation og bakterielle infektioner. Derudover forværrer inflammatoriske celler fanget i statisk slim yderligere slimets viskoelasticitet ved at tilføje et andet stort molekyle, DNA, i gelmatrixen, hvilket forværrer luftvejsobstruktion5. Et af de bedste eksempler på slimreologiens betydning for lungernes generelle sundhed er tilvejebragt af eksemplet med rekombinant human DNFase (rhDNase) til behandling af cystisk fibrose patienter. Virkningerne af rhDNase blev først demonstreret ex vivo på ekspektoreret sputum, som viste en overgang fra viskøst slim til en flydende væske inden for få minutter10,11. Kliniske forsøg med CF-patienter viste, at reduktion af luftvejsslim viskoelasticitet med rhDNase-indånding reducerede hastigheden af lungeforværringer og forbedrede lungefunktionen og det generelle patienttrangid 12,13,14. Som følge heraf blev rhDNase-indånding med det formål at lette clearance standarden for pleje af CF-patienter i mere end to årtier. Lignende kliniske fordele blev observeret ved anvendelse af inhaleret hypertonisk saltvand til slimhydrering i CF, hvilket korrelerede med ændringer i reologiske egenskaber og resulterede i mucociliær clearance acceleration og forbedret lungefunktion 15,16. Derfor er en hurtig og pålidelig protokol til måling af slimviskoselastiske egenskaber i kliniske omgivelser vigtig for at optimere terapeutiske tilgange.
Det bordreometer, der testes heri, er et hurtigt og bekvemt alternativ til at udføre omfattende viskoelastiske målinger af slim/sputumprøver. Ved hjælp af dynamiske svingninger med kontrolleret vinkelforskydning tilvejebringer instrumentet deformation via et par justerbare parallelle plader (f.eks. Ru eller glatte geometrier) til måling af drejningsmoment og forskydning med opløsninger på 15 nN. m og 150 nm, henholdsvis17. En standard standardiseret kalibrering kombineret med brugerretningslinjer tilpasset ikke-reologispecialister giver mulighed for enkle målinger og reducerer risikoen for operatørfejl. Enheden producerer en belastningsfejningskurve, der behandles og analyseres i realtid (inden for ~ 5 minutter) og automatisk giver både lineære viskoelastiske (G', G", G * og tan δ) og gelpunkt (γc og σc) egenskaber (se tabel 1). Det elastiske modul eller lagringsmodulet (G') beskriver, hvordan en prøve reagerer på stress (dvs. evnen til at vende tilbage til sin oprindelige form), mens det viskøse eller tabsmodul (G") beskriver den energi, der spredes pr. Cyklus af sinusformet deformation (dvs. den energi, der går tabt på grund af friktion af molekyler). Det komplekse eller dynamiske modul (G*) er forholdet mellem spænding og belastning, som beskriver mængden af intern kraftopbygning som reaktion på en forskydningsforskydning (dvs. de samlede viskoelastiske egenskaber). Dæmpningsfaktoren (tan δ) er forholdet mellem det viskøse modul og det elastiske modul, hvilket indikerer en prøves evne til at sprede energi (dvs. en lav solbrun δ indikerer en elastisk dominerende / faststoflignende adfærd, mens en høj tan δ indikerer en viskøs dominerende / væskelignende adfærd). For gelpunktskarakteristika er crossover-stammen (γc) målestokken for forskydningsstammen, beregnet ved forholdet mellem afbøjningsvejen og forskydningsgabshøjden, hvor prøven overgår fra en faststoflignende til en væskelignende adfærd og pr. definition forekommer ved svingningsstamme, hvor G' = G" eller tan δ = 1. Crossover-udbyttespændingen (σc) er et mål for mængden af stress, der påføres af den enhed, hvor den elastiske og viskøse moduli krydser. I sund sputa dominerer elasticitet den mekaniske reaktion på belastning (G '> G"). Ved slimhindestruktive sygdomme øges både G 'og G" som følge af patologiske slimændringer 17,18,19. Enhedens operationelle enkelhed letter målinger på stedet og omgår behovet for prøveopbevaring/transport/forsendelse til en offsite-facilitet til analyse, hvorved tids- og fryse-optøningsvirkningerne på disse biologiske prøvers egenskaber undgås.
I denne undersøgelse blev 8 MDa polyethylenoxidopløsninger (PEO) med forskellige koncentrationer (1%-3%) anvendt til at validere måleområdet for et kommercielt bordreometer (Table of Materials), og den opnåede koncentrationsafhængige kurve blev direkte sammenlignet med målinger erhvervet med et traditionelt bulkreometer (Table of Materials) ). Repeterbarheden af reologiske målinger blev derefter vurderet ved hjælp af bronkoskopisk høstet slim fra en intuberet patient, der lider af status astmaticus (SA), en ekstrem form for astmaforværring karakteriseret ved bronkospasme, eosinofil inflammation og slimhyperproduktion som reaktion på et miljø- eller infektiøst middel 8,20 . I dette tilfælde var SA-patienten blevet intuberet for svær respirationssvigt og krævede ECMO (ekstrakorporeal membraniltning) på grund af manglende evne til at støtte patienten effektivt og sikkert med mekanisk ventilation alene på trods af aggressive standard astmabehandlinger. Under en klinisk indiceret bronkoskopi for lobarkollaps blev tykke, klare, vedholdende sekreter noteret for at hindre lobar bronkier og blev aspireret ved hjælp af saltvandsvask. Umiddelbart efter indsamlingen blev overskydende saltvand fjernet fra aspiraten, og de viskoelastiske egenskaber af den resterende SA-prøve blev analyseret ved anvendelse af bordpladeindretningen. Yderligere prøvealikvoter blev behandlet med et reduktionsmiddel, tris (2-carboxylethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP), for at afgøre, om denne protokol kunne anvendes til at karakterisere terapeutisk forbindelses effektivitet ex vivo.
Resultaterne viste, at denne protokol og benchtop-enheden kan bruges effektivt i en klinisk indstilling. De reologiske egenskaber bestemt ud fra PEO-koncentrationsafhængige kurver (figur 1A) kunne ikke skelnes mellem den testede stationære enhed og et traditionelt parallelt pladereometer (figur 1B). Tredobbelte målinger af SA-slimet kunne gentages med en variationskoefficient på 10 % for G*-, G-, G- og G-endepunkterne og afspejlede de betydelige abnormiteter i slimviskoselasticitet, der var klinisk synlige i denne patients tilfælde (figur 1D). Endelig resulterede ex vivo-behandling med TCEP i en signifikant reduktion i G' og G" og en stigning i tan δ, hvilket viste lydhørhed over for behandlingen ved ændringer i mucinnetværket (figur 2). Afslutningsvis giver denne protokol ved hjælp af et benchtop reometer en enkel og effektiv tilgang til vurdering af viskoelastiske egenskaber af slimprøver opnået fra klinikken. Denne kapacitet kan bruges til at lette præcisionsmedicinske tilgange til pleje, da klinikere kan teste effekten af godkendte mukoaktive lægemidler på stedet, hvilket kan hjælpe med at identificere alternative behandlingsmuligheder. Derudover kan denne tilgang anvendes i kliniske forsøg til at undersøge virkningerne af forsøgslægemidler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

Ved slimhindestruktive lungesygdomme (f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesygdom, cystisk fibrose) og andre luftvejssygdomme (f.eks. virale/bakterielle infektioner) ændres slimets biofysiske egenskaber ved bægercellehypersekretion, luftvejsdehydrering, oxidativ stress og tilstedeværelsen af ekstracellulært DNA. Tidligere undersøgelser viste, at sputumviskoelasticitet korrelerede med lungefunktionen, og at behandlinger, der påvirker sputumreologi (f.eks. Mucolytika), kan resultere i bemærkelsesværdige kliniske fordele. Generelt anvender reologiske målinger af ikke-newtonske væsker udførlige, tidskrævende tilgange (f.eks. Parallelle / keglepladereometre og / eller mikroperlepartikelsporing), der kræver omfattende træning for at udføre analysen og fortolke dataene. Denne undersøgelse testede pålideligheden, reproducerbarheden og følsomheden af Rheomuco, en brugervenlig stationær enhed, der er designet til at udføre hurtige målinger ved hjælp af dynamisk svingning med en forskydningsbelastningsfejning for at tilvejebringe lineære viskoelastiske moduler (G', G", G * og tan δ) og gelpunktegenskaber (γc og σc) til kliniske prøver inden for 5 minutter. Enhedens ydeevne blev valideret ved hjælp af forskellige koncentrationer af en slimsimulator, 8 MDa polyethylenoxid (PEO) og i forhold til traditionelle bulkreologimålinger. Et klinisk isolat høstet fra en intuberet patient med status astmaticus (SA) blev derefter vurderet i tredobbelte målinger, og variationskoefficienten mellem målingerne er <10%. Ex vivo brug af et potent slimreducerende middel, TCEP, på SA-slim resulterede i et femdoblet fald i elastisk modul og en ændring i retning af en mere "væskelignende" adfærd generelt (f.eks. Højere tan δ). Tilsammen viser disse resultater, at det testede benchtop reometer kan foretage pålidelige målinger af slimviskoselasticitet i kliniske og forskningsmæssige omgivelser. Sammenfattende kan den beskrevne protokol bruges til at undersøge virkningerne af mukoaktive lægemidler (f.eks. rhDNase, N-acetylcystein) på stedet for at tilpasse behandlingen fra sag til sag eller i prækliniske undersøgelser af nye forbindelser.

Figur 1 viser nøjagtigheden og repeterbarheden af reologiske målinger ved hjælp af koncentrationsafhængige kurver for viskoelastisk kontrol, dvs. polyethylenoxidopløsning (PEO) og status asthmaticus (SA) slim. Målinger af viskoelastiske egenskaber ved 8 MDa PEO i fem forskellige koncentrationer (1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%) blev direkte sammenlignet mellem det evaluerede benchtop reometer og et traditionelt bulkreometer (Table of Materials). I modsætning til SA-slim var ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Slimets viskoelastiske egenskaber spiller en kritisk rolle i mucociliær clearance. Imidlertid kræver traditionelle slimrologiske teknikker komplekse og tidskrævende tilgange. Denne undersøgelse giver en detaljeret protokol til brug af et benchtop reometer, der hurtigt og pålideligt kan udføre viskoelastiske målinger.

Hurtig viskoelastisk karakterisering af luftvejsslim ved hjælp af et bænkreometer

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Slimhindrende sygdomme er karakteriseret ved unormal viskositet af luftvejsslimet. Protokollen viser, hvordan man bruger reologi til at kvantificere slimviskositet og analysere data for at teste slimmålrettede behandlinger. Slimreologi giver specifikke kvantitative biomarkører.Brug af en stationær enhed forenkler i høj grad logistikken med at måle disse biomarkører i kliniske prøver som humane sputumprøver. Brug af slimreologi som diagnoseværktøj til obstruktive sygdomme er stadig en udfordring. En stigende mængde beviser viser en stærk sammenhæng mellem reologiegenskaber, betændelse og bakteriel infektion.Slim er altid til stede ved kropsgrænsefladen, hvor det smører og spiller en beskyttende rolle. Slim reologi kan anvendes på andre systemer som mave-tarm- og kønssporene. For at opnå nøjagtige målinger er korrekt håndtering og placering af prøven afgørende.En visuel demonstration kan forbedre præcisionen af dette assay. Demonstrerer denne procedure vil være Kendall Shaffer, en forskningstekniker fra luftlaboratoriet. Begynd med at sortere det opsamlede luftvejssputum eller slim i sterile prøvekopper.I tilfælde af sputum fjernes overskydende spyt fra prøven straks efter indsamling. Anbring prøverne på is til transport. Begræns transporttiden til mindre end fire timer.Analyser prøverne på indsamlingstidspunktet. Homogeniser slimet ved forsigtigt at pipettere op og ned tre til fem gange med en positiv forskydningspipette. Eller pipette direkte ind i mikrocentrifugerørene.Opbevar prøverne ved 80 grader Celsius, indtil de er behandlet. Alikvot prøverne til opbevaring i mængder på højst 500 mikroliter for at sikre tilstrækkelig volumen til forsøg. Før alicitat pipette frisk og frosset sputum eller slim direkte eller homogenisere prøver.Reparer de nødvendige alikvoter til gentagne målinger og behandlinger. Inkuber de alikvoter, der skal testes ved 37 grader Celsius i mindst fem minutter før måling. Til test af farmakologiske agenser skal der anvendes høje koncentrationer af stamopløsninger for at forhindre prøvefortynding.Der tilsættes mellem 1 % og 10 % volumen af det ønskede reagens direkte på prøven. Sørg for, at ingen dråbe af forbindelsen forbliver på siden af røret. Inkubere prøverne ved 37 grader Celsius i den krævede tid for at muliggøre en kemisk reaktion.Bland slimprøven og reagenset ved at svirpe bunden af mikrocentrifugerøret hvert andet minut for at muliggøre progressiv indtrængning af reagenset i slimprøven uden at gå på kompromis med slimnetværket. Når du sammenligner flere lægemiddelreagenser, skal du sikre dig, at inkubationstiden er ens. Tænd for maskinen, og initialiser softwaren.Vælg ny måling. Angiv prøveidentifikationsnummeret under Målings-id og navnet på den operatør, der skal fortsætte, under Operator to continue. Angiv yderligere oplysninger eller kommentarer under Kommentarer.Vælg et geometrisæt og inspicer store og små plader omhyggeligt for at sikre, at pladerne er rene og i perfekt stand. Sæt den store plade fast på den nederste prædikestol. Indsæt forsigtigt den lille plade på den øverste prædikestol, og lås pladen ved at dreje let, indtil der høres et klik, hvilket indikerer, at pladen er korrekt fastspændt.Bemærk, at fri svingning af den øverste plade er normal. Vent, indtil temperaturen når 37 grader Celsius målværdi. Start derefter automatisk kalibrering, som softwaren beder om.Ved hjælp af en positiv forskydningspipette pipetter man langsomt mellem 250 og 500 mikroliter af prøven i midten af den store bundplade. Når de er deponeret på pladen, vil viskøse prøver vedtage en kuppelform, mens meget elastiske prøver kan kræve fysisk afskæring. Sænk målehovedet, der bærer den lille plade via softwaren, og observer prøven.Hvis prøven lægges korrekt på bundpladen, vil den få kontakt og være centreret mellem de to plader. For at sikre, at prøven udfylder hullet, skal du bruge den reducerede mellemrumsfunktion, indtil prøven ikke længere er i biconcave form eller justeret med pladens kant. Den reducerede mellemrumsfunktion sænker målekanten i trin på 0,1 millimeter og er begrænset til 7 trin.Hvis der er et hul tilbage efter de 7 trin, skal du klikke på Gentag installation for at vende tilbage til startpositionen og justere prøvens position og lydstyrke. Hvis afstanden er overordentlig reduceret, fjernes den overskydende prøve med en spatel ved en cirkulær bevægelse langs kanten af den øverste plade. Trim den overskydende prøve forsigtigt for at undgå forskydningsspænding.Sænk beskyttelsesdækslet for at undgå utilsigtet fremspring af forurenede væsker under svingning. For at starte måling skal du klikke på Start analyse. En hel cyklus vil tage fire til syv minutter.Undgå at tale højt og røre ved enheden eller bænken i hele cyklussens længde. Et roligt miljø er afgørende i de første to minutter. Når cyklussen er afsluttet, skal du klikke på næste for at hæve målehovedet og generere prøveanalyserapporten.Når målehovedet er trukket helt tilbage, skal du hæve beskyttelsesdækslet. Kassér prøven, og fjern forsigtigt pladerne. Rengør og desinficer pladerne med varmt vand og sæbe.De viskoelastiske egenskaber ved otte megadalton PEO blev målt i fem koncentrationer og direkte sammenlignet mellem det evaluerede benchtop reometer og et traditionelt bulkreometer. I modsætning til PEO-løsninger repræsenterer statusasticus slim en solid-lignende elastisk domineret adfærd ved lav belastning og har en crossover ved høj belastning. Derudover bekræftede triplicate målinger udført i 1,5% PEO-opløsning og klinisk assay slimprøve, at lineære viskoelastiske egenskaber var meget repeterbare for værdierne opnået fra den biologiske prøve.Ændringer blev målt i slimets viskoelastiske egenskaber efter behandling med et mucolytisk middel. TCEP-effekter på assayslim viskoelasticitet blev testet i en klinisk indstilling ved hjælp af benchtop reometeret. Mucolytisk behandling resulterede i en mere væskelignende prøve med et fald i det komplekse modul med 4,6 fold, elastisk modul med 5,1 fold, viskøst modul med 1,9 fold, crossover-belastning med 3,3 fold og crossover-udbyttespænding med 5,7 gange og en stigning i dæmpningsforholdet med 2,8 gange.Måling af luftvejsslim viskoelasticitet i en hurtig klinisk indstilling kan hjælpe med at skræddersy patienternes behandling fra sag til sag samt give en standardiseret protokol til test af nye farmakologiske forbindelser. Denne teknik bruges i øjeblikket til at undersøge virkningerne af meget effektive CFTR-modulatorer på cystisk fibrose sputum og til at teste styrken af forskellige lægemidler, der sigter mod at ændre slimegenskaber.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Hurtig Point-of-Care Assay af enoxaparin antikoagulerende effekt i fuldblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Rapid Cellefri CD4 Optælling Anvendelse helspyt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatiseret Måling af lungeemfysem og Small Airway Remodeling i cigaretrøg-eksponerede mus

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Aktuel Airway Anæstesi til Awake-endoskopisk Intubation Brug af Spray-as-you-go teknik med høj Oxygen Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo Evaluering af Rattens Tunge Mekaniske og Viskoelastiske Egenskaber

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Hurtig evaluering af kemiske forbindelsers Toksicitet ved hjælp af Zebrafish-embryoner

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

Karakterisering af sickling under kontrolleret automatiseret Deoxygenering med oxygen gradient Ektacytometri

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

Den stive tube som et alternativ til styring af problematiske luftvejene

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Karakterisering af en ny human organotypic retinal kultur teknik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Design og udvikling af en model til at studere effekten af supplerende ilt på cystisk fibrose Luftvejene Mikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...