Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
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Cet article est soutenu par des subventions de Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) et de research EHRE20XX0 soutenue par CFF.

Dans la présente étude, des échantillons ont été prélevés lors d’une bronchoscopie cliniquement indiquée après avoir obtenu le consentement éclairé en vertu d’un protocole approuvé par le Comité d’examen institutionnel de l’UNC.
1. Collecte et stockage des expectorations et du mucus
<ol><li>Recueillir le mucus des voies respiratoires par prélèvement d’expectorations ou aspiration par bronchoscopie.<ol>
<li>Prélever les expectorations soit <...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. 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K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

Les propriétés viscoélastiques uniques du mucus sont essentielles au maintien de voies respiratoires saines. Des facteurs internes et externes peuvent altérer les propriétés biophysiques du mucus des voies respiratoires, entraînant des complications cliniques caractéristiques des maladies muco-obstructives. Par conséquent, la surveillance des changements dans la viscoélasticité du mucus pourrait être envisagée lors de l’évaluation de l’état de la maladie et de l’exploration de thérapies qui réduise...

Les maladies des voies respiratoires muco-obstructives, y compris l’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la fibrose kystique (FK) et d’autres affections respiratoires, telles que la pneumonie virale et bactérienne, sont des problèmes de santé répandus dans le monde entier. Bien que la physiopathologie varie considérablement d’une affection à l’autre, une caractéristique clé commune est une clairance mucociliaire anormale. Dans les poumons sains, le mucus tapisse l’épithélium des voies respiratoires pour piéger les particules inhalées et fournir une barrière physique contre les agents pathogènes. Une fois sécrété, le mucus des voies respiratoires, composé d’environ 97,5% d’eau, de 0,9% de sel, d’environ 1,1% de protéines globulaires et d’environ 0,5% de mucines, est progressivement transporté vers la glotte par le battement coordonné des cils 1,2. Les mucines sont de grandes glycoprotéines liées à l’O qui interagissent via des liaisons non covalentes et covalentes pour fournir les propriétés viscoélastiques distinctes du mucus, ce qui est nécessaire pour un transport efficace3. Les changements dans l’ultrastructure du réseau de mucine causés par une altération du transport ionique, le déploiement de la mucine, les interactions électrostatiques, la réticulation ou des changements de composition peuvent affecter de manière significative la viscoélasticité du mucus et altérer la clairance mucociliaire 4,5. Par conséquent, l’identification des changements dans les propriétés biophysiques du mucus des voies respiratoires est essentielle pour comprendre la pathogenèse de la maladie et tester de nouveaux composés mucoactifs6.
Divers facteurs peuvent conduire à la production de mucus aberrant dans les poumons. Dans la MPOC, l’inhalation chronique de fumée de cigarette déclenche une hypersécrétion de mucus à la suite de la métaplasie des cellules de gobelet, ainsi qu’une déshydratation des voies respiratoires via la régulation négative du canal régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR), provoquant une hyperconcentration du mucus et une obstruction des petites voies respiratoires 7,8. De même, la mucoviscidose, une maladie génétique associée à des mutations du gène CFTR, se caractérise par la production de mucus visqueux et adhérent inadéquat pour le transport 8,9. En bref, le dysfonctionnement du CFTR induit l’épuisement des liquides de surface des voies respiratoires, l’enchevêtrement de mucine polymère et une augmentation des interactions biochimiques, ce qui entraîne une inflammation chronique et des infections bactériennes. En outre, les cellules inflammatoires piégées dans le mucus statique exacerbent encore la viscoélasticité du mucus en ajoutant une autre grosse molécule, l’ADN, dans la matrice du gel, aggravant l’obstruction des voies respiratoires5. L’un des meilleurs exemples de l’importance de la rhéologie du mucus sur la santé globale des poumons est fourni par l’exemple de la DNFase humaine recombinante (rhDNase) dans le traitement des patients atteints de mucoviscidose. Les effets de la rhDNase ont d’abord été démontrés ex vivo sur les expectorations expectorées, qui ont montré une transition du mucus visqueux à un liquide qui s’écoule enquelques minutes 10,11. Les essais cliniques chez les patients atteints de mucoviscidose ont démontré que la réduction de la viscoélasticité du mucus des voies respiratoires avec l’inhalation de rhDNase diminuait le taux d’exacerbations pulmonaires et améliorait la fonction pulmonaire et le bien-être général du patient 12,13,14. En conséquence, l’inhalation de rhDNase visant à faciliter la clairance est devenue la norme de soins pour les patients atteints de mucoviscidose pendant plus de deux décennies. Des avantages cliniques similaires ont été observés avec l’utilisation d’une solution saline hypertonique inhalée pour l’hydratation du mucus dans la mucoviscidose, ce qui était en corrélation avec des changements dans les propriétés rhéologiques et entraînait une accélération de la clairance mucociliaire et une amélioration de la fonction pulmonaire15,16. Par conséquent, un protocole rapide et fiable pour mesurer les propriétés viscoélastiques du mucus en milieu clinique est important pour optimiser les approches thérapeutiques.
Le rhéomètre de paillasse testé ici offre une alternative rapide et pratique pour effectuer des mesures viscoélastiques complètes d’échantillons de mucus / expectorations. En utilisant des oscillations dynamiques avec déplacement angulaire contrôlé, l’instrument fournit une déformation via une paire de plaques parallèles réglables (par exemple, des géométries rugueuses ou lisses) pour mesurer le couple et le déplacement avec des résolutions de 15 nN. m et 150 nm, respectivement17. Un étalonnage standardisé par défaut combiné à des directives d’utilisation adaptées aux spécialistes non rhéologiques permet des mesures simples et réduit le risque d’erreurs de l’opérateur. L’appareil produit une courbe de balayage de déformation qui est traitée et analysée en temps réel (dans un délai d’environ 5 minutes) et fournit automatiquement des caractéristiques viscoélastiques linéaires (G', G », G* et tan δ) et de point de gel (γc et σc) (voir tableau 1). Le module élastique ou de stockage (G') décrit comment un échantillon réagit au stress (c.-à-d. la capacité de revenir à sa forme d’origine), tandis que le module visqueux ou de perte (G) décrit l’énergie dissipée par cycle de déformation sinusoïdale (c.-à-d. l’énergie perdue en raison du frottement des molécules). Le module complexe ou dynamique (G*) est le rapport de la contrainte à la déformation, qui décrit la quantité d’accumulation de force interne en réponse à un déplacement de cisaillement (c.-à-d. les propriétés viscoélastiques globales). Le facteur d’amortissement (tan δ) est le rapport entre le module visqueux et le module élastique, ce qui indique la capacité d’un échantillon à dissiper l’énergie (c’est-à-dire qu’un faible bronzage δ indique un comportement élastique dominant / solide, tandis qu’un bronzage élevé δ indique un comportement visqueux dominant / liquide). Pour les caractéristiques du point de gel, la déformation croisée (γc) est la mesure de la déformation de cisaillement, calculée par le rapport entre le chemin de déviation et la hauteur de l’écart de cisaillement, à laquelle l’échantillon passe d’un comportement de type solide à un comportement de type liquide et se produit, par définition, à une déformation d’oscillation où G' = G » ou tan δ = 1. La limite d’élasticité croisée (σc) est une mesure de la quantité de contrainte appliquée par le dispositif auquel les modules élastiques et visqueux se croisent. Dans une sputa saine, l’élasticité domine la réponse mécanique à la déformation (G' > G »). Dans les maladies muco-obstructives, G' et G » augmentent à la suite de changements pathologiques de mucus 17,18,19. La simplicité opérationnelle de l’appareil facilite les mesures sur site et contourne le besoin d’entreposage, de transport et d’expédition des échantillons vers une installation hors site pour analyse, évitant ainsi les effets de temps et de gel-dégel sur les propriétés de ces échantillons biologiques.
Dans cette étude, des solutions d’oxyde de polyéthylène (PEO) de 8 MDa de différentes concentrations (1% -3%) ont été utilisées pour valider la plage de mesure d’un rhéomètre de paillasse commercial (Table des matériaux) et la courbe dépendante de la concentration obtenue a été directement comparée aux mesures acquises avec un rhéomètre en vrac traditionnel (Table des matériaux) ). La répétabilité des mesures rhéologiques a ensuite été évaluée à l’aide de mucus prélevé bronchoscopiquement sur un patient intubé souffrant d’asthme (AS), une forme extrême d’exacerbation de l’asthme caractérisée par un bronchospasme, une inflammation éosinophile et une hyperproduction de mucus en réponse à un agent environnemental ou infectieux 8,20 . Dans ce cas, le patient SA avait été intubé pour insuffisance respiratoire sévère et avait besoin d’ECMO (oxygénation par membrane extracorporelle) en raison de l’incapacité de soutenir le patient efficacement et en toute sécurité avec une ventilation mécanique seule, malgré des traitements agressifs standard contre l’asthme. Au cours d’une bronchoscopie cliniquement indiquée pour l’effondrement lobaire, des sécrétions épaisses, claires et tenaces ont été notées comme obstruant les bronches lobaires et ont été aspirées à l’aide de lavages salins. Immédiatement après le prélèvement, l’excès de solution saline a été retiré de l’aspiration et les propriétés viscoélastiques de l’échantillon SA restant ont été analysées à l’aide du dispositif de paillasse. D’autres aliquotes d’échantillons ont été traitées avec un agent réducteur, le chlorhydrate de phosphine de tris (2-carboxyléthyle) (TCEP), afin de déterminer si ce protocole pouvait être utilisé pour caractériser l’efficacité des composés thérapeutiques ex vivo.
Les résultats ont montré que ce protocole et le dispositif de paillasse peuvent être utilisés efficacement en milieu clinique. Les propriétés rhéologiques déterminées à partir des courbes dépendantes de la concentration de PEO (figure 1A) étaient impossibles à distinguer entre le dispositif de paillasse testé et un rhéomètre à plaques parallèles traditionnel (figure 1B). Les mesures triplicates du mucus SA étaient reproductibles, avec un coefficient de variation de 10 % pour les critères d’évaluation G*, G' et G » et reflétaient les anomalies substantielles de la viscoélasticité du mucus qui étaient cliniquement apparentes dans le cas de ce patient (Figure 1D). Enfin, le traitement ex vivo par TCEP a entraîné une réduction significative de G' et G » et une augmentation de la δ bronzée, démontrant une réactivité au traitement par des altérations du réseau de mucine (Figure 2). En conclusion, ce protocole utilisant un rhéomètre de paillasse fournit une approche simple et efficace pour évaluer les propriétés viscoélastiques des échantillons de mucus obtenus en clinique. Cette capacité peut être utilisée pour faciliter les approches de médecine de précision en matière de soins, car les cliniciens peuvent tester l’efficacité des médicaments mucoactifs approuvés sur place, ce qui peut aider à identifier d’autres options de traitement. De plus, cette approche peut être utilisée dans les essais cliniques pour examiner les effets des médicaments expérimentaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

Dans les maladies pulmonaires muco-obstructives (p. ex. asthme, maladie pulmonaire obstructive chronique, fibrose kystique) et d’autres affections respiratoires (p. ex., infections virales/bactériennes), les propriétés biophysiques du mucus sont altérées par l’hypersécrétion des cellules gobelets, la déshydratation des voies respiratoires, le stress oxydatif et la présence d’ADN extracellulaire. Des études antérieures ont montré que la viscoélasticité des expectorations était en corrélation avec la fonction pulmonaire et que les traitements affectant la rhéologie des expectorations (par exemple, les mucolytiques) peuvent entraîner des avantages cliniques remarquables. En général, les mesures rhéologiques des fluides non newtoniens utilisent des approches élaborées et chronophages (p. ex., rhéomètres parallèles/à plaques coniques et/ou suivi des particules de microbilles) qui nécessitent une formation approfondie pour effectuer le test et interpréter les données. Cette étude a testé la fiabilité, la reproductibilité et la sensibilité de Rheomuco, un dispositif de paillasse convivial conçu pour effectuer des mesures rapides en utilisant l’oscillation dynamique avec un balayage cisaillement-déformation afin de fournir des modules viscoélastiques linéaires (G', G », G* et tan δ) et des caractéristiques de point de gel (γc et σc) pour les échantillons cliniques dans les 5 minutes. Les performances de l’appareil ont été validées à l’aide de différentes concentrations d’un simulant de mucus, l’oxyde de polyéthylène (PEO) de 8 MDa, et par rapport aux mesures traditionnelles de rhéologie en vrac. Un isolat clinique prélevé sur un patient intubé atteint d’asthme (SA) a ensuite été évalué en trois mesures et le coefficient de variation entre les mesures est <10%. L’utilisation ex vivo d’un puissant agent réducteur de mucus, le TCEP, sur le mucus SA a entraîné une diminution de cinq fois du module élastique et un changement vers un comportement global plus « liquide » (par exemple, un bronzage plus élevé δ). Ensemble, ces résultats démontrent que le rhéomètre de paillasse testé peut effectuer des mesures fiables de la viscoélasticité du mucus dans les milieux cliniques et de recherche. En résumé, le protocole décrit pourrait être utilisé pour explorer les effets des médicaments mucoactifs (p. ex. rhDNase, N-acétyl cystéine) sur place pour adapter le traitement au cas par cas, ou dans des études précliniques de nouveaux composés.

La figure 1 montre la précision et la répétabilité des mesures rhéologiques à l’aide de courbes dépendantes de la concentration de contrôle viscoélastique, c’est-à-dire la solution d’oxyde de polyéthylène (PEO) et le mucus asthmatique (SA). Les mesures des caractéristiques viscoélastiques de 8 MDa PEO à cinq concentrations différentes (1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 % et 3 %) ont été directement comparées entre le rhéomètre de paillasse évalué et un rhéomètre en vrac tra...

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Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Les propriétés viscoélastiques du mucus jouent un rôle essentiel dans la clairance mucociliaire. Cependant, les techniques rhéologiques traditionnelles du mucus nécessitent des approches complexes et chronophages. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’utilisation d’un rhéomètre de paillasse capable d’effectuer rapidement et de manière fiable des mesures viscoélastiques.

Caractérisation viscoélastique rapide du mucus des voies respiratoires à l’aide d’un rhéomètre de paillasse

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Les maladies muco-obstructives sont caractérisées par une viscosité anormale du mucus des voies respiratoires. Le protocole montre comment utiliser la rhéologie pour quantifier la viscosité du mucus et analyser les données pour tester les traitements ciblant le mucus. La rhéologie du mucus fournit des biomarqueurs quantitatifs spécifiques.L’utilisation d’un dispositif de paillasse simplifie considérablement la logistique de la mesure de ces biomarqueurs dans des échantillons cliniques tels que des échantillons d’expectorations humaines. L’utilisation de la rhéologie du mucus comme outil de diagnostic des maladies obstructives reste un défi. Un nombre croissant de preuves montre une forte corrélation entre les propriétés rhéologiques, l’inflammation et l’infection bactérienne.Le mucus est toujours présent à l’interface du corps où il lubrifie et joue un rôle protecteur. La rhéologie du mucus peut être appliquée à d’autres systèmes comme les voies gastro-intestinales et génitales. Pour obtenir des mesures précises, une manipulation et un placement corrects de l’échantillon sont essentiels.Une démonstration visuelle peut améliorer la précision de ce test. Kendall Shaffer, technicienne de recherche du laboratoire de l’air, fera la démonstration de cette procédure. Commencez par trier les expectorations ou le mucus des voies respiratoires collectés dans des gobelets stériles.Dans le cas des expectorations, retirer l’excès de salive de l’échantillon immédiatement après le prélèvement. Placez les échantillons sur de la glace pour le transport. Limitez le temps de transport à moins de quatre heures.Analysez les échantillons au moment du prélèvement. Homogénéiser le mucus en piquant doucement de haut en bas trois à cinq fois avec une pipette à déplacement positif. Ou pipette directement dans les tubes de microcentrifugation.Conservez les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient traités. Aliquoter les échantillons à stocker dans des volumes supérieurs ou égaux à 500 microlitres afin d’assurer un volume suffisant pour les expériences. Avant de faire la citation, pipeter directement les expectorations ou le mucus frais et congelés ou homogénéiser les spécimens.Réparez les aliquotes requises pour les mesures et les traitements répétés. Incuber les aliquotes à tester à 37 degrés Celsius pendant au moins cinq minutes avant la mesure. Pour tester les agents pharmacologiques, utilisez des concentrations élevées de solutions mères pour éviter la dilution de l’échantillon.Ajouter entre 1 % et 10 % de volume du réactif souhaité directement sur l’échantillon. Assurez-vous qu’aucune goutte du composé ne reste sur le côté du tube. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant la durée requise, pour permettre une réaction chimique.Mélanger l’échantillon de mucus et le réactif en faisant glisser le fond du tube de microcentrifugation toutes les deux minutes pour permettre une pénétration progressive du réactif dans l’échantillon de mucus sans compromettre le réseau de mucine. Lorsque vous comparez plusieurs réactifs médicamenteux, assurez-vous que le temps d’incubation est similaire. Allumez la machine et initialisez le logiciel.Sélectionnez une nouvelle mesure. Entrez le numéro d’identification de l’échantillon sous ID de mesure et le nom de l’opérateur sous Opérateur pour continuer. Entrez des informations ou des commentaires supplémentaires sous Commentaires.Sélectionnez un jeu de géométrie et inspectez soigneusement les grandes et petites plaques pour vous assurer que les plaques sont propres et en parfait état. Insérez fermement la grande plaque sur la chaire inférieure. Insérez doucement la petite plaque sur la chaire supérieure et verrouillez la plaque en la tournant légèrement jusqu’à entendre un clic, ce qui indique que la plaque est correctement serrée.Notez que l’oscillation libre de la plaque supérieure est normale. Attendez que la température atteigne la valeur cible de 37 degrés Celsius. Lancez ensuite l’étalonnage automatique, à l’invite du logiciel.À l’aide d’une pipette à déplacement positif, pipettez lentement entre 250 et 500 microlitres de l’échantillon au centre de la grande plaque inférieure. Une fois déposés sur la plaque, les échantillons visqueux adopteront une forme de dôme, tandis que les échantillons très élastiques peuvent nécessiter une séparation physique. Abaissez la tête de mesure transportant la petite plaque via le logiciel et observez l’échantillon.S’il est correctement chargé sur la plaque inférieure, l’échantillon entrera en contact et sera centré entre les deux plaques. Pour vous assurer que l’échantillon comble l’espace, utilisez la fonction d’écart réduit jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus en forme de biconcave ou aligné avec le bord de la plaque. La fonction d’écart réduit abaisse l’arête de mesure par incréments de 0,1 millimètre et est limitée à 7 incréments.S’il reste un espace après les 7 incréments, cliquez sur Rétablir l’installation pour revenir à la position initiale et ajuster la position et le volume de l’échantillon. Si l’écart est excessivement réduit, retirez l’excès d’échantillon avec une spatule par un mouvement circulaire le long du bord de la plaque supérieure. Coupez doucement l’excès d’échantillon pour éviter les contraintes de cisaillement.Abaissez le couvercle de protection pour éviter toute projection accidentelle de fluides contaminés pendant l’oscillation. Pour lancer la mesure, cliquez sur Démarrer l’analyse. Un cycle entier prendra de quatre à sept minutes.Évitez de parler fort et de toucher l’appareil ou le banc pendant toute la durée du cycle. Un environnement calme est crucial pendant les deux premières minutes. Une fois le cycle terminé, cliquez sur Suivant pour augmenter la tête de mesure et générer le rapport d’analyse de l’échantillon.Une fois que la tête de mesure est complètement rétractée, soulevez le couvercle de protection. Jetez l’échantillon et retirez soigneusement les plaques. Nettoyez et désinfectez les assiettes à l’eau tiède et au savon.Les caractéristiques viscoélastiques de huit mégadaltons peO ont été mesurées à cinq concentrations et directement comparées entre le rhéomètre de paillasse évalué et un rhéomètre en vrac traditionnel. Contrairement aux solutions peO, le mucus asthmatique de statut représente un comportement dominé par l’élastique solide à faible tension et comporte un croisement à forte tension. En outre, les mesures de triples effectuées dans une solution de PEO à 1,5 % et un échantillon de mucus de dosage clinique ont confirmé que les caractéristiques viscoélastiques linéaires étaient hautement reproductibles pour les valeurs obtenues à partir de l’échantillon biologique.Des changements ont été mesurés dans les propriétés viscoélastiques du mucus après un traitement par un agent mucolytique. Les effets du TCEP sur la viscoélasticité du mucus ont été testés en milieu clinique à l’aide du rhéomètre de paillasse. Le traitement mucolytique a donné un échantillon plus fluide avec une diminution du module complexe de 4,6 fois, un module élastique de 5,1 fois, un module visqueux de 1,9 fois, une déformation croisée de 3,3 fois et une contrainte d’élasticité croisée de 5,7 fois, et une augmentation du rapport d’amortissement de 2,8 fois.La mesure de la viscoélasticité du mucus des voies respiratoires dans un environnement clinique au rythme rapide peut aider à adapter le traitement des patients au cas par cas, ainsi qu’à fournir un protocole normalisé pour tester de nouveaux composés pharmacologiques. Cette technique est actuellement utilisée pour examiner les effets des modulateurs CFTR très efficaces sur les expectorations de la fibrose kystique et pour tester la puissance de divers médicaments visant à modifier les propriétés du mucus.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Rapid Point-of-Care Test de l&#39;efficacité anticoagulante énoxaparine dans le sang total

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

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Médecine

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Le α-test: Rapid portable sans énumération des CD4 utilisant la salive entier

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Mesure automatisée de l&#39;emphysème pulmonaire et petites remodelage des voies aériennes dans la cigarette de fumée souris exposées

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Topique Airway anesthésie pour intubation Awake-endoscopique Utilisation du Spray-as-you-go Technique avec débit élevé d&#39;oxygène

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

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Évaluation in vivo des propriétés mécaniques et viscoélastiques de la langue de rat

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

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In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

Le métro rigide comme alternative dans le contrôle des voies respiratoires problématiques

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Caractérisation d’une nouvelle technique de culture rétinienne organotypique humaine

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Conception et développement d’un modèle pour étudier l’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome des voies respiratoires de la fibrose kystique

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...