Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
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Dieses Papier wird durch Stipendien von Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) und CFF-supported Research EHRE20XX0 unterstützt.

In der vorliegenden Studie wurden Proben während einer klinisch indizierten Bronchoskopie gesammelt, nachdem die Einwilligung nach Aufklärung gemäß einem vom UNC Institutional Review Board genehmigten Protokoll eingeholt worden war.
1. Sputum-/Schleimsammlung und -lagerung
<ol><li>Sammeln Sie Atemwegsschleim durch Sputumsammlung oder Bronchoskopie-Aspiration.<ol>
<li>Sammeln Sie Sputum entweder durch spontanen Auswurf oder induzieren Sie Sputum durch 3%...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. 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K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

Die einzigartigen viskoelastischen Eigenschaften von Schleim sind für die Erhaltung gesunder Atemwege unerlässlich. Interne und externe Faktoren können die biophysikalischen Eigenschaften des Atemwegsschleims verändern und klinische Komplikationen verursachen, die für schleimobstruktive Erkrankungen charakteristisch sind. Daher könnte die Überwachung von Veränderungen der Schleimviskoelastizität bei der Beurteilung des Krankheitsstatus und der Erforschung von Therapien, die die Viskoelastizität des Schleims red...

Muko-obstruktive Atemwegserkrankungen, einschließlich Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Mukoviszidose (CF) und andere Atemwegserkrankungen wie virale und bakterielle Lungenentzündung, sind weltweit weit verbreitete Gesundheitsprobleme. Während die Pathophysiologie zwischen den einzelnen Erkrankungen stark variiert, ist ein gemeinsames Schlüsselmerkmal eine abnormale mukoziliäre Clearance. In gesunden Lungen kleidet Schleim das Atemwegsepithel aus, um eingeatmete Partikel einzufangen und eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger zu schaffen. Nach der Sekretion wird der Atemwegsschleim, der aus ~ 97,5% Wasser, 0,9% Salz, ~ 1,1% Kugelproteinen und ~ 0,5% Schleim besteht, allmählich durch das koordinierte Schlagen von Zilien 1,2 in Richtung der Stimmblase transportiert. Mucine sind große O-verknüpfte Glykoproteine, die über nicht-kovalente und kovalente Bindungen interagieren, um die unterschiedlichen viskoelastischen Eigenschaften von Schleim bereitzustellen, die für einen effizienten Transport erforderlichsind 3. Veränderungen in der Ultrastruktur des Mucin-Netzwerks, die durch veränderten Ionentransport, Mucinentfaltung, elektrostatische Wechselwirkungen, Vernetzung oder Änderungen der Zusammensetzung verursacht werden, können die Viskoelastizität des Schleims signifikant beeinflussen und die mukoziliäre Clearancebeeinträchtigen 4,5. Daher ist die Identifizierung von Veränderungen der biophysikalischen Eigenschaften von Atemwegsschleim für das Verständnis der Krankheitspathogenese und die Erprobung neuartiger mukoaktiver Verbindungenunerlässlich 6.
Verschiedene Faktoren können zur Produktion von aberrantem Schleim in der Lunge führen. Bei COPD löst das chronische Einatmen von Zigarettenrauch eine Schleimhypersekretion als Folge der Becherzellmetaplasie sowie eine Dehydrierung der Atemwege über die Herunterregulierung des CFTR-Kanals (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) aus, was zu einer Schleimhyperkonzentration und einer Obstruktion der kleinen Atemwege führt 7,8. In ähnlicher Weise ist CF, eine genetische Störung, die mit Mutationen im CFTR-Gen assoziiert ist, durch die Produktion von viskosem, adhärentem Schleim gekennzeichnet, der für den Transport nicht ausreicht 8,9. Kurz gesagt, CFTR-Dysfunktion induziert die Erschöpfung der Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die Verschränkung des polymeren Mucins und erhöhte biochemische Wechselwirkungen, die zu chronischen Entzündungen und bakteriellen Infektionen führen. Darüber hinaus verschlimmern Entzündungszellen, die in statischem Schleim gefangen sind, die Viskoelastizität des Schleims weiter, indem sie ein weiteres großes Molekül, DNA, in die Gelmatrix geben, was die Atemwegsobstruktionverschlimmert 5. Eines der besten Beispiele für die Bedeutung der Schleimrheologie für die allgemeine Gesundheit der Lunge ist das Beispiel der rekombinanten humanen DNFase (rhDNase) bei der Behandlung von Mukoviszidose-Patienten. Die Wirkungen von rhDNase wurden erstmals ex vivo auf schleimlösenden Sputum nachgewiesen, der innerhalb von Minuten10,11 einen Übergang von viskosem Schleim zu einer fließenden Flüssigkeit zeigte. Klinische Studien an CF-Patienten zeigten, dass die Verringerung der Viskoelastizität des Atemwegsschleims mit rhDNase-Inhalation die Rate der pulmonalen Exazerbationen verringerte und die Lungenfunktion und das allgemeine Wohlbefinden des Patienten verbesserte12,13,14. Infolgedessen wurde die rhDNase-Inhalation zur Erleichterung der Clearance für mehr als zwei Jahrzehnte zum Behandlungsstandard für CF-Patienten. Ähnliche klinische Vorteile wurden bei der Verwendung von inhalativer hypertoner Kochsalzlösung zur Schleimhydratation bei CF beobachtet, die mit Veränderungen der rheologischen Eigenschaften korrelierte und zu einer Beschleunigung der mukoziliären Clearance und einer verbesserten Lungenfunktionführte 15,16. Daher ist ein schnelles und zuverlässiges Protokoll zur Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Schleim in klinischen Umgebungen wichtig, um therapeutische Ansätze zu optimieren.
Das hier getestete Tischrheometer bietet eine schnelle und komfortable Alternative für die Durchführung umfassender viskoelastischer Messungen von Schleim-/Sputumproben. Unter Verwendung dynamischer Schwingungen mit kontrollierter Winkelverschiebung bietet das Gerät eine Verformung über ein Paar einstellbarer paralleler Platten (z. B. grobe oder glatte Geometrien), um das Drehmoment und die Verschiebung mit Auflösungen von 15 nN zu messen. m und150 nm bzw. 17. Eine standardisierte Standardkalibrierung in Kombination mit Benutzerrichtlinien, die für Nicht-Rheologie-Spezialisten angepasst sind, ermöglicht einfache Messungen und reduziert das Risiko von Bedienerfehlern. Das Gerät erzeugt eine Dehnungskurven, die in Echtzeit (innerhalb von ~ 5 min) verarbeitet und analysiert wird und automatisch sowohl lineare viskoelastische (G', G", G* und tan δ) als auch gelförmige (γ c und σc) Eigenschaften liefert (siehe Tabelle 1). Der Elastizitäts- oder Speichermodul (G') beschreibt, wie eine Probe auf Stress reagiert (d. h. die Fähigkeit, in ihre ursprüngliche Form zurückzukehren), während der viskose oder Verlustmodul (G) die Energie beschreibt, die pro Zyklus der sinusförmigen Verformung abgeführt wird (dh die Energie, die durch die Reibung von Molekülen verloren geht). Der komplexe oder dynamische Modul (G*) ist das Verhältnis von Spannung zu Dehnung, das das Ausmaß des inneren Kraftaufbaus als Reaktion auf eine Schubverschiebung (d. h. die gesamten viskoelastischen Eigenschaften) beschreibt. Der Dämpfungsfaktor (tan δ) ist das Verhältnis des viskosen Moduls zum Elastizitätsmodul, was die Fähigkeit einer Probe angibt, Energie abzuleiten (d. h. eine niedrige Bräunung δ zeigt ein elastisch-dominantes/feststoffähnliches Verhalten an, während ein hoher Bräunungs-δ ein viskos-dominantes/flüssigkeitsähnliches Verhalten anzeigt). Für Gelpunkteigenschaften ist die Übergangsdehnung (γc) das Maß der Scherdehnung, berechnet durch das Verhältnis des Umlenkweges zur Scherspalthöhe, bei der die Probe von einem feststoffähnlichen zu einem flüssigkeitsähnlichen Verhalten übergeht und definitionsgemäß bei Schwingungsdehnung auftritt, wobei G' = G" oder tan δ = 1 ist. Die Übergangsfließspannung (σc) ist ein Maß für die Höhe der Spannung, die von der Vorrichtung ausgeübt wird, bei der sich die elastischen und viskosen Module kreuzen. Bei gesunden Sputa dominiert die Elastizität die mechanische Reaktion auf Dehnung (G' > G"). Bei muko-obstruktiven Erkrankungen nehmen sowohl G' als auch "G" infolge pathologischer Schleimveränderungenzu 17,18,19. Die einfache Bedienung des Geräts erleichtert Messungen vor Ort und umgeht die Notwendigkeit der Lagerung / des Transports / des Versands von Proben zu einer externen Einrichtung zur Analyse, wodurch die Zeit- und Frost-Tau-Effekte auf die Eigenschaften dieser biologischen Proben vermieden werden.
In dieser Studie wurden 8 MDa-Polyethylenoxid (PEO)-Lösungen unterschiedlicher Konzentration (1%-3%) verwendet, um den Messbereich eines handelsüblichen Tischrheometers (Table of Materials) zu validieren, und die erhaltene konzentrationsabhängige Kurve wurde direkt mit Messungen verglichen, die mit einem herkömmlichen Bulk-Rheometer (Table of Materials) durchgeführt wurden. ). Die Wiederholbarkeit der rheologischen Messungen wurde dann anhand von bronchoskopisch geerntetem Schleim eines intubierten Patienten mit Status asthmaticus (SA) beurteilt, einer extremen Form der Asthma-Exazerbation, die durch Bronchospasmus, eosinophile Entzündungen und Schleimhyperproduktion als Reaktion auf einen Umwelt- oder Infektionserreger gekennzeichnet ist8,20 . In diesem Fall war der SA-Patient wegen schwerer Ateminsuffizienz intubiert worden und benötigte ECMO (extrakorporale Membranoxygenierung), da der Patient trotz aggressiver Standard-Asthmatherapien nicht allein mit mechanischer Beatmung effektiv und sicher unterstützt werden konnte. Während einer klinisch indizierten Bronchoskopie für den Lobarkollaps wurden dicke, klare, hartnäckige Sekrete festgestellt, die die Lobarbronchien verstopften und mit Kochsalzwaschungen abgesaugt wurden. Unmittelbar nach der Entnahme wurde überschüssige Kochsalzlösung aus dem Aspirat entfernt und die viskoelastischen Eigenschaften der verbleibenden SA-Probe mit dem Tischgerät analysiert. Zusätzliche Probenaliquots wurden mit einem Reduktionsmittel, Tris (2-carboxylethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP), behandelt, um festzustellen, ob dieses Protokoll zur Charakterisierung der therapeutischen Wirkstoffwirksamkeit ex vivo verwendet werden könnte.
Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Protokoll und das Tischgerät effektiv in einer klinischen Umgebung eingesetzt werden können. Die aus PEO-Konzentrationskurven (Abbildung 1A) ermittelten rheologischen Eigenschaften waren zwischen dem getesteten Tischgerät und einem herkömmlichen parallelen Plattenrheometer nicht zu unterscheiden (Abbildung 1B). Dreifache Messungen des SA-Schleims waren wiederholbar, mit einem Variationskoeffizienten von 10% für G*-, G'- und G"-Endpunkte und spiegelten die erheblichen Anomalien der Schleimviskoelastizität wider, die im Fall dieses Patienten klinisch offensichtlich waren (Abbildung 1D). Schließlich führte die Ex-vivo-Behandlung mit TCEP zu einer signifikanten Reduktion von G' und G" und einer Zunahme der Bräunungs δ, was zeigt, dass sie durch Veränderungen im Mucin-Netzwerk auf die Behandlung ansprechen (Abbildung 2). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll mit einem Tischrheometer einen einfachen und effektiven Ansatz zur Beurteilung der viskoelastischen Eigenschaften von Schleimproben aus der Klinik bietet. Diese Fähigkeit kann verwendet werden, um präzisionsmedizinische Ansätze für die Versorgung zu erleichtern, da Kliniker die Wirksamkeit zugelassener mukoaktiver Medikamente vor Ort testen können, was dazu beitragen kann, alternative Behandlungsoptionen zu identifizieren. Darüber hinaus kann dieser Ansatz in klinischen Studien eingesetzt werden, um die Wirkung von Prüfpräparaten zu untersuchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

Bei muko-obstruktiven Lungenerkrankungen (z. B. Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Mukoviszidose) und anderen Atemwegserkrankungen (z. B. virale / bakterielle Infektionen) werden die biophysikalischen Eigenschaften des Schleims durch Becherzellhypersekretion, Atemwegsdehydrierung, oxidativen Stress und das Vorhandensein von extrazellulärer DNA verändert. Frühere Studien zeigten, dass die Viskoelastizität des Sputums mit der Lungenfunktion korrelierte und dass Behandlungen, die die Sputumrheologie beeinflussen (z. B. Mukolytika), zu bemerkenswerten klinischen Vorteilen führen können. Im Allgemeinen verwenden rheologische Messungen von nicht-newtonschen Flüssigkeiten ausgefeilte, zeitaufwändige Ansätze (z. B. parallele / Kegelplatten-Rheometer und / oder Mikroperlenpartikel-Tracking), die ein umfangreiches Training erfordern, um den Assay durchzuführen und die Daten zu interpretieren. Diese Studie testete die Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit von Rheomuco, einem benutzerfreundlichen Tischgerät, das entwickelt wurde, um schnelle Messungen mit dynamischer Oszillation mit einem Scher-Dehnungs-Sweep durchzuführen, um lineare viskoelastische Moduli (G', G", G* und tan δ) und Gelpunkteigenschaften (γ c und σc) für klinische Proben innerhalb von 5 Minuten bereitzustellen. Die Geräteleistung wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen eines Schleimsimulans, 8 MDa Polyethylenoxid (PEO), und anhand herkömmlicher Bulk-Rheologiemessungen validiert. Ein klinisches Isolat, das von einem intubierten Patienten mit Status asthmaticus (SA) entnommen wurde, wurde dann in dreifachen Messungen bewertet und der Variationskoeffizient zwischen den Messungen beträgt <10%. Die Ex-vivo-Anwendung eines starken Schleimreduktionsmittels, TCEP, auf SA-Schleim führte zu einer fünffachen Abnahme des Elastizitätsmoduls und einer Veränderung hin zu einem insgesamt "flüssigkeitsähnlicheren" Verhalten (z. B. höhere Bräunung δ). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass das getestete Tischrheometer zuverlässige Messungen der Schleimviskoelastizität in klinischen und Forschungsumgebungen durchführen kann. Zusammenfassend könnte das beschriebene Protokoll verwendet werden, um die Wirkungen von mukoaktiven Arzneimitteln (z. B. rhDNase, N-Acetylcystein) vor Ort zu untersuchen, um die Behandlung von Fall zu Fall oder in präklinischen Studien mit neuartigen Verbindungen anzupassen.

Abbildung 1 zeigt die Genauigkeit und Wiederholbarkeit rheologischer Messungen unter Verwendung konzentrationsabhängiger Kurven der viskoelastischen Kontrolle, d. h. Polyethylenoxid (PEO)-Lösung, und Status asthmaticus (SA)-schleim. Messungen der viskoelastischen Eigenschaften von 8 MDa PEO bei fünf verschiedenen Konzentrationen (1%, 1,5%, 2%, 2,5% und 3%) wurden direkt zwischen dem ausgewerteten Tischrheometer und einem traditionellen Bulk-Rheometer verglichen (Werkstofftabelle</...

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Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims spielen eine entscheidende Rolle bei der schleimhäutigen Clearance. Traditionelle rheologische Schleimtechniken erfordern jedoch komplexe und zeitaufwändige Ansätze. Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Tischrheometers, das schnell und zuverlässig viskoelastische Messungen durchführen kann.

Schnelle viskoelastische Charakterisierung von Atemwegsschleim mit einem Tischrheometer

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Muko-obstruktive Erkrankungen sind durch eine abnormale Viskosität des Atemwegsschleims gekennzeichnet. Das Protokoll zeigt, wie man Rheologie verwendet, um die Schleimviskosität zu quantifizieren und Daten zu analysieren, um Schleim-Targeting-Behandlungen zu testen. Die Schleimrheologie liefert spezifische quantitative Biomarker.Die Verwendung eines Tischgeräts vereinfacht die Logistik der Messung dieser Biomarker in klinischen Proben wie menschlichen Sputumproben erheblich. Die Verwendung der Schleimrheologie als Diagnoseinstrument für obstruktive Erkrankungen ist nach wie vor eine Herausforderung. Eine zunehmende Anzahl von Beweisen zeigt eine starke Korrelation zwischen rheologischen Eigenschaften, Entzündungen und bakteriellen Infektionen.Schleim ist immer an der Körperschnittstelle vorhanden, wo er schmiert und eine schützende Rolle spielt. Die Schleimrheologie kann auf andere Systeme wie die Magen-Darm- und Genitalspuren angewendet werden. Um genaue Messungen zu erhalten, ist die korrekte Handhabung und Platzierung der Probe von entscheidender Bedeutung.Eine visuelle Demonstration kann die Präzision dieses Assays verbessern. Dieses Verfahren wird Kendall Shaffer, ein Forschungstechniker aus dem Luftlabor, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Sortierung des gesammelten Atemwegsauswurfs oder Schleims in sterilen Probenbechern.Im Falle von Sputum entfernen Sie überschüssigen Speichel sofort nach der Entnahme aus der Probe. Legen Sie die Proben zum Transport auf Eis. Begrenzen Sie die Transportzeit auf weniger als vier Stunden.Analysieren Sie die Proben zum Zeitpunkt der Entnahme. Homogenisieren Sie den Schleim, indem Sie mit einer Verdrängungspipette drei- bis fünfmal vorsichtig auf und ab pipettieren. Oder direkt in die Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren.Lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius, bis sie verarbeitet sind. Aliquot die Proben für die Lagerung in Volumina größer oder gleich 500 Mikroliter, um ein ausreichendes Volumen für Experimente zu gewährleisten. Vor dem Aliquotieren frischen und gefrorenen Sputum oder Schleim direkt pipettieren oder Proben homogenisieren.Reparieren Sie die erforderlichen Aliquots für wiederholte Messungen und Behandlungen. Inkubieren Sie die zu testenden Aliquots vor der Messung mindestens fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie zum Testen pharmakologischer Wirkstoffe hohe Konzentrationen von Stammlösungen, um eine Verdünnung der Probe zu verhindern.Geben Sie zwischen 1% und 10% Volumen des gewünschten Reagenzes direkt auf die Probe. Stellen Sie sicher, dass kein Tropfen der Verbindung auf der Seite des Röhrchens bleibt. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für die erforderliche Zeitspanne, um eine chemische Reaktion zu ermöglichen.Mischen Sie die Schleimprobe und das Reagenz, indem Sie alle zwei Minuten den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens streichen, um ein progressives Eindringen des Reagenzes in die Schleimprobe zu ermöglichen, ohne das Mucinnetzwerk zu beeinträchtigen. Stellen Sie beim Vergleich mehrerer Arzneimittelreagenzien sicher, dass die Inkubationszeit ähnlich ist. Schalten Sie das Gerät ein und initialisieren Sie die Software.Wählen Sie eine neue Messung aus. Geben Sie unter Measure-ID die Probenidentifikationsnummer und unter Operator den Namen des Operators ein, um fortzufahren. Geben Sie unter Kommentare zusätzliche Informationen oder Kommentare ein.Wählen Sie einen Geometriesatz aus und prüfen Sie große und kleine Platten sorgfältig, um sicherzustellen, dass die Platten sauber und in einwandfreiem Zustand sind. Setzen Sie die große Platte fest auf die untere Kanzel. Setzen Sie die kleine Platte vorsichtig auf die obere Kanzel ein und verriegeln Sie die Platte, indem Sie sie leicht drehen, bis Sie ein Klicken hören, das anzeigt, dass die Platte richtig eingespannt ist.Beachten Sie, dass die freie Schwingung der oberen Platte normal ist. Warten Sie, bis die Temperatur den Zielwert von 37 Grad Celsius erreicht. Initiieren Sie dann die automatische Kalibrierung, wie von der Software gefordert.Mit einer Verdrängungspipette werden langsam zwischen 250 und 500 Mikroliter der Probe in der Mitte der großen Bodenplatte pipettiert. Sobald sie auf der Platte abgeschieden sind, nehmen viskose Proben eine Kuppelform an, während hochelastische Proben eine physische Trennung erfordern können. Senken Sie den Messkopf, der die kleine Platte trägt, über die Software ab und beobachten Sie die Probe.Bei richtiger Belastung der Bodenplatte kommt die Probe in Kontakt und wird zwischen den beiden Platten zentriert. Um sicherzustellen, dass die Probe den Spalt füllt, verwenden Sie die Funktion "Reduzierter Spalt", bis die Probe nicht mehr in der bikonkaven Form oder am Rand der Platte ausgerichtet ist. Die reduzierte Spaltfunktion senkt die Messkante in 0,1-Millimeter-Schritten ab und ist auf 7 Schritte begrenzt.Wenn nach den 7 Schritten eine Lücke verbleibt, klicken Sie auf Installation wiederholen, um zur Ausgangsposition zurückzukehren und die Position und das Volumen der Probe anzupassen. Wenn der Spalt stark reduziert wird, entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Spatel durch eine kreisförmige Bewegung entlang der Kante der oberen Platte. Schneiden Sie die überschüssige Probe vorsichtig ab, um Scherspannungen zu vermeiden.Senken Sie die Schutzabdeckung ab, um eine versehentliche Projektion kontaminierter Flüssigkeiten während der Schwingung zu vermeiden. Um die Messung zu starten, klicken Sie auf Analyse starten. Ein ganzer Zyklus dauert vier bis sieben Minuten.Vermeiden Sie es, während der gesamten Dauer des Zyklus laut zu sprechen und das Gerät oder die Bank zu berühren. Eine ruhige Umgebung ist für die ersten zwei Minuten entscheidend. Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, klicken Sie auf Weiter, um den Messkopf zu erhöhen und den Probenanalysebericht zu erstellen.Sobald der Messkopf vollständig eingezogen ist, heben Sie die Schutzhülle an. Entsorgen Sie die Probe und entfernen Sie die Platten vorsichtig. Reinigen und desinfizieren Sie die Teller mit warmem Wasser und Seife.Die viskoelastischen Eigenschaften von acht Megadalton PEO wurden in fünf Konzentrationen gemessen und direkt zwischen dem ausgewerteten Tischrheometer und einem traditionellen Bulk-Rheometer verglichen. Im Gegensatz zu PEO-Lösungen stellt Status asthmaticus mucus ein festes, elastisch dominiertes Verhalten bei geringer Dehnung dar und weist bei hoher Belastung eine Frequenzweiche auf. Darüber hinaus bestätigten dreifache Messungen, die in 1,5%PEO-Lösung und klinischer Schleimprobe durchgeführt wurden, dass lineare viskoelastische Eigenschaften für die aus der biologischen Probe erhaltenen Werte sehr wiederholbar waren.Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Schleim wurden nach der Behandlung mit einem mukolytischen Mittel gemessen. TCEP-Effekte auf die Viskoelastizität des Assay-Schleims wurden in einer klinischen Umgebung mit dem Tischrheometer getestet. Die mukolytische Behandlung führte zu einer flüssigeren Probe mit einer Abnahme des komplexen Moduls um das 4,6-fache, des Elastizitätsmoduls um das 5,1-fache, des viskosen Moduls um das 1,9-fache, der Crossover-Dehnung um das 3,3-fache und der Crossover-Fließspannung um das 5,7-fache und einer Erhöhung des Dämpfungsverhältnisses um das 2,8-fache.Die Messung der Viskoelastizität des Atemwegsschleims in einem schnelllebigen klinischen Umfeld kann dazu beitragen, die Behandlung der Patienten von Fall zu Fall anzupassen und ein standardisiertes Protokoll für die Prüfung neuartiger pharmakologischer Verbindungen bereitzustellen. Diese Technik wird derzeit verwendet, um die Auswirkungen hochwirksamer CFTR-Modulatoren auf Mukoviszidose-Sputum zu untersuchen und die Wirksamkeit verschiedener Medikamente zur Veränderung der Schleimeigenschaften zu testen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Schnelle Point-of-Care-Test von Enoxaparin Gerinnungshemmer Wirksamkeit im Vollblut

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Forschung

Medizin

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Die α-Test: Rapid Zellfreie CD4-Zählung mit ganzen Speichel

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topical Airway Anästhesie für Wach-endoskopische Intubation Mit der Spray-as-you-go-Technik mit hoher Sauerstoff-Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo Auswertung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Rattenzunge

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

Charakterisierung des Sicklings bei kontrollierter automatisierter Deoxygenierung mit Sauerstoffgradientektacytometrie

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

Die Stare Röhre als Alternative zur Steuerung der problematischen Atemwege

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...