Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

מאמר זה נתמך על ידי מענקים מ-Vertex Pharmaceuticals (פרס Ehre RIA) וממחקר EHRE20XX0 הנתמך על ידי CFF.

במחקר הנוכחי, דגימות נאספו במהלך ברונכוסקופיה שצוינה קלינית לאחר קבלת הסכמה מדעת על פי פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UNC.
1. איסוף ואחסון של כיח/ריר
<ol><li>לאסוף ריר דרכי הנשימה באמצעות איסוף כיח או שאיפה ברונכוסקופיה.<ol>
<li>אספו כיח באמצעות צ?...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus,+mucins,+and+cystic+fibrosis.">Mucus, mucins, and cystic fibrosis.</a> Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).</li><li>Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Human+Airway+Mucus.">Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus.</a> Physiological Reviews. , (2022).</li><li>Lin, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+mucus+viscosity+and+airway+dehydration+impact+COPD+airway+clearance.">Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance.</a> European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li><li>Tomaiuolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+improve+the+clinical+evaluation+of+cystic+fibrosis+patients+by+mucus+viscoelastic+properties.">A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties.</a> PloS One. 9 (1), 82297 (2014).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).</li><li>Zahm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+in+vitro+effect+of+recombinant+human+DNase+on+rheological+and+transport+properties+of+cystic+fibrosis+respiratory+mucus.">Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus.</a> The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).</li><li>Fuchs, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aerosolized+recombinant+human+DNase+on+exacerbations+of+respiratory+symptoms+and+on+pulmonary+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.+The+Pulmozyme+Study+Group.">Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group.</a> The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).</li><li>Hubbard, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+study+of+aerosolized+recombinant+human+deoxyribonuclease+I+in+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis.</a> The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).</li><li>Shak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolized+recombinant+human+DNase+I+for+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis.</a> Chest. 107, 65-70 (1995).</li><li>Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+sputum+rheology+correlates+with+both+acute+and+longitudinal+changes+in+lung+function.">Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function.</a> Chest. 154 (2), 370-377 (2018).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+plugs+in+patients+with+asthma+linked+to+eosinophilia+and+airflow+obstruction.">Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+inhaled+mucolytic+to+treat+airway+muco-obstructive+diseases.">An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cystic+fibrosis+airway+cells+with+CFTR+modulators+reverses+aberrant+mucus+properties+via+hydration.">Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration.</a> The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).</li><li>Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+transport+properties+of+airway+secretions+in+cystic+fibrosis-relationships+with+the+degree+of+infection+and+severity+of+the+disease.">Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease.</a> European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+controlling+mucociliary+frequency+and+respiratory+mucus+transport.">Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport.</a> Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).</li><li>Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

התכונות הויסקואלסטיות הייחודיות של ריר חיוניות לשמירה על דרכי הנשימה הבריאות. גורמים פנימיים וחיצוניים יכולים לשנות את התכונות הביופיזיות של ריר דרכי הנשימה, ולגרום לסיבוכים קליניים האופייניים למחלות חסימתיות ריריות. לפיכך, ניתן לשקול מעקב אחר שינויים בצמיגות הריר במהלך הערכות של מצב ה...

מחלות דרכי הנשימה החוסמות לריריות, כולל אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס (CF) ומצבים נשימתיים אחרים, כגון דלקת ריאות נגיפית וחיידקית, הן חששות בריאותיים נפוצים ברחבי העולם. בעוד שהפתופיזיולוגיה משתנה מאוד בין כל מצב, מאפיין מפתח משותף הוא פינוי ריריות לא תקין. בריאות, ריר קושר את אפיתל דרכי הנשימה כדי ללכוד חלקיקים בשאיפה ולספק מחסום פיזי נגד פתוגנים. לאחר ההפרשה, ריר דרכי הנשימה, המורכב מכ-97.5% מים, 0.9% מלח, כ-1.1% חלבונים כדוריים וכ-0.5% מוקינים, מועבר בהדרגה לכיוון הגלוטי על ידי הכאה מתואמת של ריסונים 1,2. מוקינים הם גליקופרוטאינים גדולים המקושרים ל-O, המקיימים אינטראקציה באמצעות קשרים לא קוולנטיים וקוולנטיים, כדי לספק את התכונות הוויסקואלסטיות המובהקות של ריר, הנדרשות להובלה יעילה3. שינויים במבנה האולטרה-מבנה של רשת המוצין הנגרמים על ידי שינוי בהעברת יונים, התפתחות מוצין, אינטראקציות אלקטרוסטטיות, קישור צולב או שינויים בהרכב יכולים להשפיע באופן משמעותי על צמיגות הריר ולפגוע בפינויהריריות 4,5. לפיכך, זיהוי שינויים בתכונות הביופיזיות של ריר דרכי הנשימה חיוני להבנת פתוגנזה של מחלות ולבדיקת תרכובות ריריות חדשניות6.
גורמים שונים יכולים להוביל לייצור של ריר חריגה בריאות. ב- COPD, שאיפה כרונית של עשן סיגריות גורמת להיפר-סקרציה של ריר כתוצאה ממטאפלזיה של תאי גביע, כמו גם התייבשות דרכי הנשימה באמצעות ויסות של תעלת מווסת ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנסממברנה (CFTR), הגורמת להיפר-קונסנטציה של ריר וחסימת דרכי הנשימה הקטנה 7,8. באופן דומה, CF, הפרעה גנטית הקשורה למוטציות בגן CFTR, מאופיינת בייצור של ריר צמיג ודבק שאינו מספיק להובלה 8,9. בקצרה, תפקוד לקוי של CFTR גורם לדלדול נוזלי של פני השטח של דרכי הנשימה, להסתבכות של מוצין פולימרי ולאינטראקציות ביוכימיות מוגברות, הגורמות לדלקת כרונית ולזיהומים חיידקיים. בנוסף, תאים דלקתיים הלכודים בריר סטטי מחריפים עוד יותר את הצמיגות של הריר על ידי הוספת מולקולה גדולה נוספת, DNA, למטריצת הג'ל, ומחמירים את חסימת דרכי הנשימה5. אחת הדוגמאות הטובות ביותר לחשיבותה של ריאולוגיה של ריר על הבריאות הכללית של הריאות מסופקת על ידי הדוגמה של DNFase אנושי רקומביננטי (rhDNase) בטיפול בחולי סיסטיק פיברוזיס. ההשפעות של rhDNase הודגמו לראשונה ex vivo על כיח צפוי, שהראה מעבר מריר צמיג לנוזל זורם תוך דקות10,11. ניסויים קליניים בחולי CF הראו כי הפחתת צמיגות הליחה של דרכי הנשימה באמצעות שאיפת rhDNase הפחיתה את קצב ההחמרות הריאתיות, ושיפרה את תפקוד הריאות ואת רווחתם הכללית שלהמטופלים 12,13,14. כתוצאה מכך, שאיפת rhDNase שמטרתה להקל על הסילוק הפכה לסטנדרט הטיפול בחולי CF במשך יותר משני עשורים. יתרונות קליניים דומים נצפו עם השימוש במי מלח היפרטוניים בשאיפה להידרציה של ריר ב- CF, אשר תאם עם שינויים בתכונות ריאולוגיות והביא להאצת פינוי ריריות ושיפור תפקוד הריאות15,16. לפיכך, פרוטוקול מהיר ואמין למדידת תכונות ויסקואלסטיות של ריר במסגרות קליניות חשוב כדי לייעל את הגישות הטיפוליות.
מד ה- benchtop הנבדק כאן מציע אלטרנטיבה מהירה ונוחה לביצוע מדידות ויסקואלסטיות מקיפות של דגימות ריר / כיח. באמצעות תנודות דינמיות עם תזוזה זוויתית מבוקרת, המכשיר מספק דפורמציה באמצעות זוג לוחות מקבילים מתכווננים (למשל, גיאומטריות גסות או חלקות) למדידת המומנט והתזוזה ברזולוציות של 15 nN. m ו- 150 ננומטר, בהתאמה17. כיול סטנדרטי המוגדר כברירת מחדל בשילוב עם הנחיות משתמש המותאמות למומחי ריאולוגיה שאינם מומחים לריאולוגיה מאפשר מדידות פשוטות ומפחית את הסיכון לשגיאות מפעיל. המכשיר מייצר עקומת טאטוא מתח המעובדת ומנותחת בזמן אמת (תוך כ-5 דקות) ומספקת באופן אוטומטי הן את המאפיינים הוויסקואלסטיים הליניאריים (G', G", G*, ו-tan δ) והן את נקודת הג'ל (γc ו-σ c) (ראו טבלה 1). מודולוס אלסטי או מודולוס אחסון (G') מתאר כיצד דגימה מגיבה ללחץ (כלומר, היכולת לחזור לצורתה המקורית), בעוד שמודולוס הצמיג או האובדן (G") מתאר את האנרגיה המתפזרת לכל מחזור של דפורמציה סינוסואידלית (כלומר, האנרגיה שאבדה עקב חיכוך של מולקולות). המודולוס המורכב או הדינמי (G*) הוא היחס בין מתח למתח, המתאר את כמות הצטברות הכוחות הפנימיים בתגובה לתזוזה גזירה (כלומר, התכונות הוויסקואלסטיות הכוללות). גורם השיכוך (tan δ) הוא היחס בין המודולוס הצמיג למודולוס האלסטי, מה שמצביע על יכולתו של מדגם לפזר אנרגיה (כלומר, δ שיזוף נמוך מצביע על התנהגות אלסטית-דומיננטית/דמוית מוצק, בעוד δ שיזוף גבוה מצביע על התנהגות צמיגת-דומיננטית/נוזלית). עבור מאפייני נקודת הג'ל, זן ההצלבה (γc) הוא המדד של זן הגזירה, המחושב על ידי היחס בין נתיב הסטייה לגובה מרווח הגזירה, שבו הדגימה עוברת מהתנהגות דמוית מוצק להתנהגות דמוית נוזל ומתרחשת, מעצם הגדרתה, בזן התנודה שבו G' = G" או tan δ = 1. מתח תשואת ההצלבה (σc) הוא מדד לכמות הלחץ המופעלת על ידי המכשיר שבו המודולי האלסטי והצמיג חוצה. בספוטה בריאה, האלסטיות שולטת בתגובה המכנית למתח (G' > G"). במחלות ריריות-חסימתיות, גם G' וגם G" עולות כתוצאה משינויים פתולוגיים בליחה 17,18,19. הפשטות התפעולית של המכשיר מאפשרת מדידות באתר ועוקפת את הצורך באחסון/הובלה/משלוח של דגימות למתקן מחוץ לאתר לצורך ניתוח ובכך מונעת את השפעות הזמן וההפשרה ההקפאה על תכונותיהן של דגימות ביולוגיות אלה.
במחקר זה, 8 פתרונות של תחמוצת פוליאתילן MDa (PEO) בריכוזים שונים (1%-3%) שימשו לאימות טווח המדידה של ריאמטר ספסל מסחרי (טבלת חומרים) והעקומה התלויה בריכוז המתקבלת הושוותה ישירות למדידות שנרכשו עם רומטר מסורתי בתפזורת (טבלת חומרים) ). יכולת החזרה של מדידות ריאולוגיות הוערכה לאחר מכן באמצעות ריר שנקטף ברונכוסקופי מחולה אינטובאטוס הסובל מסטטוס אסתמטיקוס (SA), צורה קיצונית של החמרה באסתמה המאופיינת בברונכוספזם, דלקת אאוזינופילית והיפר-פרודוקציה של ריר בתגובה לחומר סביבתי או זיהומי 8,20 . במקרה זה, חולה ה-SA הוחדר בשל כשל נשימתי חמור ונזקק ל-ECMO (חמצון ממברנה חוץ-גופית) בשל חוסר היכולת לתמוך בחולה ביעילות ובבטחה עם הנשמה מכנית בלבד, למרות טיפולי אסתמה סטנדרטיים אגרסיביים. במהלך ברונכוסקופיה שצוינה קלינית לקריסת לובר, נצפו הפרשות עבות, שקופות ועקשניות שחוסמות את הסמפונות הלובריים ושואפות באמצעות שטיפות מלוחות. מיד לאחר האיסוף, עודף מלח הוסר מהשאיפה והתכונות הוויסקואלסטיות של דגימת ה- SA הנותרת נותחו באמצעות התקן ה- benchtop. דגימות נוספות של אליקוטים טופלו בחומר מחזר, טריס (2-קרבוקסילאתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP), כדי לקבוע אם פרוטוקול זה עשוי לשמש לאפיון יעילות תרכובת טיפולית ex vivo.
התוצאות הראו כי פרוטוקול זה ומכשיר ה- benchtop יכולים לשמש ביעילות במסגרת קלינית. התכונות הריאולוגיות שנקבעו מתוך עקומות תלויות ריכוז PEO (איור 1A) לא היו ניתנות להבחנה בין התקן הספסל הנבדק לבין רומטר לוח מקבילי מסורתי (איור 1B). מדידות משולשות של ריר ה-SA היו ניתנות לחזרה, עם מקדם וריאציה של 10% עבור נקודות הקצה של G*, G' ו-G" ושיקפו את החריגות המשמעותיות בצמיגות הריר שהיו ניכרות קלינית במקרה של מטופל זה (איור 1D). לבסוף, טיפול ב-ex vivo עם TCEP הביא לירידה משמעותית ב-G' וב-G", ולעלייה δ השיזוף, מה שהדגים את ההיענות לטיפול על ידי שינויים ברשת המוצין (איור 2). לסיכום, פרוטוקול זה באמצעות rheometer benchtop מספק גישה פשוטה ויעילה להערכת תכונות ויסקואלסטיות של דגימות ריר המתקבלות מהמרפאה. יכולת זו עשויה לשמש כדי להקל על גישות לרפואה מדויקת לטיפול, שכן קלינאים יכולים לבחון את היעילות של תרופות ריריות מאושרות באתר, מה שיכול לסייע בזיהוי אפשרויות טיפול חלופיות. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש בניסויים קליניים כדי לבחון את ההשפעות של תרופות ניסיוניות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

במחלות ריאה חסימתיות(למשל, אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, סיסטיק פיברוזיס) ומצבים נשימתיים אחרים (למשל, זיהומים נגיפיים/חיידקיים), תכונות ביופיזיות של ריר משתנות על ידי היפר-סקרציה של תאי גביע, התייבשות דרכי הנשימה, עקה חמצונית ונוכחות של דנ"א חוץ-תאי. מחקרים קודמים הראו כי כיח צמיגות נמצא בקורלציה עם תפקוד ריאתי וכי טיפולים המשפיעים על ריאולוגיה של כיח (למשל, רירית) יכולים להביא ליתרונות קליניים יוצאי דופן. באופן כללי, מדידות ריאולוגיות של נוזלים שאינם ניוטוניים משתמשות בגישות משוכללות שגוזלות זמן רב (למשל, רהומטרים מקבילים/לוחות חרוט ו/או מעקב אחר חלקיקי מיקרובאד) הדורשות אימון נרחב כדי לבצע את הבדיקה ולפרש את הנתונים. מחקר זה בחן את האמינות, יכולת השכפול והרגישות של Rheomuco, מכשיר ספסל ידידותי למשתמש שנועד לבצע מדידות מהירות באמצעות תנודה דינמית עם טאטוא זן גזירה כדי לספק מודולי ויסקואלסטיים ליניאריים (G', G", G*, ו-tan δ) ומאפייני נקודת ג'ל (γc ו-σc) עבור דגימות קליניות תוך 5 דקות. ביצועי המכשיר אומתו באמצעות ריכוזים שונים של סימולנט ריר, 8 תחמוצת פוליאתילן MDa (PEO), ובניגוד למדידות ריאולוגיות מסורתיות בתפזורת. מבודד קליני שנקטף מחולה אינטובאט עם סטטוס אסתמטיקוס (SA) הוערך לאחר מכן במדידות משולשות ומקדם השונות בין המדידות הוא <10%. השימוש ב-Ex vivo בחומר חזק להפחתת ריר, TCEP, על ריר SA הביא לירידה של פי חמישה במודולוס האלסטי ולשינוי לכיוון התנהגות "דמוית נוזל" יותר באופן כללי (למשל, δ שיזוף גבוהים יותר). יחד, תוצאות אלה מראות כי מד הספסל שנבדק יכול לבצע מדדים אמינים של צמיגות ריריות במסגרות קליניות ומחקריות. לסיכום, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי לחקור את ההשפעות של תרופות ריריות (למשל, rhDNase, N-אצטיל ציסטאין) באתר כדי להתאים את הטיפול על בסיס כל מקרה לגופו, או במחקרים פרה-קליניים של תרכובות חדשות.

איור 1 מראה את הדיוק ואת יכולת החזרה של מדידות ריאולוגיות באמצעות עקומות תלויות ריכוז של שליטה ויסקואלסטית, כלומר, תמיסת תחמוצת פוליאתילן (PEO) וסטטוס אסתמטיקוס (SA) ריר. מדידות של מאפיינים ויסקואלסטיים של 8 MDa PEO בחמישה ריכוזים שונים (1%, 1.5%, 2%, 2.5% ו-3%) הושוו ישירות בין ריאמטר הספס?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

התכונות הוויסקואלסטיות של הריר ממלאות תפקיד קריטי בפינוי הריריות. עם זאת, טכניקות ריאולוגיות מסורתיות של ריר דורשות גישות מורכבות וגוזלות זמן. מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימוש ברומטר ספסל שיכול לבצע במהירות ובאמינות מדידות ויסקואלסטיות.

אפיון ויסקואלסטי מהיר של ריר דרכי הנשימה באמצעות רומטר בנצ'טופ

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

מחלות חסימתיות ריריות מאופיינות בצמיגות לא תקינה של ריר דרכי הנשימה. הפרוטוקול מראה כיצד להשתמש בריאולוגיה כדי לכמת צמיגות ריר ולנתח נתונים כדי לבחון טיפולים המכוונים לריר. ריאולוגיה של ריר מספקת סמנים ביולוגיים כמותיים ספציפיים.שימוש בהתקן ספסל מפשט מאוד את הלוגיסטיקה של מדידת סמנים ביולוגיים אלה בדגימות קליניות כמו דגימות כיח אנושיות. השימוש בריאולוגיה של ריר ככלי אבחון למחלות חסימתיות הוא עדיין אתגר. גוף הולך וגדל של ראיות מראה מתאם חזק בין תכונות ריאולוגיות, דלקת וזיהום חיידקי.ריר תמיד נוכח בממשק הגוף שבו הוא משמן וממלא תפקיד מגן. ניתן ליישם ריאולוגיה של ריר על מערכות אחרות כמו מסלולי מערכת העיכול ואיברי המין. כדי להשיג מדידות מדויקות, טיפול נכון ומיקום של המדגם הוא קריטי.הדגמה חזותית יכולה לשפר את הדיוק של בדיקה זו. מי שיוכיח את ההליך הזה יהיה קנדל שאפר, טכנאי מחקר ממעבדת האוויר. התחילו במיון כיח דרכי הנשימה שנאסף או ריר בכוסות דגימה סטריליות.במקרה של כיח, יש להסיר רוק עודף מהדגימה מיד עם האיסוף. הניחו את הדגימות על קרח לצורך הובלה. הגבל את זמן ההובלה לפחות מארבע שעות.לנתח את הדגימות בזמן האיסוף. הומוגניזציה של הריר על ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים עם פיפטת תזוזה חיובית. או פיפטה ישירות לתוך צינורות microcentrifuge.אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד. Aliquot הדגימות לאחסון בכמויות גדולות או שוות ערך ל-500 מיקרוליטרים כדי להבטיח נפח מספיק לניסויים. לפני ההצמדה, פיפטה כיח טרי וקפוא או ריר ישירות או הומוגני דגימות.לתקן את האליקוטים הנדרשים למדידות וטיפולים חוזרים. דגירו את האליקוטים לבדיקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפחות לפני המדידה. לבדיקת סוכנים פרמקולוגיים, השתמש בריכוזים גבוהים של פתרונות מלאי כדי למנוע דילול דגימה.הוסף בין 1% ל -10% נפח של המגיב הרצוי ישירות על המדגם. וודאו שאף טיפה של התרכובת לא נשארת בצד הצינור. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הנדרש, כדי לאפשר תגובה כימית.ערבבו את דגימת הריר והריאגנט על ידי הסטת החלק התחתון של צינור המיקרוצנטריפוגה כל שתי דקות כדי לאפשר חדירה הדרגתית של המגיב לתוך דגימת הריר מבלי להתפשר על רשת המוצין. כאשר משווים מספר ריאגנטים לתרופות, ודא שזמן הדגירה דומה. הפעל את המחשב ואתחל את התוכנה.בחר מדידה חדשה. הזן את מספר הזיהוי לדוגמה תחת מזהה מדידה ואת שם המפעיל תחת מפעיל כדי להמשיך. הזן מידע נוסף או הערות תחת הערות.בחרו סט גיאומטריה ובדקו היטב לוחות גדולים וקטנים, כדי לוודא שהלוחות נקיים ובמצב מושלם. הכנס את הצלחת הגדולה בחוזקה על הדוכן התחתון. הכניסו את הצלחת הקטנה בעדינות לדוכן העליון ונעלו את הצלחת בסיבוב קל עד לשמיעת לחיצה, מה שמעיד על כך שהצלחת מהודקת כראוי.שים לב שהתנודה החופשית של הלוח העליון היא נורמלית. המתן עד שהטמפרטורה תגיע לערך היעד של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הפעל כיול אוטומטי, כפי שהתבקש על ידי התוכנה.באמצעות פיפטה תזוזה חיובית, לאט לאט pipette בין 250 ל 500 microliters של הדגימה על מרכז הלוח התחתון הגדול. לאחר הפקדתם על הצלחת, דגימות צמיגות יאמצו צורת כיפה, בעוד שדגימות אלסטיות מאוד עשויות לדרוש ניתוק פיזי. הנמיכו את ראש המדידה הנושא את הצלחת הקטנה באמצעות התוכנה והתבוננו בדגימה.אם תועמס כראוי על הלוח התחתון, הדגימה תיצור מגע ותהיה ממורכזת בין שתי הלוחות. כדי להבטיח שהמדגם ימלא את הפער, השתמש בפונקציית הפער המופחתת עד שהמדגם כבר לא יהיה בצורת דו-קונקיה או מיושר עם קצה הלוח. פונקציית הפער המופחת מורידה את קצה המדידה במרווחים של 0.1 מילימטר ומוגבלת ל-7 דרגות.אם נותר פער לאחר 7 ההפרשים, לחץ על התקנת ביצוע חוזר כדי לחזור למיקום ההתחלתי ולהתאים את מיקום הדגימה ואת עוצמת הקול שלה. אם הפער מצטמצם ביותר, הסר את הדגימה העודפת עם מרית על ידי תנועה מעגלית לאורך קצה הלוח העליון. קצצו את הדגימה העודפת בעדינות כדי למנוע לחץ גזירה.הנמיכו את כיסוי המגן כדי למנוע הקרנה מקרית של נוזלים מזוהמים במהלך תנודה. כדי להתחיל מדידה, לחץ על התחל ניתוח. מחזור שלם ייקח ארבע עד שבע דקות.הימנעו מלדבר בקול רם ולגעת במכשיר או בספסל לאורך כל המחזור. סביבה שקטה היא קריטית בשתי הדקות הראשונות. לאחר השלמת המחזור, לחץ לצד להרים את ראש המדידה וצור את דוח ניתוח הדגימה.לאחר שראש המדידה נסוג לחלוטין, הרימו את כיסוי המגן. השליכו את הדגימה והסירו בזהירות את הצלחות. נקו וחטאו את הצלחות באמצעות מים חמים וסבון.המאפיינים הוויסקואלסטיים של שמונה מגה-דלטון PEO נמדדו בחמישה ריכוזים והושוו ישירות בין ריאמטר הספסל המוערך לבין רומטר בתפזורת מסורתי. בניגוד לתמיסות PEO, ליחה מסוג סטטוס אסטמטיקוס מייצגת התנהגות נשלטת אלסטית דמוית מוצק במתח נמוך וכוללת קרוסאובר במתח גבוה. בנוסף, מדידות משולשות שבוצעו בתמיסת PEO של 1.5% ומדגם ליחה של בדיקה קלינית, אישרו כי מאפיינים ויסקואלסטיים ליניאריים היו ניתנים לחזרה רבה עבור הערכים שהתקבלו מהדגימה הביולוגית.השינויים נמדדו בתכונות הוויסקואלסטיות של הריר לאחר טיפול בחומר רירי. השפעות TCEP על צמיגות ריר הבדיקה נבדקו בסביבה קלינית באמצעות מד הספסל. טיפול בריכוליטי הביא לדגימה דמוית נוזל יותר עם ירידה במודולוס המורכב פי 4.6, מודולוס אלסטי פי 5.1, מודולוס צמיג פי 1.9, מאמץ קרוסאובר פי 3.3 ומתח תשואת קרוסאובר פי 5.7, ועלייה ביחס השיכוך פי 2.8.מדידת צמיגות הריר של דרכי הנשימה בסביבה קלינית בקצב מהיר יכולה לסייע בהתאמת הטיפול בחולים על בסיס כל מקרה לגופו, כמו גם לספק פרוטוקול סטנדרטי לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות חדשניות. טכניקה זו משמשת כיום לבחינת ההשפעות של אפנני CFTR יעילים ביותר על כיח סיסטיק פיברוזיס ולבדיקת העוצמה של תרופות שונות שמטרתן לשנות את תכונות הריר.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Point-of-Care Assay המהיר של יעילות קרישת הדם enoxaparin בכל

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

מדידה אוטומטית של הריאות נפחתו וקטן Airway Remodeling בעכברים שנחשפו לעשן סיגריות

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

הרדמת Airway האקטואלית עבור Awake-אנדוסקופית אינטובציה שימוש הריסוס-as-you-go טכניקה עם זרימת חמצן גבוהה

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

בשנת Vivo הערכה של תכונות מכניות ו Viscoelastic של לשון עכברוש

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

אפיון מחלות במהלך החמצון האוטומטי הנשלט באמצעות מעבר מדרגתי

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

שפופרת נוקשה כחלופה בשליטה על נתיב אווירי בעייתי

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...