Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
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Questo documento è supportato da sovvenzioni di Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) e Research EHRE20XX0 supportato da CFF.

Nel presente studio, i campioni sono stati raccolti durante una broncoscopia clinicamente indicata dopo aver ottenuto il consenso informato in base a un protocollo approvato dal Comitato di revisione istituzionale dell'UNC.
1. Raccolta e conservazione dell'espettorato/muco
<ol><li>Raccogliere il muco delle vie aeree tramite la raccolta dell'espettorato o l'aspirazione per broncoscopia.<ol>
<li>Raccogliere l'espettorato tramite espettorazione spontanea o ind...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. 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K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

Le proprietà viscoelastiche uniche del muco sono essenziali per mantenere le vie aeree sane. Fattori interni ed esterni possono alterare le proprietà biofisiche del muco delle vie aeree, causando complicanze cliniche caratteristiche delle malattie muco-ostruttive. Pertanto, il monitoraggio dei cambiamenti nella viscoelasticità del muco potrebbe essere preso in considerazione durante le valutazioni dello stato della malattia e l'esplorazione di terapie che riducono la viscoelasticità del muco. Studi empirici degli ann...

Le malattie muco-ostruttive delle vie aeree, tra cui l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (FC) e altre condizioni respiratorie, come la polmonite virale e batterica, sono preoccupazioni per la salute prevalenti in tutto il mondo. Mentre la fisiopatologia varia notevolmente tra ogni condizione, una caratteristica chiave comune è la clearance mucociliare anormale. Nei polmoni sani, il muco allinea l'epitelio delle vie aeree per intrappolare le particelle inalate e fornire una barriera fisica contro gli agenti patogeni. Una volta secreto, il muco delle vie aeree, composto da ~ 97,5% di acqua, 0,9% di sale, ~ 1,1% di proteine globulari e ~ 0,5% di mucine, viene gradualmente trasportato verso la glottide dal battito coordinato delle ciglia 1,2. Le mucine sono grandi glicoproteine legate all'O che interagiscono attraverso legami non covalenti e covalenti per fornire le distinte proprietà viscoelastiche del muco, che è necessario per un trasporto efficiente3. I cambiamenti nell'ultrastruttura della rete di mucina causati da alterato trasporto ionico, dispiegamento di mucina, interazioni elettrostatiche, reticolazione o cambiamenti nella composizione possono influenzare significativamente la viscoelasticità del muco e compromettere la clearance mucociliare 4,5. Quindi, identificare i cambiamenti nelle proprietà biofisiche del muco delle vie aeree è essenziale per comprendere la patogenesi della malattia e testare nuovi composti mucoattivi6.
Vari fattori possono portare alla produzione di muco aberrante nei polmoni. Nella BPCO, l'inalazione cronica di fumo di sigaretta innesca l'ipersecrezione del muco a causa della metaplasia delle cellule caliciformi, così come la disidratazione delle vie aeree attraverso la downregulation del canale del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR), causando iperconcentrazione del muco e piccola ostruzione delle vie aeree 7,8. Allo stesso modo, la FC, una malattia genetica associata a mutazioni nel gene CFTR, è caratterizzata dalla produzione di muco viscoso e aderente che è inadeguato per il trasporto 8,9. In breve, la disfunzione CFTR induce l'esaurimento del liquido superficiale delle vie aeree, l'entanglement polimerico della mucina e l'aumento delle interazioni biochimiche, che provocano infiammazione cronica e infezioni batteriche. Inoltre, le cellule infiammatorie intrappolate nel muco statico esacerbano ulteriormente la viscoelasticità del muco aggiungendo un'altra grande molecola, il DNA, nella matrice del gel, peggiorando l'ostruzione delle vie aeree5. Uno dei migliori esempi dell'importanza della reologia del muco sulla salute generale dei polmoni è fornito dall'esempio della DNFase umana ricombinante (rhDNasi) nel trattamento dei pazienti con fibrosi cistica. Gli effetti della rhDNasi sono stati dimostrati per la prima volta ex vivo sull'espettorato espettorato, che ha mostrato una transizione dal muco viscoso a un liquido fluente entropochi minuti 10,11. Studi clinici in pazienti con FC hanno dimostrato che la riduzione della viscoelasticità del muco delle vie aeree con l'inalazione di rhDNasi ha ridotto il tasso di esacerbazioni polmonari e ha migliorato la funzione polmonare e il benessere generale delpaziente 12,13,14. Di conseguenza, l'inalazione di rhDNasi volta a facilitare la clearance è diventata lo standard di cura per i pazienti con FC per più di due decenni. Benefici clinici simili sono stati osservati con l'uso di soluzione salina ipertonica per via inalatoria per l'idratazione del muco nella FC, che è correlata con cambiamenti nelle proprietà reologiche e ha determinato un'accelerazione della clearance mucociliare e un miglioramento della funzione polmonare15,16. Pertanto, un protocollo rapido e affidabile per misurare le proprietà viscoelastiche del muco in contesti clinici è importante per ottimizzare gli approcci terapeutici.
Il reometro da banco qui testato offre un'alternativa rapida e conveniente per eseguire misurazioni viscoelastiche complete di campioni di muco / espettorato. Utilizzando oscillazioni dinamiche con spostamento angolare controllato, lo strumento fornisce la deformazione tramite una coppia di piastre parallele regolabili (ad esempio, geometrie ruvide o lisce) per misurare la coppia e la cilindrata con risoluzioni di 15 nN. m e 150 nm, rispettivamente17. Una calibrazione standardizzata predefinita combinata con le linee guida per l'utente adattate per gli specialisti non reologici consente misurazioni semplici e riduce il rischio di errori dell'operatore. Il dispositivo produce una curva di sweep di deformazione che viene elaborata e analizzata in tempo reale (entro ~ 5 minuti) e fornisce automaticamente sia le caratteristiche viscoelastiche lineari (G', G", G * e tan δ) che del punto gel (γc e σc) (vedere Tabella 1). Il modulo elastico o di stoccaggio (G') descrive come un campione risponde allo stress (cioè la capacità di tornare alla sua forma originale), mentre il modulo viscoso o di perdita (G") descrive l'energia dissipata per ciclo di deformazione sinusoidale (cioè l'energia persa a causa dell'attrito delle molecole). Il modulo complesso o dinamico (G*) è il rapporto tra sollecitazione e deformazione, che descrive la quantità di accumulo di forza interna in risposta a uno spostamento di taglio (cioè le proprietà viscoelastiche complessive). Il fattore di smorzamento (tan δ) è il rapporto tra il modulo viscoso e il modulo elastico, che indica la capacità di un campione di dissipare energia (cioè un basso tan δ indica un comportamento elastico-dominante / solido, mentre un alto tan δ indica un comportamento viscoso-dominante / liquido-simile). Per le caratteristiche del punto gel, la deformazione crossover (γc) è la misura della deformazione di taglio, calcolata dal rapporto tra il percorso di deflessione e l'altezza del gap di taglio, alla quale il campione passa da un comportamento simile a un solido a un comportamento simile a un liquido e si verifica, per definizione, a deformazione di oscillazione dove G' = G" o tan δ = 1. La tensione di snervamento crossover (σc) è una misura della quantità di sollecitazione applicata dal dispositivo a cui si incrociano i moduli elastici e viscosi. Nella sputa sana, l'elasticità domina la risposta meccanica allo sforzo (G' > G"). Nelle malattie muco-ostruttive, sia G' che G" aumentano a seguito di cambiamenti patologici del muco 17,18,19. La semplicità operativa del dispositivo facilita le misurazioni in loco ed elude la necessità di stoccaggio/trasporto/spedizione dei campioni a una struttura fuori sede per l'analisi, evitando così gli effetti di tempo e congelamento-disgelo sulle proprietà di questi campioni biologici.
In questo studio, 8 soluzioni di ossido di polietilene (PEO) MDa di diverse concentrazioni (1%-3%) sono state utilizzate per convalidare il campo di misura di un reometro da banco commerciale (Table of Materials) e la curva concentrazione-dipendente ottenuta è stata confrontata direttamente con le misurazioni acquisite con un reometro di massa tradizionale (Table of Materials ). La ripetibilità delle misurazioni reologiche è stata quindi valutata utilizzando muco raccolto per via broncoscopica da un paziente intubato affetto da stato asmatico (SA), una forma estrema di esacerbazione dell'asma caratterizzata da broncospasmo, infiammazione eosinofila e iperproduzione di muco in risposta a un agente ambientale o infettivo 8,20 . In questo caso, il paziente SA era stato intubato per grave insufficienza respiratoria e aveva richiesto ECMO (ossigenazione extracorporea a membrana) a causa dell'incapacità di supportare il paziente in modo efficace e sicuro con la sola ventilazione meccanica, nonostante le aggressive terapie standard per l'asma. Durante una broncoscopia clinicamente indicata per il collasso lobare, secrezioni spesse, chiare e tenaci sono state notate per ostruire i bronchi lobari e sono state aspirate con lavaggi salini. Immediatamente dopo la raccolta, la soluzione salina in eccesso è stata rimossa dall'aspirato e le proprietà viscoelastiche del campione SA rimanente sono state analizzate utilizzando il dispositivo da banco. Ulteriori aliquote del campione sono state trattate con un agente riducente, tris (2-carbossiletil) fosfina cloridrato (TCEP), per determinare se questo protocollo potrebbe essere utilizzato per caratterizzare l'efficacia del composto terapeutico ex vivo.
I risultati hanno mostrato che questo protocollo e il dispositivo da banco possono essere utilizzati efficacemente in ambito clinico. Le proprietà reologiche determinate dalle curve dipendenti dalla concentrazione di PEO (Figura 1A) erano indistinguibili tra il dispositivo da banco testato e un reometro tradizionale a piastre parallele (Figura 1B). Le misurazioni triplicate del muco SA erano ripetibili, con un coefficiente di variazione del 10% per gli endpoint G*, G' e G" e riflettevano le anomalie sostanziali nella viscoelasticità del muco che erano clinicamente evidenti nel caso di questo paziente (Figura 1D). Infine, il trattamento ex vivo con TCEP ha comportato una significativa riduzione di G' e G" e un aumento dell'abbronzatura δ, dimostrando la reattività al trattamento mediante alterazioni della rete mucina (Figura 2). In conclusione, questo protocollo che utilizza un reometro da banco fornisce un approccio semplice ed efficace per valutare le proprietà viscoelastiche dei campioni di muco ottenuti dalla clinica. Questa capacità può essere utilizzata per facilitare gli approcci di medicina di precisione alla cura, in quanto i medici possono testare l'efficacia dei farmaci mucoattivi approvati in loco, che possono aiutare a identificare opzioni di trattamento alternative. Inoltre, questo approccio può essere utilizzato negli studi clinici per esaminare gli effetti dei farmaci sperimentali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

Nelle malattie polmonari muco-ostruttive (ad esempio, asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, fibrosi cistica) e in altre condizioni respiratorie (ad esempio, infezioni virali / batteriche), le proprietà biofisiche del muco sono alterate dall'ipersecrezione delle cellule caliciformi, dalla disidratazione delle vie aeree, dallo stress ossidativo e dalla presenza di DNA extracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che la viscoelasticità dell'espettorato è correlata alla funzione polmonare e che i trattamenti che influenzano la reologia dell'espettorato (ad esempio, i mucolitici) possono portare a notevoli benefici clinici. In generale, le misurazioni reologiche di fluidi non newtoniani impiegano approcci elaborati e dispendiosi in termini di tempo (ad esempio, reometri paralleli / cone-plate e / o tracciamento delle particelle di microsfere) che richiedono una formazione approfondita per eseguire il test e interpretare i dati. Questo studio ha testato l'affidabilità, la riproducibilità e la sensibilità di Rheomuco, un dispositivo da banco di facile utilizzo progettato per eseguire misurazioni rapide utilizzando l'oscillazione dinamica con una sweep di taglio-deformazione per fornire moduli viscoelastici lineari (G', G", G * e δ di abbronzatura) e caratteristiche del punto gel (γc e σc) per campioni clinici entro 5 minuti. Le prestazioni del dispositivo sono state convalidate utilizzando diverse concentrazioni di un simulante di muco, 8 MDa ossido di polietilene (PEO) e rispetto alle tradizionali misurazioni di reologia di massa. Un isolato clinico prelevato da un paziente intubato con stato asmatico (SA) è stato quindi valutato in misurazioni triplicate e il coefficiente di variazione tra le misurazioni è <10%. L'uso ex vivo di un potente agente riducente del muco, TCEP, sul muco SA ha comportato una diminuzione di cinque volte del modulo elastico e un cambiamento verso un comportamento più "liquido" in generale (ad esempio, una maggiore δ di abbronzatura). Insieme, questi risultati dimostrano che il reometro da banco testato può effettuare misurazioni affidabili della viscoelasticità del muco in contesti clinici e di ricerca. In sintesi, il protocollo descritto potrebbe essere utilizzato per esplorare gli effetti dei farmaci mucoattivi (ad esempio, rhDNasi, N-acetil cisteina) in loco per adattare il trattamento caso per caso o in studi preclinici di nuovi composti.

La Figura 1 mostra l'accuratezza e la ripetibilità delle misurazioni reologiche utilizzando curve dipendenti dalla concentrazione del controllo viscoelastico, cioè soluzione di ossido di polietilene (PEO) e stato asmatico (SA) muco. Le misurazioni delle caratteristiche viscoelastiche di 8 MDa PEO a cinque diverse concentrazioni (1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3%) sono state confrontate direttamente tra il reometro da banco valutato e un reometro sfuso tradizionale (Table of Materials</strong...

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Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Le proprietà viscoelastiche del muco svolgono un ruolo fondamentale nella clearance mucociliare. Tuttavia, le tecniche reologiche tradizionali del muco richiedono approcci complessi e dispendiosi in termini di tempo. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'uso di un reometro da banco in grado di eseguire in modo rapido e affidabile misurazioni viscoelastiche.

Caratterizzazione viscoelastica rapida del muco delle vie aeree utilizzando un reometro da banco

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Le malattie muco-ostruttive sono caratterizzate da viscosità anormale del muco delle vie aeree. Il protocollo mostra come utilizzare la reologia per quantificare la viscosità del muco e analizzare i dati per testare i trattamenti mirati al muco. La reologia del muco fornisce biomarcatori quantitativi specifici.L'utilizzo di un dispositivo da banco semplifica notevolmente la logistica della misurazione di questi biomarcatori in campioni clinici come campioni di espettorato umano. L'uso della reologia del muco come strumento di diagnosi per le malattie ostruttive è ancora una sfida. Un numero crescente di prove mostra una forte correlazione tra proprietà reologiche, infiammazione e infezione batterica.Il muco è sempre presente nell'interfaccia corporea dove lubrifica e svolge un ruolo protettivo. La reologia del muco può essere applicata ad altri sistemi come le tracce gastrointestinali e genitali. Per acquisire misurazioni accurate, è fondamentale la corretta gestione e il posizionamento del campione.Una dimostrazione visiva può migliorare la precisione di questo test. A dimostrare questa procedura sarà Kendall Shaffer, un tecnico di ricerca del laboratorio aereo. Inizia ordinando l'espettorato o il muco delle vie aeree raccolti in tazze di campioni sterili.Nel caso dell'espettorato, rimuovere la saliva in eccesso dal campione immediatamente dopo la raccolta. Posizionare i campioni sul ghiaccio per il trasporto. Limitare il tempo di trasporto a meno di quattro ore.Analizzare i campioni al momento della raccolta. Omogeneizzare il muco tubando delicatamente su e giù da tre a cinque volte con una pipetta a spostamento positivo. O pipettare direttamente nei tubi microcentrifuga.Conservare i campioni a 80 gradi Celsius fino a quando non vengono elaborati. Aliquotare i campioni per la conservazione in volumi maggiori o uguali a 500 microlitri per garantire un volume sufficiente per gli esperimenti. Prima dell'aliquotazione, pipettare direttamente l'espettorato o il muco fresco e congelato o omogeneizzare i campioni.Riparare le aliquote richieste per misurazioni e trattamenti ripetuti. Incubare le aliquote da testare a 37 gradi Celsius per almeno cinque minuti prima della misurazione. Per testare gli agenti farmacologici, utilizzare alte concentrazioni di soluzioni stock per prevenire la diluizione del campione.Aggiungere tra l'1% e il 10% del volume del reagente desiderato direttamente sul campione. Assicurarsi che nessuna goccia del composto rimanga sul lato del tubo. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per il periodo di tempo richiesto, per consentire una reazione chimica.Mescolare il campione di muco e il reagente facendo scorrere il fondo della provetta di microcentrifuga ogni due minuti per consentire la progressiva penetrazione del reagente nel campione di muco senza compromettere la rete di mucina. Quando si confrontano più reagenti farmacologici, assicurarsi che il tempo di incubazione sia simile. Accendere la macchina e inizializzare il software.Selezionare una nuova misurazione. Immettere il numero di identificazione del campione in ID misura e il nome dell'operatore in Operatore per continuare. Immettere ulteriori informazioni o commenti in Commenti.Selezionare un set di geometrie e ispezionare attentamente piastre grandi e piccole, per assicurarsi che le piastre siano pulite e in perfette condizioni. Inserire saldamente la grande piastra sul pulpito inferiore. Inserire delicatamente la piccola piastra sul pulpito superiore e bloccare la piastra ruotando leggermente fino a sentire un clic, il che indica che la piastra è correttamente bloccata.Si noti che l'oscillazione libera della piastra superiore è normale. Attendere che la temperatura raggiunga il valore target di 37 gradi Celsius. Quindi avviare la calibrazione automatica, come richiesto dal software.Utilizzando una pipetta a spostamento positivo, pipettare lentamente tra 250 e 500 microlitri del campione al centro della grande piastra inferiore. Una volta depositati sulla piastra, i campioni viscosi adotteranno una forma a cupola, mentre i campioni altamente elastici possono richiedere il taglio fisico. Abbassare la testa di misura che trasporta la piccola piastra tramite il software e osservare il campione.Se caricato correttamente sulla piastra inferiore, il campione entrerà in contatto e sarà centrato tra le due piastre. Per garantire che il campione riempia il vuoto, utilizzare la funzione di gap ridotto fino a quando il campione non è più nella forma biconcava o allineato con il bordo della piastra. La funzione di gap ridotto abbassa il bordo di misura con incrementi di 0,1 millimetri ed è limitata a 7 incrementi.Se rimane uno spazio vuoto dopo i 7 incrementi, fare clic su Ripeti installazione per tornare alla posizione iniziale e regolare la posizione e il volume del campione. Se lo spazio è estremamente ridotto, rimuovere il campione in eccesso con una spatola con un movimento circolare lungo il bordo della piastra superiore. Tagliare delicatamente il campione in eccesso per evitare stress da taglio.Abbassare il coperchio protettivo per evitare qualsiasi proiezione accidentale di fluidi contaminati durante l'oscillazione. Per avviare la misurazione, fare clic su Avvia analisi. Un intero ciclo richiederà da quattro a sette minuti.Evitare di parlare ad alta voce e toccare il dispositivo o il banco durante l'intera durata del ciclo. Un ambiente tranquillo è fondamentale per i primi due minuti. Una volta completato il ciclo, fare clic su Avanti per sollevare la testa di misurazione e generare il rapporto di analisi del campione.Una volta che la testa di misurazione è completamente retratta, sollevare il coperchio protettivo. Scartare il campione e rimuovere con cura le piastre. Pulire e disinfettare le piastre con acqua tiepida e sapone.Le caratteristiche viscoelastiche di otto megadalton PEO sono state misurate a cinque concentrazioni e confrontate direttamente tra il reometro da banco valutato e un reometro sfuso tradizionale. In contrasto con le soluzioni PEO, lo stato asmatico del muco rappresenta un comportamento dominato elastico simile a un solido a basso sforzo e presenta un crossover ad alto sforzo. Inoltre, le misurazioni triplicate eseguite in soluzione di PEO all'1,5% e campione di muco del saggio clinico, hanno confermato che le caratteristiche viscoelastiche lineari erano altamente ripetibili per i valori ottenuti dal campione biologico.Sono stati misurati cambiamenti nelle proprietà viscoelastiche del muco dopo il trattamento con un agente mucolitico. Gli effetti del TCEP sulla viscoelasticità del muco sono stati testati in un ambiente clinico utilizzando il reometro da banco. Il trattamento mucolitico ha portato a un campione più fluido con una diminuzione del modulo complesso di 4,6 volte, modulo elastico di 5,1 volte, modulo viscoso di 1,9 volte, deformazione crossover di 3,3 volte e stress di snervamento crossover di 5,7 volte e un aumento del rapporto di smorzamento di 2,8 volte.Misurare la viscoelasticità del muco delle vie aeree in un ambiente clinico frenetico può aiutare a personalizzare il trattamento dei pazienti caso per caso, oltre a fornire un protocollo standardizzato per testare nuovi composti farmacologici. Questa tecnica è attualmente utilizzata per esaminare gli effetti di modulatori CFTR altamente efficaci sull'espettorato della fibrosi cistica e per testare la potenza di vari farmaci volti ad alterare le proprietà del muco.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

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There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

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There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

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Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

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Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

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Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

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