Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Dette dokumentet støttes av tilskudd fra Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) og CFF-støttet Research EHRE20XX0.

I den nåværende studien ble det samlet inn prøver under en klinisk indikert bronkoskopi etter å ha innhentet informert samtykke i henhold til en protokoll godkjent av UNC Institutional Review Board.
1. Sputum / slim samling og lagring
<ol><li>Samle airway slim via sputum samling eller bronkoskopi aspirasjon.<ol>
<li>Samle sputum enten via spontan ekspektorasjon eller indusere sputum med 3% hypertonisk saltvannsinhalasjon. Alternativt kan du direkte aspi...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus,+mucins,+and+cystic+fibrosis.">Mucus, mucins, and cystic fibrosis.</a> Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).</li><li>Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Human+Airway+Mucus.">Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus.</a> Physiological Reviews. , (2022).</li><li>Lin, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+mucus+viscosity+and+airway+dehydration+impact+COPD+airway+clearance.">Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance.</a> European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li><li>Tomaiuolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+improve+the+clinical+evaluation+of+cystic+fibrosis+patients+by+mucus+viscoelastic+properties.">A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties.</a> PloS One. 9 (1), 82297 (2014).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).</li><li>Zahm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+in+vitro+effect+of+recombinant+human+DNase+on+rheological+and+transport+properties+of+cystic+fibrosis+respiratory+mucus.">Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus.</a> The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).</li><li>Fuchs, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aerosolized+recombinant+human+DNase+on+exacerbations+of+respiratory+symptoms+and+on+pulmonary+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.+The+Pulmozyme+Study+Group.">Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group.</a> The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).</li><li>Hubbard, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+study+of+aerosolized+recombinant+human+deoxyribonuclease+I+in+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis.</a> The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).</li><li>Shak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolized+recombinant+human+DNase+I+for+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis.</a> Chest. 107, 65-70 (1995).</li><li>Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+sputum+rheology+correlates+with+both+acute+and+longitudinal+changes+in+lung+function.">Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function.</a> Chest. 154 (2), 370-377 (2018).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+plugs+in+patients+with+asthma+linked+to+eosinophilia+and+airflow+obstruction.">Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+inhaled+mucolytic+to+treat+airway+muco-obstructive+diseases.">An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cystic+fibrosis+airway+cells+with+CFTR+modulators+reverses+aberrant+mucus+properties+via+hydration.">Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration.</a> The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).</li><li>Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+transport+properties+of+airway+secretions+in+cystic+fibrosis-relationships+with+the+degree+of+infection+and+severity+of+the+disease.">Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease.</a> European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+controlling+mucociliary+frequency+and+respiratory+mucus+transport.">Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport.</a> Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).</li><li>Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

De unike viskoelastiske egenskapene til slim er avgjørende for å opprettholde sunne luftveier. Interne og eksterne faktorer kan endre luftveis slimbiofysiske egenskaper, noe som forårsaker kliniske komplikasjoner som er karakteristiske for slim-obstruktive sykdommer. Derfor kan overvåking av endringer i slimviskoelastisitet vurderes under vurderinger av sykdomsstatus og utforskning av terapier som reduserer slimviskoelastisitet. Empiriske studier fra 1980-tallet viste en sterk sammenheng mellom slimreologi og luftvei...

Muco-obstruktive luftveissykdommer, inkludert astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), cystisk fibrose (CF) og andre respiratoriske tilstander, som viral og bakteriell lungebetennelse, er utbredte helseproblemer over hele verden. Mens patofysiologien varierer sterkt mellom hver tilstand, er en vanlig nøkkelfunksjon unormal mucociliary clearance. I sunne lunger linjer slim luftveisepitelet for å fange inhalerte partikler og gi en fysisk barriere mot patogener. Når det er utskilt, blir luftveisslim, sammensatt av ~ 97,5% vann, 0,9% salt, ~ 1,1% kuleformede proteiner og ~ 0,5% mucins, gradvis transportert mot glottis ved koordinert juling av cilia 1,2. Mucins er store O-koblede glykoproteiner som samhandler via ikke-kovalente og kovalente bindinger for å gi de distinkte viskoelastiske egenskapene til slim, som kreves for effektiv transport3. Endringer i ultrastruktur av mucinnettverket forårsaket av endret iontransport, mucin utfoldelse, elektrostatiske interaksjoner, krysskobling eller endringer i sammensetningen kan påvirke slimviskoelastisiteten betydelig og svekke mukopiliarclearance 4,5. Derfor er identifisering av endringer i de biofysiske egenskapene til luftveisslim avgjørende for å forstå sykdomspatogenese og teste nye mukoaktive forbindelser6.
Ulike faktorer kan føre til produksjon av avvikende slim i lungene. Ved KOLS utløser kronisk innånding av sigarettrøyk slimhyperseretion som følge av begercellemetasi, samt luftveisdehydrering via nedregulering av den cystiske fibrosetransmembrane ledningsregulatoren (CFTR) -kanalen, forårsaker slim hyperkonsentrasjon og liten luftveisobstruksjon 7,8. På samme måte er CF, en genetisk lidelse forbundet med mutasjoner i CFTR-genet, preget av produksjon av viskøs, tilhengerslim som er utilstrekkelig for transport 8,9. Kort sagt, CFTR dysfunksjon induserer luftveier overflate væske uttømming, polymer mucin innvikling, og økt biokjemisk interaksjoner, noe som resulterer i kronisk betennelse og bakterielle infeksjoner. I tillegg forverrer inflammatoriske celler fanget i statisk slim ytterligere viscoelasticity av slim ved å legge til et annet stort molekyl, DNA, inn i gelmatrisen, forverre luftveisobstruksjon5. Et av de beste eksemplene på betydningen av slimreologi på lungenes generelle helse er gitt av eksempelet på rekombinant human DNFase (rhDNase) i behandlingen av cystiske fibrosepasienter. Effektene av rhDNase ble først demonstrert ex vivo på eksorated sputum, som viste en overgang fra viskøs slim til en flytende væske i løpet av minutter10,11. Kliniske studier hos CF-pasienter viste at reduksjon av luftveisslim viskoelastisitet med rhDNase-innånding reduserte frekvensen av lungeforverringer, og forbedret lungefunksjon og generell pasienttilpasning 12,13,14. Som et resultat ble rhDNase-innånding med sikte på å lette clearance standarden for omsorg for CF-pasienter i mer enn to tiår. Lignende kliniske fordeler ble observert ved bruk av inhalert hypertonisk saltvann for slimhydrering i CF, som korrelerte med endringer i reologiske egenskaper og resulterte i mukociliær clearance akselerasjon og forbedret lungefunksjon15,16. Derfor er en rask og pålitelig protokoll for å måle slimviskoelastiske egenskaper i kliniske omgivelser viktig for å optimalisere terapeutiske tilnærminger.
Benkeplatens reometertestet heri gir et raskt og praktisk alternativ for å utføre omfattende viskoelastiske målinger av slim/ sputumprøver. Ved hjelp av dynamiske svingninger med kontrollert vinkelforskyvning gir instrumentet deformasjon via et par justerbare parallelle plater (f.eks. grove eller glatte geometrier) for å måle dreiemomentet og forskyvningen med oppløsninger på 15 nN. henholdsvis m og 150nm. En standardisert kalibrering kombinert med brukerretningslinjer tilpasset ikke-reologispesialister gir enkel måling og reduserer risikoen for operatørfeil. Enheten produserer en strekksveipkurve som behandles og analyseres i sanntid (innen ~5 min) og gir automatisk både lineære viskoelastiske (G', G", G*, og tan δ) og gelpunktegenskaper (γc og σc) (se tabell 1). Den elastiske eller lagringsmodulus (G') beskriver hvordan en prøve reagerer på stress (dvs. evnen til å gå tilbake til sin opprinnelige form), mens viskøs eller tap modulus (G") beskriver energien dissipated per syklus av sinusformet deformasjon (dvs. energien tapt på grunn av friksjon av molekyler). Den komplekse eller dynamiske modulusen (G*) er forholdet mellom stress og belastning, som beskriver mengden intern kraftoppbygging som svar på en skjæreforskyvning (dvs. de generelle viskoelastiske egenskapene). Dempingsfaktoren (brunfarge δ) er forholdet mellom det viskøse moduluset og det elastiske moduluset, som indikerer en prøves evne til å spre energi (dvs. en lav brunfarge δ indikerer en elastisk dominerende / solid-lignende oppførsel, mens en høy brunfarge δ indikerer en viskøs-dominerende / væskelignende oppførsel). For gelpunktegenskaper er crossoverstammen (γc) målet på skjærstammen, beregnet av forholdet mellom avbøyningsbanen og skjærgaphøyden, hvor prøven går fra en solid-lignende til en væskelignende oppførsel og oppstår per definisjon ved oscillasjonsstamme der G ' = G" eller brunfarge δ = 1. Crossover yield stress (σc) er et mål på mengden stress som påføres av enheten der den elastiske og viskøse moduli krysser. I sunn sputa dominerer elastisitet den mekaniske responsen på belastning (G' > G"). Ved slim-obstruktive sykdommer øker både G' og G" som følge av patologiske slimendringer 17,18,19. Den operative enkelheten til enheten letter målinger på stedet og omgår behovet for prøvelagring / transport / forsendelse til et anlegg utenfor stedet for analyse og dermed unngå tid og fryse-tine effekter på egenskapene til disse biologiske prøvene.
I denne studien ble 8 MDa polyetylenoksid (PEO) løsninger av forskjellige konsentrasjoner (1%-3%) brukt til å validere måleområdet til et kommersielt benkeplate-reometer (Materialfortegnelse) og den oppnådde konsentrasjonsavhengige kurven ble direkte sammenlignet med målinger oppnådd med et tradisjonelt bulkreometer (Tabell over materialer) ). Repeterbarheten av reologiske målinger ble deretter vurdert ved hjelp av bronkoskopisk høstet slim fra en intubert pasient som lider av status astmaticus (SA), en ekstrem form for astmaforverring preget av bronkospasme, eosinofil betennelse og slimhyperproduksjon som svar på et miljø- eller smittsomt middel 820 . I dette tilfellet hadde SA-pasienten blitt intubert for alvorlig åndedrettssvikt og krevde ECMO (ekstrakorporeal membranoksygenering) på grunn av manglende evne til å støtte pasienten effektivt og trygt med mekanisk ventilasjon alene, til tross for aggressive standard astmabehandlinger. Under en klinisk indikert bronkoskopi for lobarkollaps ble tykke, klare, tålmodige sekreter bemerket å hindre lobar bronkier og ble aspirert ved hjelp av saltvannsvask. Umiddelbart etter innsamling ble overflødig saltvann fjernet fra aspireringen, og de viskoelastiske egenskapene til den gjenværende SA-prøven ble analysert ved hjelp av benkplatenheten. Ytterligere prøve aliquots ble behandlet med et reduksjonsmiddel, tris (2-karboksylethyl) fosfinhydroklorid (TCEP), for å avgjøre om denne protokollen kan brukes til å karakterisere terapeutisk sammensatt effekt ex vivo.
Resultatene viste at denne protokollen og benkeplaten kan brukes effektivt i en klinisk setting. De revologiske egenskapene som ble bestemt fra PEO konsentrasjonsavhengige kurver (figur 1A) var uutslettelige mellom den testede benkeplaten og et tradisjonelt parallellplaterometer (figur 1B). Triplikatmålinger av SA-slimet var repeterbare, med en 10 % variasjonskoeffisient for G*-, G- og G-endepunkter og reflekterte de betydelige abnormitetene i slimviskoelastisitet som var klinisk tydelige i denne pasientens tilfelle (figur 1D). Til slutt resulterte ex vivo-behandling med TCEP i en betydelig reduksjon i G' og G", og en økning i brunfarge δ, noe som viste respons på behandlingen ved endringer i mucinnettverket (figur 2). Til slutt gir denne protokollen ved hjelp av et benkeplate-reometer en enkel og effektiv tilnærming for å vurdere viskoelastiske egenskaper til slimprøver hentet fra klinikken. Denne evnen kan brukes til å lette presisjonsmedisinske tilnærminger til omsorg, da klinikere kan teste effekten av godkjente mukoaktive legemidler på stedet, noe som kan bidra til å identifisere alternative behandlingsalternativer. I tillegg kan denne tilnærmingen brukes i kliniske studier for å undersøke effekten av undersøkelsesmedisiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

Ved slim-obstruktive lungesykdommer (f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, cystisk fibrose) og andre luftveissykdommer (f.eks. virus/bakterielle infeksjoner), endres slimbiofysiske egenskaper ved begercellehypersekresjon, luftveisdehydrering, oksidativt stress og tilstedeværelse av ekstracellulært DNA. Tidligere studier viste at sputumviskoelastisitet korrelert med lungefunksjon og at behandlinger som påvirker sputumreologi (f.eks. mukolytika) kan gi bemerkelsesverdige kliniske fordeler. Generelt benytter reologiske målinger av ikke-newtonske væsker forseggjorte, tidkrevende tilnærminger (f.eks. parallelle/kjegleplate-revometere og/eller mikrobeadpartikkelsporing) som krever omfattende opplæring for å utføre analysen og tolke dataene. Denne studien testet påliteligheten, reproduserbarheten og følsomheten til Rheomuco, en brukervennlig stasjonær enhet som er designet for å utføre raske målinger ved hjelp av dynamisk oscillasjon med en skjærstammesveip for å gi lineær viskoelastisk moduli (G', G", G * og tan δ) og gelpunktegenskaper (γc og σc) for kliniske prøver innen 5 min. Enhetens ytelse ble validert ved hjelp av forskjellige konsentrasjoner av et slimsimulerende middel, 8 MDa polyetylenoksid (PEO), og mot tradisjonelle bulkreologimålinger. En klinisk isoler høstet fra en intubert pasient med status astmaticus (SA) ble deretter vurdert i triplikatmålinger og variasjonskoeffisienten mellom målingene er <10%. Ex vivo bruk av et potent slimreduserende middel, TCEP, på SA-slim resulterte i en fem ganger reduksjon i elastisk modulus og en endring mot en mer "væskelignende" oppførsel generelt (f.eks. høyere brunfarge δ). Sammen viser disse resultatene at det testede benkeplatens reometer kan gjøre pålitelige mål på slimviskoelastisitet i kliniske og forskningsmiljøer. Oppsummert kan den beskrevne protokollen brukes til å utforske effekten av mukoaktive legemidler (f.eks. rhDNase, N-acetyl cystein) på stedet for å tilpasse behandlingen fra sak til sak, eller i prekliniske studier av nye forbindelser.

Figur 1 viser nøyaktigheten og repeterbarheten av reologiske målinger ved hjelp av konsentrasjonsavhengige kurver av viskoelastisk kontroll, det vil si polyetylenoksid (PEO)-løsning og status astmaticus (SA) slim. Målinger av viskoelastiske egenskaper ved 8 MDa PEO ved fem forskjellige konsentrasjoner (1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%) ble direkte sammenlignet mellom det evaluerte benkeplatens reometer og et tradisjonelt bulkreometer (Materialtabell). I motsetning til SA-slim va...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

De viskoelastiske egenskapene til slim spiller en kritisk rolle i mucociliary clearance. Imidlertid krever tradisjonelle slim reologiske teknikker komplekse og tidkrevende tilnærminger. Denne studien gir en detaljert protokoll for bruk av et benkeplate-reometer som raskt og pålitelig kan utføre viskoelastiske målinger.

Rask viskoelastisk karakterisering av Airway Mucus ved hjelp av et benkeplate-reometer

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Muco-obstruktive sykdommer er preget av unormal viskositet av luftveisslimet. Protokollen viser hvordan man bruker reologi til å kvantifisere slimviskositet og analysere data for å teste slimmålrettingsbehandlinger. Slimreologi gir spesifikke kvantitative biomarkører.Bruk av en stasjonær enhet forenkler i stor grad logistikken med å måle disse biomarkørene i kliniske prøver som menneskelige sputumprøver. Å bruke slimreologi som diagnoseverktøy for obstruktive sykdommer er fortsatt utfordrende. En økende mengde bevis viser en sterk sammenheng mellom reologiegenskaper, betennelse og bakteriell infeksjon.Slim er alltid til stede på kroppsgrensesnittet der det smører og spiller en beskyttende rolle. Slimreologi kan brukes på andre systemer som mage-tarm- og kjønnsspor. For å oppnå nøyaktige målinger er riktig håndtering og plassering av prøven kritisk.En visuell demonstrasjon kan forbedre presisjonen til denne analysen. Kendall Shaffer, en forskningstekniker fra luftlaboratoriet, demonstrerer denne prosedyren. Begynn med å sortere det oppsamlede luftveissputumet eller slimet i sterile prøvekopper.Ved sputum, fjern overflødig spytt fra prøven umiddelbart ved innsamling. Plasser prøvene på is for transport. Begrens transporttiden til mindre enn fire timer.Analyser eksemplene på innsamlingstidspunktet. Homogeniser slimet ved å pipette forsiktig opp og ned tre til fem ganger med en positiv forskyvningspipette. Eller pipette direkte inn i mikrocentrifuge rørene.Oppbevar prøvene ved 80 grader Celsius til de er behandlet. Aliquot prøvene for lagring i volumer større enn eller lik 500 mikroliter for å sikre tilstrekkelig volum for eksperimenter. Før aliquoting, pipette frisk og frossen sputum eller slim direkte eller homogenisere prøver.Reparer de nødvendige aliquots for gjentatte målinger og behandlinger. Inkuber aliquots som skal testes ved 37 grader Celsius i minst fem minutter før måling. For testing av farmakologiske midler, bruk høye konsentrasjoner av lagerløsninger for å forhindre prøvefortynning.Legg til mellom 1% til 10% volum av ønsket reagens direkte på prøven. Pass på at ingen dråpe av forbindelsen forblir på siden av røret. Inkuber prøvene ved 37 grader Celsius i ønsket tid, for å tillate en kjemisk reaksjon.Bland slimprøven og reagenset ved å flikke bunnen av mikrocentrifugerøret hvert annet minutt for å tillate progressiv penetrasjon av reagenset i slimprøven uten at det går ut over mucinnettverket. Når du sammenligner flere legemiddelreagenser, må du sørge for at inkubasjonstiden er lik. Slå på maskinen og initialiser programvaren.Velg ny måling. Angi prøveidentifikasjonsnummeret under Mål-ID og navnet på operatoren under Operatør for å fortsette. Skriv inn tilleggsinformasjon eller kommentarer under Kommentarer.Velg et geometrisett og inspiser store og små plater nøye, for å sikre at platene er rene og i perfekt stand. Sett den store platen godt inn på den nederste prekestolen. Sett den lille platen forsiktig på øvre prekestol og lås platen ved å rotere litt til du hører et klikk, noe som indikerer at platen er ordentlig klemt.Vær oppmerksom på at fri oscillasjon av overplaten er normalt. Vent til temperaturen når 37 grader Celsius målverdi. Start deretter automatisk kalibrering, som du blir bedt om av programvaren.Ved hjelp av en positiv forskyvningspipette pipetterer du sakte mellom 250 og 500 mikrolitere av prøven på midten av den store bunnplaten. Når de er avsatt på platen, vil viskøse prøver vedta en kuppelform, mens svært elastiske prøver kan kreve fysisk kutting. Senk målehodet med den lille platen via programvaren og følg prøven.Hvis den er riktig lastet på bunnplaten, vil prøven komme i kontakt og være sentrert mellom de to platene. For å sikre at prøven fyller gapet, bruk den reduserte gapfunksjonen til prøven ikke lenger er i bikoncave-formen eller justert etter platens kant. Den reduserte gapfunksjonen senker målekanten i trinn på 0,1 millimeter og er begrenset til 7 trinn.Hvis det gjenstår et mellomrom etter de 7 intervallene, klikker du på Gjør om installasjonen for å gå tilbake til startposisjonen og justere prøvens posisjon og volum. Hvis gapet er overmåte redusert, fjern overflødig prøve med en slikkepott med en sirkulær bevegelse langs kanten av den øvre platen. Trim overflødig prøve forsiktig for å unngå skjærspenning.Senk beskyttelsesdekselet for å unngå utilsiktet projeksjon av forurensede væsker under oscillasjon. For å starte målingen, klikk på Start analyse. En hel syklus vil ta fire til syv minutter.Unngå å snakke høyt og berøre enheten eller benken under hele lengden av syklusen. Et rolig miljø er avgjørende de to første minuttene. Når syklusen er fullført, klikker du ved siden av for å heve målehodet og generere eksempelanalyserapporten.Når målehodet er trukket helt inn, hever du beskyttelsesdekselet. Kast prøven og fjern platene forsiktig. Rengjør og desinfiser platene med varmt vann og såpe.De viskoelastiske egenskapene til åtte megadalton PEO ble målt ved fem konsentrasjoner og direkte sammenlignet mellom det evaluerte benkeplatereometeret og et tradisjonelt bulkreometer. I motsetning til PEO-løsninger representerer status astmaticus slim en solid-lignende elastisk dominert oppførsel ved lav belastning og har en crossover ved høy belastning. I tillegg bekreftet triplikatmålinger utført i 1,5% PEO-løsning og klinisk analyseslimprøve at lineære viskoelastiske egenskaper var svært repeterbare for verdiene oppnådd fra den biologiske prøven.Endringer ble målt i de viskoelastiske egenskapene til slim etter behandling med et mukolytisk middel. TCEP-effekter på analyseslimviskoelastisitet ble testet i en klinisk setting ved hjelp av benkeplatens reometer. Mukolytisk behandling resulterte i en mer væskelignende prøve med en reduksjon i den komplekse modulen med 4,6 ganger, elastisk modulus med 5,1 ganger, viskøs modulus med 1,9 ganger, crossover-belastning med 3,3 ganger og crossover yield stress med 5,7 ganger, og en økning i dempingsforholdet med 2,8 ganger.Måling av luftveis slimviskoelastisitet i en rask klinisk setting kan bidra til å skreddersy pasientenes behandling fra sak til sak, samt gi en standardisert protokoll for testing av nye farmakologiske forbindelser. Denne teknikken brukes for tiden til å undersøke effekten av svært effektive CFTR-modulatorer på cystisk fibrose sputum og for å teste styrken til ulike stoffer rettet mot å endre slimegenskaper.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Rapid Point-of-Care-analysen av Enoksaparin Antikoagulerende Effekt i fullblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Bruke Hele Spytt

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatisert Måling av lungeemfysem og Small Airway Ombygging i sigarettrøyk utsatte Mus

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Aktuelt Airway Anestesi for Awake-endoskopisk Intubasjon Bruke Spray-as-you-go Teknikk med høy Oxygen Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo Evaluering av de mekaniske og viskoelastiske egenskapene til rotte tungen

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Rask evaluering av toksisitet av kjemiske forbindelser bruke sebrafisk embryo

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

Karakterisering av Sickling under kontrollerte automatiserte Deoxygenation med oksygen gradient Ektacytometry

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

Det stive røret som et alternativ i å kontrollere den problematiske luftveien

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Karakterisering av en ny human organotypisk retinal kulturteknikk

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Design og utvikling av en modell for å studere effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose luftveismikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...