Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Эта статья поддерживается грантами Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) и поддерживаемыми CFF исследованиями EHRE20XX0.

В настоящем исследовании образцы были собраны во время клинически показанной бронхоскопии после получения информированного согласия в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом UNC.
1. Сбор и хранение мокроты/слизи
<ol><li>С...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus,+mucins,+and+cystic+fibrosis.">Mucus, mucins, and cystic fibrosis.</a> Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).</li><li>Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Human+Airway+Mucus.">Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus.</a> Physiological Reviews. , (2022).</li><li>Lin, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+mucus+viscosity+and+airway+dehydration+impact+COPD+airway+clearance.">Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance.</a> European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li><li>Tomaiuolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+improve+the+clinical+evaluation+of+cystic+fibrosis+patients+by+mucus+viscoelastic+properties.">A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties.</a> PloS One. 9 (1), 82297 (2014).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).</li><li>Zahm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+in+vitro+effect+of+recombinant+human+DNase+on+rheological+and+transport+properties+of+cystic+fibrosis+respiratory+mucus.">Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus.</a> The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).</li><li>Fuchs, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aerosolized+recombinant+human+DNase+on+exacerbations+of+respiratory+symptoms+and+on+pulmonary+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.+The+Pulmozyme+Study+Group.">Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group.</a> The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).</li><li>Hubbard, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+study+of+aerosolized+recombinant+human+deoxyribonuclease+I+in+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis.</a> The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).</li><li>Shak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolized+recombinant+human+DNase+I+for+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis.</a> Chest. 107, 65-70 (1995).</li><li>Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+sputum+rheology+correlates+with+both+acute+and+longitudinal+changes+in+lung+function.">Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function.</a> Chest. 154 (2), 370-377 (2018).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+plugs+in+patients+with+asthma+linked+to+eosinophilia+and+airflow+obstruction.">Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+inhaled+mucolytic+to+treat+airway+muco-obstructive+diseases.">An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cystic+fibrosis+airway+cells+with+CFTR+modulators+reverses+aberrant+mucus+properties+via+hydration.">Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration.</a> The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).</li><li>Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+transport+properties+of+airway+secretions+in+cystic+fibrosis-relationships+with+the+degree+of+infection+and+severity+of+the+disease.">Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease.</a> European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+controlling+mucociliary+frequency+and+respiratory+mucus+transport.">Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport.</a> Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).</li><li>Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

Уникальные вязкоупругие свойства слизи имеют важное значение для поддержания здоровья дыхательных путей. Внутренние и внешние факторы могут изменять биофизические свойства слизи дыхательных путей, вызывая клинические осложнения, характерные для мукобструктивных заболеваний. Следо...

Мукобструктивные заболевания дыхательных путей, включая астму, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), муковисцидоз (МВ) и другие респираторные заболевания, такие как вирусная и бактериальная пневмония, являются распространенными проблемами со здоровьем во всем мире. В то время как патофизиология сильно варьируется между каждым состоянием, общей ключевой особенностью является аномальный мукоцилиарный клиренс. В здоровых легких слизь выстилает эпителий дыхательных путей, чтобы улавливать вдыхаемые частицы и обеспечивать физический барьер против патогенов. После секретирования слизь дыхательных путей, состоящая из ~ 97,5% воды, 0,9% соли, ~ 1,1% глобулярных белков и ~ 0,5% муцинов, постепенно транспортируется к голосовой щели путем скоординированного биения ресничек 1,2. Муцины представляют собой большие O-связанные гликопротеины, которые взаимодействуют через нековалентные и ковалентные связи для обеспечения отчетливых вязкоупругих свойств слизи, которые необходимы для эффективного транспорта3. Изменения в ультраструктуре муциновой сети, вызванные измененным транспортом ионов, развертыванием муцина, электростатическими взаимодействиями, сшиванием или изменениями в составе, могут значительно влиять на вязкоупругость слизи и ухудшать мукоцилиарный клиренс 4,5. Следовательно, выявление изменений в биофизических свойствах слизи дыхательных путей имеет важное значение для понимания патогенеза заболевания и тестирования новых мукоактивных соединений6.
Различные факторы могут привести к выработке аберрантной слизи в легких. При ХОБЛ хроническое вдыхание сигаретного дыма вызывает гиперсекрецию слизи в результате метаплазии бокаловидных клеток, а также обезвоживание дыхательных путей через понижающую регуляцию канала трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (CFTR), вызывая гиперконцентрацию слизи и небольшую обструкцию дыхательных путей 7,8. Аналогичным образом, CF, генетическое расстройство, связанное с мутациями в гене CFTR, характеризуется производством вязкой, адгезивной слизи, которая недостаточна для транспорта 8,9. Короче говоря, дисфункция CFTR вызывает истощение жидкости на поверхности дыхательных путей, запутывание полимерного муцина и увеличение биохимических взаимодействий, что приводит к хроническому воспалению и бактериальным инфекциям. Кроме того, воспалительные клетки, захваченные в статическую слизь, еще больше усугубляют вязкоупругость слизи, добавляя еще одну большую молекулу, ДНК, в гель-матрицу, ухудшая обструкцию дыхательных путей5. Одним из лучших примеров важности реологии слизи для общего здоровья легких является пример рекомбинантной человеческой DNFase (rhDNase) при лечении пациентов с муковисцидозом. Эффекты rhDNase были впервые продемонстрированы ex vivo на отхаркивающуюся мокроту, которая показала переход от вязкой слизи к текучей жидкости в течение10,11 минут. Клинические испытания у пациентов с муковисцидозом показали, что снижение вязкоупругости слизи дыхательных путей при вдыхании rhDNase снижает частоту легочных обострений и улучшает функцию легких и общее самочувствие пациента 12,13,14. В результате ингаляция rhDNase, направленная на облегчение клиренса, стала стандартом ухода за пациентами с муковисцидозом на протяжении более двух десятилетий. Аналогичные клинические преимущества наблюдались при использовании ингаляционного гипертонического физиологического раствора для гидратации слизи при муковисцидозе, что коррелировало с изменениями реологических свойств и приводило к ускорению мукоцилиарного клиренса и улучшению функции легких15,16. Следовательно, быстрый и надежный протокол измерения вязкоупругих свойств слизи в клинических условиях важен для оптимизации терапевтических подходов.
Настольный реометр, протестированный здесь, предлагает быструю и удобную альтернативу для выполнения комплексных вязкоупругих измерений образцов слизи / мокроты. Используя динамические колебания с контролируемым угловым смещением, прибор обеспечивает деформацию с помощью пары регулируемых параллельных пластин (например, шероховатых или гладких геометрий) для измерения крутящего момента и смещения с разрешением 15 нН. м и 150 нм соответственно17. Стандартизированная калибровка по умолчанию в сочетании с рекомендациями пользователя, адаптированными для специалистов, не являющихся реологами, позволяет проводить простые измерения и снижает риск ошибок оператора. Устройство создает кривую развертки деформации, которая обрабатывается и анализируется в режиме реального времени (в течение ~ 5 мин) и автоматически обеспечивает как линейные вязкоупругие (G', G", G* и δ загара), так и точки геля (γc и σc) характеристики (см. Таблицу 1). Модуль упругости или накопления (G') описывает, как образец реагирует на напряжение (т.е. способность возвращаться к своей первоначальной форме), в то время как модуль вязкости или потерь (G") описывает энергию, рассеиваемую за цикл синусоидальной деформации (т.е. энергию, потерянную из-за трения молекул). Комплексный или динамический модуль (G*) — это отношение напряжения к деформации, которое описывает величину накопления внутренней силы в ответ на сдвиговое смещение (т. е. общие вязкоупругие свойства). Коэффициент демпфирования (тан δ) представляет собой отношение модуля вязкости к модулю упругости, что указывает на способность образца рассеивать энергию (т. Е. Низкий загар δ указывает на упруго-доминантное/твердое поведение, в то время как высокий δ загара указывает на вязко-доминантное/жидкостоподобное поведение). Для характеристик точки геля деформация кроссовера (γc) является мерой деформации сдвига, рассчитанной по отношению пути отклонения к высоте зазора сдвига, при которой образец переходит от твердого к жидкостоподобному поведению и возникает, по определению, при колебательной деформации, где G' = G" или загар δ = 1. Предел текучести кроссовера (σc) представляет собой меру величины напряжения, приложенного устройством, при котором пересекаются модули упругости и вязкости. У здоровой мокроты эластичность доминирует над механической реакцией на деформацию (G' > G). При слизисто-обструктивных заболеваниях как G', так и G" увеличиваются в результате патологических изменений слизи 17,18,19. Эксплуатационная простота устройства облегчает измерения на месте и позволяет обойти необходимость хранения/транспортировки/транспортировки/транспортировки проб на удаленный объект для анализа, что позволяет избежать воздействия времени и замораживания-оттаивания на свойства этих биологических образцов.
В этом исследовании для проверки диапазона измерений коммерческого настольного реометра (Таблица материалов) использовали 8 растворов полиэтиленоксида (ПЭО) различных концентраций (1%-3%), а полученную концентрационно-зависимую кривую непосредственно сравнивали с измерениями, полученными с помощью традиционного объемного реометра (Таблица материалов). ). Затем оценивали повторяемость реологических измерений с использованием бронхоскопически собранной слизи у интубированного пациента, страдающего астматическим статусом (SA), экстремальной формой обострения астмы, характеризующейся бронхоспазмом, эозинофильным воспалением и гиперпроизводством слизи в ответ на экологический или инфекционный агент 8,20 . В этом случае пациент с СА был интубирован для тяжелой дыхательной недостаточности и нуждался в ЭКМО (экстракорпоральная мембранная оксигенация) из-за неспособности эффективно и безопасно поддерживать пациента только с помощью механической вентиляции, несмотря на агрессивные стандартные методы лечения астмы. Во время клинически показанной бронхоскопии для долькового коллапса были отмечены густые, прозрачные, цепкие выделения, обструктирующие дольковые бронхи и аспирированные с использованием солевых промываний. Сразу после сбора излишки физиологического раствора удаляли из аспирата, а вязкоупругие свойства оставшегося образца SA анализировали с помощью настольного устройства. Дополнительные образцы аликвот обрабатывали восстановителем, трис (2-карбоксилэтил)фосфингидрохлоридом (TCEP), чтобы определить, может ли этот протокол быть использован для характеристики эффективности терапевтического соединения ex vivo.
Результаты показали, что этот протокол и настольное устройство могут эффективно использоваться в клинических условиях. Реологические свойства, определяемые по кривым, зависящим от концентрации ПЭО (рисунок 1А), были неразличимы между испытанным настольным устройством и традиционным параллельным пластинчатым реометром (рисунок 1В). Тройные измерения слизи SA были повторяемыми, с 10% коэффициентом вариации для конечных точек G*, G' и G" и отражали существенные аномалии вязкоупругости слизи, которые были клинически очевидны в случае этого пациента (рисунок 1D). Наконец, лечение ex vivo TCEP привело к значительному снижению G' и G" и увеличению δ загара, демонстрируя реакцию на лечение изменениями в сети муцина (рисунок 2). В заключение, этот протокол с использованием настольного реометра обеспечивает простой и эффективный подход к оценке вязкоупругих свойств образцов слизи, полученных из клиники. Эта возможность может быть использована для облегчения подходов точной медицины к лечению, поскольку клиницисты могут проверить эффективность одобренных мукоактивных препаратов на месте, что может помочь определить альтернативные варианты лечения. Кроме того, этот подход может быть использован в клинических испытаниях для изучения эффектов исследуемых препаратов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

При слизисто-обструктивных заболеваниях легких (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, муковисцидоз) и других респираторных заболеваниях (например, вирусные/бактериальные инфекции) биофизические свойства слизи изменяются гиперсекрецией бокаловидных клеток, обезвоживанием дыхательных путей, окислительным стрессом и присутствием внеклеточной ДНК. Предыдущие исследования показали, что вязкоупругость мокроты коррелирует с функцией легких и что лечение, влияющее на реологию мокроты (например, муколитики), может привести к замечательным клиническим преимуществам. В целом, реологические измерения неньютоновских жидкостей используют сложные, трудоемкие подходы (например, параллельные / конусно-пластинчатые реометры и / или отслеживание частиц микрогранул), которые требуют обширной подготовки для выполнения анализа и интерпретации данных. Это исследование проверило надежность, воспроизводимость и чувствительность Rheomuco, удобного для пользователя настольного устройства, которое предназначено для выполнения быстрых измерений с использованием динамических колебаний с сдвиговой деформацией для обеспечения линейных вязкоупругих модулей (G', G", G* и δ загара) и характеристик точки геля (γc и σc) для клинических образцов в течение 5 минут. Производительность устройства была проверена с использованием различных концентраций имитатора слизи, полиэтиленоксида 8 МДа (PEO) и по сравнению с традиционными объемными реологическими измерениями. Клинический изолят, собранный у интубированного пациента с астматическим статусом (SA), затем оценивали в трех измерениях, и коэффициент вариации между измерениями составляет <10%. Использование ex vivo мощного агента, уменьшающего слизь, TCEP, на слизи SA привело к пятикратному снижению модуля упругости и изменению в сторону более «жидкого» поведения в целом (например, более высокий δ загара). Вместе эти результаты демонстрируют, что испытанный настольный реометр может надежно измерять вязкоупругость слизи в клинических и исследовательских условиях. Таким образом, описанный протокол может быть использован для изучения эффектов мукоактивных препаратов (например, rhDNase, N-ацетилцистеина) на месте для адаптации лечения в каждом конкретном случае или в доклинических исследованиях новых соединений.

На фиг.1 показана точность и повторяемость реологических измерений с использованием концентрационно-зависимых кривых вязкоупругого контроля, т.е. раствора полиэтиленоксида (ПЭО) и состояния астматической (SA) слизи. Измерения вязкоупругих характеристик ПЭО 8 МДа при пят...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Вязкоупругие свойства слизи играют решающую роль в мукоцилиарном клиренсе. Однако традиционные реологические методы слизи требуют сложных и трудоемких подходов. Это исследование предоставляет подробный протокол для использования настольного реометра, который может быстро и надежно выполнять вязкоупругие измерения.

Быстрая вязкоупругая характеристика слизи дыхательных путей с помощью настольного реометра

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Мукобструктивные заболевания характеризуются аномальной вязкостью слизи дыхательных путей. Протокол показывает, как использовать реологию для количественной оценки вязкости слизи и анализа данных для тестирования лечения, нацеленного на слизь. Реология слизи дает специфические количественные биомаркеры.Использование настольного устройства значительно упрощает логистику измерения этих биомаркеров в клинических образцах, таких как образцы мокроты человека. Использование реологии слизи в качестве инструмента диагностики обструктивных заболеваний по-прежнему является проблемой. Растущее количество доказательств показывает сильную корреляцию между свойствами реологии, воспалением и бактериальной инфекцией.Слизь всегда присутствует на границе раздела тела, где она смазывается и играет защитную роль. Реология слизи может быть применена к другим системам, таким как желудочно-кишечный тракт и генитальные следы. Для получения точных измерений решающее значение имеет правильное обращение и размещение образца.Визуальная демонстрация может повысить точность этого анализа. Продемонстрировать эту процедуру будет Кендалл Шаффер, техник-исследователь из лаборатории воздуха. Начните с сортировки собранной мокроты дыхательных путей или слизи в стерильных чашках для образцов.В случае мокроты удалите лишнюю слюну из образца сразу после сбора. Поместите образцы на лед для транспортировки. Ограничьте время транспортировки менее чем четырьмя часами.Проанализируйте образцы во время сбора. Гомогенизируйте слизь, осторожно пипетируя вверх и вниз три-пять раз пипеткой с положительным смещением. Или пипетку непосредственно в микроцентрифужные трубки.Храните образцы при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут обработаны. Aliquot образцы для хранения в объемах, превышающих или равных 500 микролитрам, чтобы обеспечить достаточный объем для экспериментов. Перед аликотированием пипетка свежая и замороженная мокрота или слизь непосредственно или гомогенизируют образцы.Восстановите необходимые аликвоты для повторных измерений и лечения. Инкубируйте аликвоты, которые должны быть проверены при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее пяти минут перед измерением. Для тестирования фармакологических средств используют высокие концентрации стоковых растворов для предотвращения разбавления пробы.Добавьте от 1% до 10% объема желаемого реагента непосредственно на образец. Убедитесь, что ни одна капля соединения не остается на боковой стороне трубки. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение необходимого периода времени, чтобы обеспечить химическую реакцию.Смешайте образец слизи и реагента, щелкая нижней частью трубки микроцентрифуги каждые две минуты, чтобы обеспечить прогрессирующее проникновение реагента в образец слизи без ущерба для сети муцина. При сравнении нескольких лекарственных реагентов убедитесь, что время инкубации одинаково. Включите устройство и инициализируйте программное обеспечение.Выберите новое измерение. Введите идентификационный номер образца в поле Идентификатор меры и имя оператора в поле Оператор, чтобы продолжить. Введите дополнительную информацию или комментарии в разделе Комментарии.Выберите набор геометрии и тщательно осматривайте большие и маленькие пластины, чтобы убедиться, что пластины чистые и в идеальном состоянии. Плотно вставьте большую пластину на нижнюю кафедру. Аккуратно вставьте небольшую пластину на верхнюю кафедру и зафиксируйте пластину, слегка вращаясь, пока не услышите щелчок, который указывает на то, что пластина правильно зажата.Отметим, что свободное колебание верхней пластины является нормальным. Подождите, пока температура не достигнет целевого значения 37 градусов по Цельсию. Затем инициируйте автоматическую калибровку, как подсказывает программное обеспечение.Используя пипетку с положительным смещением, медленно пипетку между 250 и 500 микролитрами образца по центру большой нижней пластины. После осаждения на пластину вязкие образцы примут форму купола, тогда как высокоэластичные образцы могут потребовать физического разрыва. Опустите измерительную головку, несущую небольшую пластину с помощью программного обеспечения, и наблюдайте за образцом.При правильной загрузке на нижнюю пластину образец будет контактировать и центрироваться между двумя пластинами. Чтобы убедиться, что образец заполняет зазор, используйте функцию уменьшения зазора до тех пор, пока образец больше не будет иметь двояковогнутую форму или не будет выровнен с краем пластины. Функция уменьшенного зазора снижает край измерения с шагом 0,1 миллиметра и ограничена 7 шагами.Если после 7 шагов остается зазор, нажмите «Повторить установку», чтобы вернуться в исходное положение и отрегулировать положение и объем образца. Если зазор сильно уменьшился, удалите лишний образец шпателем круговым движением вдоль края верхней пластины. Аккуратно обрежьте лишний образец, чтобы избежать напряжения сдвига.Опустите защитную крышку, чтобы избежать случайного выпадения загрязненных жидкостей во время колебаний. Чтобы начать измерение, нажмите кнопку Начать анализ. Весь цикл займет от четырех до семи минут.Избегайте громких разговоров и прикосновений к устройству или скамейке в течение всего цикла. Спокойная обстановка имеет решающее значение в течение первых двух минут. После завершения цикла щелкните далее, чтобы поднять измерительную головку и создать отчет об анализе образца.Как только измерительная головка будет полностью убрана, поднимите защитную крышку. Выбросьте образец и аккуратно извлеките пластины. Очистите и продезинфицируйте тарелки, используя теплую воду и мыло.Вязкоупругие характеристики восьми мегадальтонных ПЭО измеряли при пяти концентрациях и непосредственно сравнивали между оцененным настольным реометром и традиционным объемным реометром. В отличие от растворов PEO, статус астматической слизи представляет собой твердое эластичное доминирующее поведение при низком напряжении и имеет кроссовер при высоком напряжении. Кроме того, тройные измерения, выполненные в 1,5% растворе ПЭО и образце слизи для клинического анализа, подтвердили, что линейные вязкоупругие характеристики были высоковоспроизводимыми для значений, полученных из биологического образца.Были измерены изменения вязкоупругих свойств слизи после обработки слизистым агентом. Влияние TCEP на вязкоупругость слизи было проверено в клинических условиях с использованием настольного реометра. Муколитическая обработка привела к получению более жидкого образца с уменьшением модуля комплекса в 4,6 раза, модуля упругости в 5,1 раза, модуля вязкости в 1,9 раза, деформации кроссовера в 3,3 раза и напряжения выхода кроссовера в 5,7 раза, а также увеличения коэффициента демпфирования в 2,8 раза.Измерение вязкоупругости слизи дыхательных путей в быстро меняющихся клинических условиях может помочь адаптировать лечение пациентов в каждом конкретном случае, а также обеспечить стандартизированный протокол для тестирования новых фармакологических соединений. Этот метод в настоящее время используется для изучения влияния высокоэффективных модуляторов CFTR на мокроту муковисцидоза и для проверки эффективности различных препаратов, направленных на изменение свойств слизи.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Быстрое Точка-санитарной помощи анализа эффективности эноксапарина антикоагулянтов в цельной крови

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Α-тест: Быстрая бесклеточной CD4 Перечисление Использование Всего слюны

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Автоматическое измерение эмфиземы легких и малых дыхательных путей Ремоделирование в сигаретном дыме, подвергшихся воздействию мышей

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Актуальное в дыхательных путях Анестезия для Awake-эндоскопической интубации использования спрей-как-вы-го Техника с высоким потоком кислорода

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Оценка механических и вязкоупругих свойств крысиного языка

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Быстрая оценка токсичности химических соединений с использованием эмбрионов зебры

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

Характеристика серпового во время контролируемой автоматизированной дезоксигенации с кислородным градиентом Эктацитометрия

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

Твердая труба как альтернатива в управлении проблемных дыхательных путей

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Характеристика новой техники органотипической культуры сетчатки человека

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Проектирование и разработка модели для изучения влияния дополнительного кислорода на микробиом дыхательных путей муковисцидоза

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...