Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
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Este documento está respaldado por subvenciones de Vertex Pharmaceuticals (Premio Ehre RIA) y Research EHRE20XX0 apoyado por CFF.

En el presente estudio, las muestras se recolectaron durante una broncoscopia clínicamente indicada después de obtener el consentimiento informado bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la UNC.
1. Recolección y almacenamiento de esputo /moco
<ol><li>Recolecte moco de las vías respiratorias a través de la recolección de esputo o la aspiración por broncoscopia.<ol>
<li>Recolectar esputo ya sea a través de expectoración ...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+mucus+viscosity+and+airway+dehydration+impact+COPD+airway+clearance.">Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance.</a> European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li><li>Tomaiuolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+improve+the+clinical+evaluation+of+cystic+fibrosis+patients+by+mucus+viscoelastic+properties.">A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties.</a> PloS One. 9 (1), 82297 (2014).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aerosolized+recombinant+human+DNase+on+exacerbations+of+respiratory+symptoms+and+on+pulmonary+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.+The+Pulmozyme+Study+Group.">Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group.</a> The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).</li><li>Hubbard, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+study+of+aerosolized+recombinant+human+deoxyribonuclease+I+in+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis.</a> The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).</li><li>Shak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolized+recombinant+human+DNase+I+for+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis.</a> Chest. 107, 65-70 (1995).</li><li>Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+sputum+rheology+correlates+with+both+acute+and+longitudinal+changes+in+lung+function.">Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function.</a> Chest. 154 (2), 370-377 (2018).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+plugs+in+patients+with+asthma+linked+to+eosinophilia+and+airflow+obstruction.">Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+inhaled+mucolytic+to+treat+airway+muco-obstructive+diseases.">An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cystic+fibrosis+airway+cells+with+CFTR+modulators+reverses+aberrant+mucus+properties+via+hydration.">Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration.</a> The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).</li><li>Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+transport+properties+of+airway+secretions+in+cystic+fibrosis-relationships+with+the+degree+of+infection+and+severity+of+the+disease.">Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease.</a> European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+controlling+mucociliary+frequency+and+respiratory+mucus+transport.">Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport.</a> Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).</li><li>Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

Las propiedades viscoelásticas únicas del moco son esenciales para mantener las vías respiratorias sanas. Los factores internos y externos pueden alterar las propiedades biofísicas del moco de las vías respiratorias, causando complicaciones clínicas características de las enfermedades mucoobstructivas. Por lo tanto, el monitoreo de los cambios en la viscoelasticidad del moco podría considerarse durante las evaluaciones del estado de la enfermedad y la exploración de terapias que reducen la viscoelasticidad del m...

Las enfermedades mucoobstructivas de las vías respiratorias, como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis quística (FQ) y otras afecciones respiratorias, como la neumonía viral y bacteriana, son problemas de salud prevalentes en todo el mundo. Si bien la fisiopatología varía mucho entre cada afección, una característica clave común es el aclaramiento mucociliar anormal. En los pulmones sanos, el moco recubre el epitelio de las vías respiratorias para atrapar las partículas inhaladas y proporcionar una barrera física contra los patógenos. Una vez secretado, el moco de las vías respiratorias, compuesto de ~ 97.5% de agua, 0.9% de sal, ~ 1.1% de proteínas globulares y ~ 0.5% de mucinas, se transporta gradualmente hacia la glotis mediante el latido coordinado delos cilios 1,2. Las mucinas son grandes glicoproteínas ligadas a O que interactúan a través de enlaces no covalentes y covalentes para proporcionar las distintas propiedades viscoelásticas del moco, que se requieren para un transporte eficiente3. Los cambios en la ultraestructura de la red de mucina causados por el transporte de iones alterados, el despliegue de mucina, las interacciones electrostáticas, la reticulación o los cambios en la composición pueden afectar significativamente la viscoelasticidad del moco y afectar el aclaramiento mucociliar 4,5. Por lo tanto, identificar cambios en las propiedades biofísicas del moco de las vías respiratorias es esencial para comprender la patogénesis de la enfermedad y probar nuevos compuestos mucoactivos6.
Varios factores pueden conducir a la producción de moco aberrante en los pulmones. En la EPOC, la inhalación crónica de humo de cigarrillo desencadena la hipersecreción de moco como resultado de la metaplasia de células caliciformes, así como la deshidratación de las vías respiratorias a través de la regulación a la baja del canal regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), causando hiperconcentración de moco y pequeña obstrucción de las vías respiratorias 7,8. Del mismo modo, la FQ, un trastorno genético asociado con mutaciones en el gen CFTR, se caracteriza por la producción de moco viscoso y adherente que es inadecuado para el transporte 8,9. En resumen, la disfunción de CFTR induce el agotamiento del líquido de la superficie de las vías respiratorias, el entrelazamiento polimérico de la mucina y el aumento de las interacciones bioquímicas, que resultan en inflamación crónica e infecciones bacterianas. Además, las células inflamatorias atrapadas en el moco estático exacerban aún más la viscoelasticidad del moco al agregar otra molécula grande, el ADN, a la matriz del gel, empeorando la obstrucción de las vías respiratorias5. Uno de los mejores ejemplos de la importancia de la reología del moco en la salud general de los pulmones lo proporciona el ejemplo de la DNFase humana recombinante (rhDNasa) en el tratamiento de pacientes con fibrosis quística. Los efectos de la rhDNasa se demostraron por primera vez ex vivo sobre el esputo expectorado, que mostró una transición de moco viscoso a un líquido que fluye en cuestión de minutos10,11. Los ensayos clínicos en pacientes con FQ demostraron que la reducción de la viscoelasticidad del moco de las vías respiratorias con la inhalación de rhDNasa disminuyó la tasa de exacerbaciones pulmonares y mejoró la función pulmonar y el bienestar general del paciente 12,13,14. Como resultado, la inhalación de rhDNasa destinada a facilitar el aclaramiento se convirtió en el estándar de atención para los pacientes con FQ durante más de dos décadas. Se observaron beneficios clínicos similares con el uso de solución salina hipertónica inhalada para la hidratación del moco en la FQ, que se correlacionó con cambios en las propiedades reológicas y dio lugar a la aceleración del aclaramiento mucociliar y a una mejora de la función pulmonar15,16. Por lo tanto, un protocolo rápido y confiable para medir las propiedades viscoelásticas del moco en entornos clínicos es importante para optimizar los enfoques terapéuticos.
El reómetro de sobremesa probado aquí ofrece una alternativa rápida y conveniente para realizar mediciones viscoelásticas completas de muestras de moco / esputo. Utilizando oscilaciones dinámicas con desplazamiento angular controlado, el instrumento proporciona deformación a través de un par de placas paralelas ajustables (por ejemplo, geometrías rugosas o lisas) para medir el par y el desplazamiento con resoluciones de 15 nN. m y 150 nm, respectivamente17. Una calibración estandarizada predeterminada combinada con pautas de usuario adaptadas para especialistas no reológicos permite mediciones sencillas y reduce el riesgo de errores del operador. El dispositivo produce una curva de barrido de deformación que se procesa y analiza en tiempo real (dentro de ~ 5 min) y proporciona automáticamente características viscoelásticas lineales (G', G", G * y δ bronceado) y de punto de gel (γc y σc) (consulte la Tabla 1). El módulo elástico o de almacenamiento (G') describe cómo responde una muestra a la tensión (es decir, la capacidad de volver a su forma original), mientras que el módulo viscoso o de pérdida (G") describe la energía disipada por ciclo de deformación sinusoidal (es decir, la energía perdida debido a la fricción de las moléculas). El módulo complejo o dinámico (G*) es la relación entre tensión y deformación, que describe la cantidad de acumulación de fuerza interna en respuesta a un desplazamiento de cizallamiento (es decir, las propiedades viscoelásticas generales). El factor de amortiguación (δ de bronceado) es la relación entre el módulo viscoso y el módulo elástico, que indica la capacidad de una muestra para disipar energía (es decir, un bronceado bajo δ indica un comportamiento elástico dominante / sólido, mientras que un bronceado alto δ indica un comportamiento viscoso dominante / líquido). Para las características del punto de gel, la deformación cruzada (γc) es la medida de la deformación de cizallamiento, calculada por la relación entre la trayectoria de deflexión y la altura del espacio de cizallamiento, en la que la muestra pasa de un comportamiento sólido a uno líquido y ocurre, por definición, en la tensión de oscilación donde G' = G" o bronceado δ = 1. La tensión de rendimiento cruzado (σc) es una medida de la cantidad de tensión aplicada por el dispositivo en el que se cruzan los módulos elásticos y viscosos. En sputa sana, la elasticidad domina la respuesta mecánica a la tensión (G' > G"). En las enfermedades mucoobstructivas, tanto G' como G" aumentan como consecuencia de cambios patológicos en el moco 17,18,19. La simplicidad operativa del dispositivo facilita las mediciones in situ y evita la necesidad de almacenamiento / transporte / envío de muestras a una instalación externa para su análisis, evitando así el tiempo y los efectos de congelación-descongelación en las propiedades de estas muestras biológicas.
En este estudio, se utilizaron soluciones de óxido de polietileno (PEO) de 8 MDa de diferentes concentraciones (1%-3%) para validar el rango de medición de un reómetro de sobremesa comercial (Tabla de Materiales) y la curva dependiente de la concentración obtenida se comparó directamente con las mediciones adquiridas con un reómetro a granel tradicional (Tabla de Materiales). ). Luego se evaluó la repetibilidad de las mediciones reológicas utilizando moco extraído broncoscópicamente de un paciente intubado que sufría de estado asmático (SA), una forma extrema de exacerbación del asma caracterizada por broncoespasmo, inflamación eosinofílica e hiperproducción de moco en respuesta a un agente ambiental o infeccioso 8,20 . En este caso, el paciente con SA había sido intubado por insuficiencia respiratoria grave y requirió ECMO (oxigenación por membrana extracorpórea) debido a la incapacidad de apoyar al paciente de manera efectiva y segura con ventilación mecánica sola, a pesar de las agresivas terapias estándar para el asma. Durante una broncoscopia clínicamente indicada para el colapso lobar, se observó que las secreciones gruesas, claras y tenaces obstruían los bronquios lobares y se aspiraron mediante lavados salinos. Inmediatamente después de la recolección, se eliminó el exceso de solución salina del aspirado y se analizaron las propiedades viscoelásticas de la muestra de SA restante utilizando el dispositivo de sobremesa. Se trataron alícuotas de muestra adicionales con un agente reductor, tris (2-carboxiletil) clorhidrato de fosfina (TCEP), para determinar si este protocolo podría usarse para caracterizar la eficacia del compuesto terapéutico ex vivo.
Los resultados mostraron que este protocolo y el dispositivo de sobremesa se pueden utilizar de manera efectiva en un entorno clínico. Las propiedades reológicas determinadas a partir de curvas dependientes de la concentración de PEO (Figura 1A) fueron indistinguibles entre el dispositivo de sobremesa probado y un reómetro de placa paralelo tradicional (Figura 1B). Las mediciones triplicadas del moco SA fueron repetibles, con un coeficiente de variación del 10% para los criterios de valoración G*, G' y G" y reflejaron las anomalías sustanciales en la viscoelasticidad del moco que fueron clínicamente evidentes en el caso de este paciente (Figura 1D). Finalmente, el tratamiento ex vivo con TCEP resultó en una reducción significativa de G' y G", y un aumento en el bronceado δ, demostrando la capacidad de respuesta al tratamiento por alteraciones en la red de mucina (Figura 2). En conclusión, este protocolo que utiliza un reómetro de sobremesa proporciona un enfoque simple y efectivo para evaluar las propiedades viscoelásticas de las muestras de moco obtenidas de la clínica. Esta capacidad se puede utilizar para facilitar los enfoques de atención de la medicina de precisión, ya que los médicos pueden probar la eficacia de los medicamentos mucoactivos aprobados en el sitio, lo que puede ayudar a identificar opciones de tratamiento alternativas. Además, este enfoque se puede utilizar en ensayos clínicos para examinar los efectos de los fármacos en investigación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

En las enfermedades pulmonares mucoobstructivas (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística) y otras afecciones respiratorias (por ejemplo, infecciones virales / bacterianas), las propiedades biofísicas del moco se ven alteradas por la hipersecreción de células caliciformes, la deshidratación de las vías respiratorias, el estrés oxidativo y la presencia de ADN extracelular. Estudios anteriores mostraron que la viscoelasticidad del esputo se correlacionaba con la función pulmonar y que los tratamientos que afectan la reología del esputo (por ejemplo, mucolíticos) pueden dar lugar a notables beneficios clínicos. En general, las mediciones reológicas de fluidos no newtonianos emplean enfoques elaborados y lentos (por ejemplo, reómetros paralelos / de placa cónica y / o seguimiento de partículas de microperlas) que requieren una capacitación extensa para realizar el ensayo e interpretar los datos. Este estudio probó la confiabilidad, reproducibilidad y sensibilidad de Rheomuco, un dispositivo de sobremesa fácil de usar que está diseñado para realizar mediciones rápidas utilizando oscilación dinámica con un barrido de cizallamiento para proporcionar módulos viscoelásticos lineales (G', G", G * y δ de bronceado) y características de punto de gel (γc y σc) para muestras clínicas dentro de los 5 minutos. El rendimiento del dispositivo se validó utilizando diferentes concentraciones de un simulante de moco, óxido de polietileno (PEO) de 8 MDa, y contra mediciones reológicas a granel tradicionales. Luego se evaluó un aislado clínico extraído de un paciente intubado con estado asmático (SA) en mediciones por triplicado y el coeficiente de variación entre las mediciones es de <10%. El uso ex vivo de un potente agente reductor de moco, TCEP, en el moco SA resultó en una disminución de cinco veces en el módulo elástico y un cambio hacia un comportamiento más "líquido" en general (por ejemplo, un bronceado más alto δ). Juntos, estos resultados demuestran que el reómetro de sobremesa probado puede hacer mediciones confiables de la viscoelasticidad del moco en entornos clínicos y de investigación. En resumen, el protocolo descrito podría utilizarse para explorar los efectos de los fármacos mucoactivos (por ejemplo, rhDNasa, N-acetil cisteína) in situ para adaptar el tratamiento caso por caso, o en estudios preclínicos de nuevos compuestos.

La Figura 1 muestra la precisión y repetibilidad de las mediciones reológicas utilizando curvas dependientes de la concentración de control viscoelástico, es decir, solución de óxido de polietileno (PEO) y moco de estado asmático (SA). Las mediciones de las características viscoelásticas de 8 MDa PEO a cinco concentraciones diferentes (1%, 1,5%, 2%, 2,5% y 3%) se compararon directamente entre el reómetro de sobremesa evaluado y un reómetro a granel tradicional (Tabla de Ma...

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Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Las propiedades viscoelásticas del moco juegan un papel crítico en el aclaramiento mucociliar. Sin embargo, las técnicas reológicas tradicionales de moco requieren enfoques complejos y lentos. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el uso de un reómetro de sobremesa que puede realizar mediciones viscoelásticas de forma rápida y confiable.

Caracterización viscoelástica rápida del moco de las vías respiratorias utilizando un reómetro de sobremesa

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Las enfermedades mucoobstructivas se caracterizan por una viscosidad anormal del moco de las vías respiratorias. El protocolo muestra cómo usar la reología para cuantificar la viscosidad del moco y analizar los datos para probar los tratamientos dirigidos al moco. La reología del moco proporciona biomarcadores cuantitativos específicos.El uso de un dispositivo de sobremesa simplifica en gran medida la logística de medición de estos biomarcadores en muestras clínicas como muestras de esputo humano. El uso de la reología del moco como una herramienta de diagnóstico para las enfermedades obstructivas sigue siendo un desafío. Un creciente cuerpo de evidencia muestra una fuerte correlación entre las propiedades reológicas, la inflamación y la infección bacteriana.El moco siempre está presente en la interfaz del cuerpo donde lubrica y desempeña un papel protector. La reología del moco se puede aplicar a otros sistemas como las vías gastrointestinales y genitales. Para adquirir mediciones precisas, el manejo y colocación correctos de la muestra es crítico.Una demostración visual puede mejorar la precisión de este ensayo. Demostrando este procedimiento estará Kendall Shaffer, un técnico de investigación del laboratorio del aire. Comience clasificando el esputo o moco de las vías respiratorias recolectado en tazas de muestra estériles.En el caso del esputo, retire el exceso de saliva de la muestra inmediatamente después de la recolección. Coloque las muestras en hielo para su transporte. Limite el tiempo de transporte a menos de cuatro horas.Analizar las muestras en el momento de la recogida. Homogeneice el moco canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces con una pipeta de desplazamiento positivo. O pipetee directamente en los tubos de la microcentrífuga.Guarde las muestras a 80 grados centígrados hasta que se procesen. Alícuota las muestras para su almacenamiento en volúmenes mayores o iguales a 500 microlitros para garantizar un volumen suficiente para los experimentos. Antes de alicuar, pipetear esputo o moco fresco y congelado directamente u homogeneizar los especímenes.Repare las alícuotas requeridas para repetir las mediciones y tratamientos. Incubar las alícuotas que se van a probar a 37 grados centígrados durante al menos cinco minutos antes de la medición. Para probar agentes farmacológicos, use altas concentraciones de soluciones madre para evitar la dilución de la muestra.Agregue entre 1% y 10% de volumen del reactivo deseado directamente sobre la muestra. Asegúrese de que ninguna gota del compuesto permanezca en el lado del tubo. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante el tiempo requerido, para permitir una reacción química.Mezcle la muestra de moco y el reactivo moviendo la parte inferior del tubo de la microcentrífuga cada dos minutos para permitir la penetración progresiva del reactivo en la muestra de moco sin comprometer la red de mucina. Al comparar múltiples reactivos farmacológicos, asegúrese de que el tiempo de incubación sea similar. Encienda la máquina e inicialice el software.Seleccione nueva medición. Introduzca el número de identificación de la muestra en ID de medida y el nombre del operador en Operador para continuar. Introduzca información adicional o comentarios en Comentarios.Seleccione un conjunto de geometría e inspeccione cuidadosamente las placas grandes y pequeñas, para asegurarse de que las placas estén limpias y en perfectas condiciones. Inserte la placa grande firmemente en el púlpito inferior. Inserte la placa pequeña suavemente en el púlpito superior y bloquee la placa girando ligeramente hasta escuchar un clic, lo que indica que la placa está correctamente sujeta.Tenga en cuenta que la oscilación libre de la placa superior es normal. Espere hasta que la temperatura alcance los 37 grados centígrados del valor objetivo. A continuación, inicie la calibración automática, según lo solicite el software.Usando una pipeta de desplazamiento positivo, pipetee lentamente entre 250 y 500 microlitros de la muestra en el centro de la placa inferior grande. Una vez depositadas en la placa, las muestras viscosas adoptarán una forma de cúpula, mientras que las muestras altamente elásticas pueden requerir un corte físico. Baje el cabezal de medición que transporta la placa pequeña a través del software y observe la muestra.Si se carga correctamente en la placa inferior, la muestra hará contacto y se centrará entre las dos placas. Para asegurarse de que la muestra llena el espacio, utilice la función de espacio reducido hasta que la muestra ya no tenga la forma bicóncava o esté alineada con el borde de la placa. La función de espacio reducido reduce el borde de medición en incrementos de 0,1 milímetros y se limita a 7 incrementos.Si queda un hueco después de los 7 incrementos, haga clic en Rehacer instalación para volver a la posición inicial y ajustar la posición y el volumen de la muestra. Si el espacio se reduce en exceso, retire el exceso de muestra con una espátula mediante un movimiento circular a lo largo del borde de la placa superior. Recorte el exceso de muestra suavemente para evitar el estrés por cizallamiento.Baje la cubierta protectora para evitar cualquier proyección accidental de fluidos contaminados durante la oscilación. Para iniciar la medición, haga clic en Iniciar análisis. Un ciclo completo tomará de cuatro a siete minutos.Evite hablar en voz alta y tocar el dispositivo o el banco durante toda la duración del ciclo. Un ambiente tranquilo es crucial durante los primeros dos minutos. Una vez completado el ciclo, haga clic en siguiente para elevar el cabezal de medición y generar el informe de análisis de muestra.Una vez que el cabezal de medición esté completamente retraído, levante la cubierta protectora. Deseche la muestra y retire cuidadosamente las placas. Limpie y desinfecte los platos con agua tibia y jabón.Las características viscoelásticas de ocho megadalton PEO se midieron a cinco concentraciones y se compararon directamente entre el reómetro de sobremesa evaluado y un reómetro a granel tradicional. En contraste con las soluciones de PEO, el moco asmático de estado representa un comportamiento dominado elástico de tipo sólido a baja tensión y presenta un cruce a alta tensión. Además, las mediciones de triplicado realizadas en solución de PEO al 1,5% y muestra de moco de ensayo clínico, confirmaron que las características viscoelásticas lineales eran altamente repetibles para los valores obtenidos de la muestra biológica.Se midieron los cambios en las propiedades viscoelásticas del moco después del tratamiento con un agente mucolítico. Los efectos del TCEP sobre la viscoelasticidad del moco del ensayo se probaron en un entorno clínico utilizando el reómetro de sobremesa. El tratamiento mucolítico dio como resultado una muestra más fluida con una disminución en el módulo complejo en 4,6 veces, el módulo elástico en 5,1 veces, el módulo viscoso en 1,9 veces, la tensión cruzada en 3,3 veces y la tensión de rendimiento cruzada en 5,7 veces, y un aumento en la relación de amortiguación en 2,8 veces.La medición de la viscoelasticidad del moco de las vías respiratorias en un entorno clínico de ritmo rápido puede ayudar a adaptar el tratamiento de los pacientes caso por caso, así como proporcionar un protocolo estandarizado para probar nuevos compuestos farmacológicos. Esta técnica se utiliza actualmente para examinar los efectos de los moduladores CFTR altamente efectivos sobre el esputo de la fibrosis quística y para probar la potencia de varios medicamentos destinados a alterar las propiedades del moco.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

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Investigación

Medicina

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There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

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