Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Detta dokument stöds av bidrag från Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) och CFF-stödda Research EHRE20XX0.

I den aktuella studien samlades prover in under en kliniskt indikerad bronkoskopi efter att ha erhållit informerat samtycke enligt ett protokoll som godkänts av UNC Institutional Review Board.
1. Sputum / slemuppsamling och lagring
<ol><li>Samla luftvägsslem via sputumuppsamling eller bronkoskopi aspiration.<ol>
<li>Samla sputum antingen via spontan expectoration eller inducera sputum genom 3% hypertonisk saltlösning inandning. Alternativt, direkt aspir...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus,+mucins,+and+cystic+fibrosis.">Mucus, mucins, and cystic fibrosis.</a> Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).</li><li>Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Human+Airway+Mucus.">Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus.</a> Physiological Reviews. , (2022).</li><li>Lin, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+mucus+viscosity+and+airway+dehydration+impact+COPD+airway+clearance.">Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance.</a> European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li><li>Tomaiuolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+improve+the+clinical+evaluation+of+cystic+fibrosis+patients+by+mucus+viscoelastic+properties.">A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties.</a> PloS One. 9 (1), 82297 (2014).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).</li><li>Zahm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+in+vitro+effect+of+recombinant+human+DNase+on+rheological+and+transport+properties+of+cystic+fibrosis+respiratory+mucus.">Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus.</a> The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).</li><li>Fuchs, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aerosolized+recombinant+human+DNase+on+exacerbations+of+respiratory+symptoms+and+on+pulmonary+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.+The+Pulmozyme+Study+Group.">Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group.</a> The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).</li><li>Hubbard, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+study+of+aerosolized+recombinant+human+deoxyribonuclease+I+in+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis.</a> The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).</li><li>Shak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolized+recombinant+human+DNase+I+for+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis.</a> Chest. 107, 65-70 (1995).</li><li>Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+sputum+rheology+correlates+with+both+acute+and+longitudinal+changes+in+lung+function.">Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function.</a> Chest. 154 (2), 370-377 (2018).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+plugs+in+patients+with+asthma+linked+to+eosinophilia+and+airflow+obstruction.">Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+inhaled+mucolytic+to+treat+airway+muco-obstructive+diseases.">An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cystic+fibrosis+airway+cells+with+CFTR+modulators+reverses+aberrant+mucus+properties+via+hydration.">Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration.</a> The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).</li><li>Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+transport+properties+of+airway+secretions+in+cystic+fibrosis-relationships+with+the+degree+of+infection+and+severity+of+the+disease.">Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease.</a> European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+controlling+mucociliary+frequency+and+respiratory+mucus+transport.">Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport.</a> Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).</li><li>Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

De unika viskoelastiska egenskaperna hos slem är viktiga för att upprätthålla friska luftvägar. Interna och externa faktorer kan förändra luftvägsslem biofysiska egenskaper, vilket orsakar kliniska komplikationer som är karakteristiska för muco-obstruktiva sjukdomar. Därför kan övervakning av förändringar i slemviskopelasticitet övervägas vid bedömningar av sjukdomsstatus och utforskning av terapier som minskar slemviskopelasticitet. Empiriska studier från 1980-talet visade en stark korrelation mellan ...

Muco-obstruktiva luftvägssjukdomar, inklusive astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), cystisk fibros (CF) och andra andningssjukdomar, såsom viral och bakteriell lunginflammation, är vanliga hälsoproblem över hela världen. Medan patofysiologin varierar mycket mellan varje tillstånd, är en vanlig nyckelfunktion onormal mucociliär clearance. I friska lungor leder slem luftvägsepitelet för att fånga inhalerade partiklar och ge en fysisk barriär mot patogener. När det väl utsöndrats transporteras luftvägsslem, bestående av ~ 97,5% vatten, 0,9% salt, ~ 1,1% klotformiga proteiner och ~ 0,5% muciner, gradvis mot glottis genom samordnad slagning av cilia 1,2. Muciner är stora O-länkade glykoproteiner som interagerar via icke-kovalenta och kovalenta bindningar för att ge de distinkta viskoelastiska egenskaperna hos slem, vilket krävs för effektiv transport3. Förändringar i ultrastrukturen i mucinnätverket orsakade av förändrad jontransport, mucinutfällning, elektrostatiska interaktioner, tvärbindning eller förändringar i kompositionen kan signifikant påverka slemviskopelasticiteten och försämra mucociliary clearance 4,5. Därför är det viktigt att identifiera förändringar i de biofysiska egenskaperna hos luftvägsslem för att förstå sjukdomspatogenes och testa nya mukoaktiva föreningar6.
Olika faktorer kan leda till produktion av avvikande slem i lungorna. Vid KOL utlöser kronisk inandning av cigarettrök slemhypersekretion som ett resultat av metaplasi i bägare, liksom uttorkning av luftvägarna via nedreglering av kanalen cystisk fibros transmembrankonduktansregulator (CFTR), vilket orsakar slemhyperkoncentration och liten luftvägsobstruktion 7,8. På samma sätt kännetecknas CF, en genetisk störning associerad med mutationer i CFTR-genen, av produktion av visköst, vidhäftande slem som är otillräckligt för transport 8,9. I korthet inducerar CFTR-dysfunktion vätskeutarmning av luftvägsytan, polymer mucin intrassling och ökade biokemiska interaktioner, vilket resulterar i kronisk inflammation och bakterieinfektioner. Dessutom förvärrar inflammatoriska celler fångade i statiskt slem ytterligare viskoelasticiteten hos slem genom att tillsätta en annan stor molekyl, DNA, i gelmatrisen, förvärra luftvägsobstruktion5. Ett av de bästa exemplen på vikten av slemreologi på lungans allmänna hälsa tillhandahålls av exemplet med rekombinant human DNFase (rhDNase) vid behandling av cystisk fibrospatienter. Effekterna av rhDNas visades först ex vivo på slemlösat sputum, vilket visade en övergång från visköst slem till en flytande vätska inom några minuter10,11. Kliniska prövningar på CF-patienter visade att minskning av luftvägsslem viskoelasticitet med rhDNase inhalation minskade frekvensen av lungförvärringar och förbättrade lungfunktionen och patientens övergripande välbefinnande 12,13,14. Som ett resultat blev rhDNase inhalation som syftade till att underlätta clearance vårdstandarden för CF-patienter i mer än två decennier. Liknande kliniska fördelar observerades vid användning av inhalerad hypertonisk saltlösning för slemhydrering vid CF, vilket korrelerade med förändringar i reologiska egenskaper och resulterade i mucociliär clearanceacceleration och förbättrad lungfunktion15,16. Därför är ett snabbt och tillförlitligt protokoll för att mäta slem viskoelastiska egenskaper i kliniska miljöer viktigt för att optimera terapeutiska metoder.
Bänkskivans reometer som testas här erbjuder ett snabbt och bekvämt alternativ för att utföra omfattande viskoelastiska mätningar av slem / sputumprover. Med hjälp av dynamiska svängningar med kontrollerad vinkelförskjutning ger instrumentet deformation via ett par justerbara parallella plattor (t.ex. grova eller släta geometrier) för att mäta vridmoment och förskjutning med upplösningar på 15 nN. m respektive 150 nm17. En standardiserad kalibrering i kombination med användarriktlinjer anpassade för icke-reologispecialister möjliggör enkla mätningar och minskar risken för operatörsfel. Enheten producerar en töjningssvepkurva som bearbetas och analyseras i realtid (inom ~ 5 min) och ger automatiskt både linjära viskoelastiska (G ', G ", G * och tan δ) och gelpunkt (γc och σc) egenskaper (se tabell 1). Den elastiska eller lagringsmodulen (G ') beskriver hur ett prov reagerar på stress (dvs. förmågan att återgå till sin ursprungliga form), medan den viskösa eller förlustmodulen (G") beskriver den energi som försvinner per cykel av sinusformad deformation (dvs den energi som förloras på grund av molekylernas friktion). Den komplexa eller dynamiska modulen (G*) är förhållandet mellan spänning och töjning, som beskriver mängden intern kraftuppbyggnad som svar på en skjuvförskjutning (dvs. de totala viskoelastiska egenskaperna). Dämpningsfaktorn (tan δ) är förhållandet mellan den viskösa modulen och den elastiska modulen, vilket indikerar ett provs förmåga att sprida energi (dvs. en låg solbränna δ indikerar ett elastiskt dominerande / fastliknande beteende, medan en hög solbränna δ indikerar ett visköst dominerande / vätskeliknande beteende). För gelpunktsegenskaper är crossover-stammen (γc) måttet på skjuvspänningen, beräknad med förhållandet mellan avböjningsvägen och skjuvgapets höjd, vid vilken provet övergår från ett fastliknande till ett vätskeliknande beteende och per definition uppträder vid oscillationsspänning där G ' = G " eller solbränna δ = 1. Crossover-utbytesspänningen (σc) är ett mått på mängden spänning som appliceras av anordningen vid vilken den elastiska och viskösa modulen korsar varandra. I hälsosam sputa dominerar elasticiteten det mekaniska svaret på töjning (G' > G"). Vid muco-obstruktiva sjukdomar ökar både G' och G" till följd av patologiska slemförändringar 17,18,19. Enhetens operativa enkelhet underlättar mätningar på plats och kringgår behovet av provlagring / transport / transport till en extern anläggning för analys, vilket undviker tids- och frys-tina effekter på egenskaperna hos dessa biologiska prover.
I denna studie användes 8 MDa polyetenoxidlösningar (PEO) med olika koncentrationer (1% -3%) för att validera mätområdet för en kommersiell bänktreometer (materialtabell) och den erhållna koncentrationsberoende kurvan jämfördes direkt med mätningar som erhållits med en traditionell bulkreometer (materialtabell ). Repeterbarheten av reologiska mätningar bedömdes sedan med hjälp av bronkoskopiskt skördat slem från en intuberad patient som lider av status asthmaticus (SA), en extrem form av astmaförvärring som kännetecknas av bronkospasm, eosinofil inflammation och slemhyperproduktion som svar på ett miljö- eller smittämne8 20 . I detta fall hade SA-patienten intuberats för svår andningssvikt och krävde ECMO (extrakorporeal membransyresättning) på grund av oförmågan att stödja patienten effektivt och säkert med enbart mekanisk ventilation, trots aggressiva standardastmaterapier. Under en kliniskt indikerad bronkoskopi för lobar kollaps noterades tjocka, klara, ihärdiga sekret som hindrar lobar bronkier och aspirerades med saltlösning. Omedelbart efter insamling avlägsnades överskott av saltlösning från aspiranten och de viskoelastiska egenskaperna hos det återstående SA-provet analyserades med användning av bänkskivan. Ytterligare prov alikvoter behandlades med ett reduktionsmedel, tris (2-karboxyletyl) fosfinhydroklorid (TCEP), för att avgöra om detta protokoll kan användas för att karakterisera terapeutisk föreningseffekt ex vivo.
Resultaten visade att detta protokoll och bänkskivan kan användas effektivt i en klinisk miljö. De reologiska egenskaper som bestämdes utifrån PEO-koncentrationsberoende kurvor (figur 1A) kunde inte skiljas mellan den testade bänkskivan och en traditionell parallellplåtsreometer (figur 1B). Tredubbla mätningar av SA-slemmet var repeterbara, med en variationskoefficient på 10% för G *, G ', och G "slutpunkter och återspeglade de väsentliga avvikelserna i slemviskopelasticitet som var kliniskt uppenbara i denna patients fall (figur 1D). Slutligen resulterade ex vivo-behandling med TCEP i en signifikant minskning av G 'och G", och en ökning av solbränna δ, vilket visar lyhördhet för behandlingen genom förändringar i mucinnätverket (figur 2). Sammanfattningsvis ger detta protokoll med hjälp av en bänkreometer ett enkelt och effektivt tillvägagångssätt för att bedöma viskoelastiska egenskaper hos slemprover erhållna från kliniken. Denna förmåga kan användas för att underlätta precisionsmedicinska metoder för vård, eftersom kliniker kan testa effekten av godkända mukoaktiva läkemedel på plats, vilket kan hjälpa till att identifiera alternativa behandlingsalternativ. Dessutom kan detta tillvägagångssätt användas i kliniska prövningar för att undersöka effekterna av prövningsläkemedel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

Vid muko-obstruktiva lungsjukdomar (t.ex. astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, cystisk fibros) och andra andningssjukdomar (t.ex. virus-/bakterieinfektioner) förändras slemets biofysiska egenskaper av bägarecellshypersekretion, uttorkning av luftvägarna, oxidativ stress och närvaron av extracellulärt DNA. Tidigare studier visade att sputumviskopelasticitet korrelerade med lungfunktionen och att behandlingar som påverkar sputumreologi (t.ex. mukolytika) kan resultera i anmärkningsvärda kliniska fördelar. I allmänhet använder reologiska mätningar av icke-newtonska vätskor utarbetade, tidskrävande metoder (t.ex. parallella / konplattreometrar och / eller mikrobpartikelspårning) som kräver omfattande träning för att utföra analysen och tolka data. Denna studie testade tillförlitligheten, reproducerbarheten och känsligheten hos Rheomuco, en användarvänlig bänkskiva som är utformad för att utföra snabba mätningar med dynamisk svängning med ett skjuvspänningssvep för att ge linjär viskoelastisk moduli (G ', G ", G * och tan δ) och gelpunktsegenskaper (γc och σc) för kliniska prover inom 5 minuter. Enhetens prestanda validerades med olika koncentrationer av en slemsimulator, 8 MDa polyetenoxid (PEO), och mot traditionella bulkreologimätningar. Ett kliniskt isolat som skördats från en intuberad patient med status asthmaticus (SA) bedömdes sedan i tredubbla mätningar och variationskoefficienten mellan mätningarna är <10%. Ex vivo-användning av ett potent slemreducerande medel, TCEP, på SA-slem resulterade i en femfaldig minskning av elastisk modul och en förändring mot ett mer "vätskeliknande" beteende totalt sett (t.ex. högre δ). Tillsammans visar dessa resultat att den testade bänkskivans reometer kan göra tillförlitliga mått på slemviskopelasticitet i kliniska och forskningsmiljöer. Sammanfattningsvis kan det beskrivna protokollet användas för att undersöka effekterna av mukoaktiva läkemedel (t.ex. rhDNas, N-acetylcystein) på plats för att anpassa behandlingen från fall till fall eller i prekliniska studier av nya föreningar.

Figur 1 visar noggrannheten och repeterbarheten för reologiska mätningar med koncentrationsberoende kurvor för viskoelastisk kontroll, dvs. polyetenoxidlösning (PEO) och status asthmaticus (SA) slem. Mätningar av viskoelastiska egenskaper hos 8 MDa PEO vid fem olika koncentrationer (1%, 1,5%, 2%, 2,5% och 3%) jämfördes direkt mellan den utvärderade bänkskivans reometer och en traditionell bulkreometer (materialtabell). I motsats till SA-slem var PEO-lösningar visk?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

De viskoelastiska egenskaperna hos slem spelar en kritisk roll vid mucociliary clearance. Traditionella slemreologiska tekniker kräver emellertid komplexa och tidskrävande tillvägagångssätt. Denna studie ger ett detaljerat protokoll för användning av en bänkreometer som snabbt och tillförlitligt kan utföra viskoelastiska mätningar.

Snabb viskoelastisk karakterisering av luftvägsslem med hjälp av en bänkskiva Reometer

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Muco-obstruktiva sjukdomar kännetecknas av onormal viskositet hos luftvägsslemet. Protokollet visar hur man använder reologi för att kvantifiera slemviskositet och analysera data för att testa sleminriktade behandlingar. Slemreologi ger specifika kvantitativa biomarkörer.Att använda en bänkskiva förenklar logistiken för att mäta dessa biomarkörer i kliniska prover som humana sputumprover. Att använda slemreologi som diagnosverktyg för obstruktiva sjukdomar är fortfarande en utmaning. En ökande mängd bevis visar en stark korrelation mellan reologiegenskaper, inflammation och bakteriell infektion.Slem finns alltid vid kroppens gränssnitt där det smörjer och spelar en skyddande roll. Slemreologi kan tillämpas på andra system som mag-tarm- och könsspår. För att få noggranna mätningar är korrekt hantering och placering av provet avgörande.En visuell demonstration kan förbättra precisionen i denna analys. Demonstrerar denna procedur kommer att vara Kendall Shaffer, en forskningstekniker från luftlaboratoriet. Börja med att sortera det uppsamlade luftvägssputumet eller slemmet i sterila provkoppar.När det gäller sputum, ta bort överskott av saliv från provet omedelbart efter insamling. Placera proverna på is för transport. Begränsa transporttiden till mindre än fyra timmar.Analysera proverna vid tidpunkten för insamlingen. Homogenisera slemmet genom att försiktigt pipettera upp och ner tre till fem gånger med en positiv förskjutningspipett. Eller pipettera direkt i mikrocentrifugrören.Förvara proverna vid 80 grader Celsius tills de bearbetas. Alikvotera proverna för lagring i volymer större än eller lika med 500 mikroliter för att säkerställa tillräcklig volym för experiment. Före alikvotering, pipettera färskt och fryst sputum eller slem direkt eller homogenisera prover.Reparera de nödvändiga alikvoterna för upprepade mätningar och behandlingar. Inkubera de alikvoter som ska testas vid 37 grader Celsius i minst fem minuter före mätningen. För att testa farmakologiska medel, använd höga koncentrationer av stamlösningar för att förhindra provutspädning.Tillsätt mellan 1% och 10% volym av önskat reagens direkt på provet. Se till att ingen droppe av föreningen stannar på sidan av röret. Inkubera proverna vid 37 grader Celsius under den tid som krävs för att möjliggöra en kemisk reaktion.Blanda slemprovet och reagenset genom att snärta botten av mikrocentrifugröret varannan minut för att möjliggöra progressiv penetrering av reagenset i slemprovet utan att kompromissa med mucinnätverket. När du jämför flera läkemedelsreagenser, se till att inkubationstiden är liknande. Slå på maskinen och initiera programvaran.Välj ny mätning. Ange provets identifieringsnummer under Åtgärd ID och operatörens namn under Operatör för att fortsätta. Ange ytterligare information eller kommentarer under Kommentarer.Välj en geometriuppsättning och inspektera stora och små plattor noggrant för att säkerställa att plattorna är rena och i perfekt skick. Sätt in den stora plattan ordentligt på den nedre predikstolen. Sätt försiktigt in den lilla plattan på den övre predikstolen och lås plattan genom att rotera något tills du hör ett klick, vilket indikerar att plattan är ordentligt fastspänd.Observera att fri svängning av den övre plattan är normal. Vänta tills temperaturen når 37 grader Celsius målvärde. Starta sedan automatisk kalibrering, enligt uppmaningen från programvaran.Använd en positiv förskjutningspipett och pipettera långsamt mellan 250 och 500 mikroliter av provet på mitten av den stora bottenplattan. När de väl har deponerats på plattan kommer viskösa prover att anta en kupolform, medan mycket elastiska prover kan kräva fysisk avskiljning. Sänk mäthuvudet som bär den lilla plattan via programvaran och observera provet.Om provet är ordentligt laddat på bottenplattan kommer det att komma i kontakt och centreras mellan de två plattorna. För att säkerställa att provet fyller spalten, använd den reducerade gapfunktionen tills provet inte längre är i biconcave-form eller i linje med plattans kant. Den reducerade gapfunktionen sänker mätkanten i steg om 0,1 millimeter och är begränsad till steg om 7 steg.Om ett mellanrum kvarstår efter de 7 stegen klickar du på Gör om installationen för att återgå till utgångsläget och justera provets position och volym. Om spalten är kraftigt reducerad, ta bort överskottsprovet med en spatel genom en cirkulär rörelse längs kanten på den övre plattan. Trimma överskottsprovet försiktigt för att undvika skjuvspänning.Sänk skyddskåpan för att undvika oavsiktlig projicering av förorenade vätskor under svängning. För att initiera mätning, klicka på Starta analys. En hel cykel tar fyra till sju minuter.Undvik att prata högt och röra vid enheten eller bänken under hela cykelns längd. En lugn miljö är avgörande under de första två minuterna. När cykeln är klar klickar du på nästa för att höja mäthuvudet och generera provanalysrapporten.När mäthuvudet är helt indraget, höj skyddskåpan. Kassera provet och ta försiktigt bort plattorna. Rengör och desinficera plattorna med varmt vatten och tvål.De viskoelastiska egenskaperna hos åtta megadalton PEO mättes i fem koncentrationer och jämfördes direkt mellan den utvärderade bänktreometern och en traditionell bulkreometer. I motsats till PEO-lösningar representerar status asthmaticus slem ett fastliknande elastiskt dominerat beteende vid låg belastning och har en crossover vid hög belastning. Dessutom bekräftade tredubbla mätningar utförda i 1,5% PEO-lösning och kliniskt analysslemprov att linjära viskoelastiska egenskaper var mycket repeterbara för de värden som erhölls från det biologiska provet.Förändringar mättes i slemets viskoelastiska egenskaper efter behandling med ett mukolytiskt medel. TCEP-effekter på analys av slemviskopelasticitet testades i klinisk miljö med hjälp av bänkskivans reometer. Mukolytisk behandling resulterade i ett mer vätskeliknande prov med en minskning av den komplexa modulen med 4,6 gånger, elastisk modul med 5,1 gånger, viskös modul med 1,9 gånger, crossover-töjning med 3,3 gånger och crossover-utbytesspänning med 5,7 gånger och en ökning av dämpningsförhållandet med 2,8 gånger.Mätning av luftvägsslem viskoelasticitet i en snabb klinisk miljö kan hjälpa till att skräddarsy patienternas behandling från fall till fall, samt tillhandahålla ett standardiserat protokoll för testning av nya farmakologiska föreningar. Denna teknik används för närvarande för att undersöka effekterna av mycket effektiva CFTR-modulatorer på cystisk fibros sputum och för att testa styrkan hos olika läkemedel som syftar till att förändra slemegenskaper.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Snabb Point-of-Care analys av enoxaparin antikoagulantia Effekt i helblod

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Den α-test: Snabb Cell-free CD4 Enumeration Använda Hela Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatiserad Mätning av lungemfysem och Liten Airway Remodeling i cigarettrök exponerade möss

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topisk Airway Anesthesia för Awake-endoskopisk Intubation Använda Spray-as-you-go Teknik med hög syre Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo- utvärdering av råtttavans mekaniska och viskoelastiska egenskaper

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Snabb utvärdering av toxiciteten hos kemiska föreningar med hjälp av Zebrafish embryon

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

Karaktärisering av sickling under kontrollerad automatiserad Deoxygenering med Syregradient Ektacytometri

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

Den styva röret som ett alternativ för att kontrollera den problematiska Airway

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Karakterisering av en ny mänsklig organotypisk retinal kulturteknik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Design och utveckling av en modell för att studera effekten av extra syre på cystisk fibros luftvägsmikrobiomet

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...