Name: rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer
Uploaded: 2022-04-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Bu makale Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Ödülü) ve CFF destekli Research EHRE20XX0 hibeleri ile desteklenmektedir.

Bu çalışmada, UNC Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu tarafından onaylanan bir protokol kapsamında bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra klinik olarak belirtilen bir bronkoskopi sırasında örnekler toplanmıştır.
1. Balgam/mukus toplama ve depolama
<ol><li>Balgam toplama veya bronkoskopi aspirasyonu yoluyla hava yolu mukusunu toplayın.<ol>
<li>Balgamı spontan balgam söktürücü yoluyla toplayın veya% 3 hipertonik salin inhalasyonu ile balgam?...

<ol>
	<li>Button, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+periciliary+brush+promotes+the+lung+health+by+separating+the+mucus+layer+from+airway+epithelia.">A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia.</a> Science. 337 (6097), 937-941 (2012).</li><li>Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muco-obstructive+lung+diseases.">Muco-obstructive lung diseases.</a> New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).</li><li>Rose, M. C., Voynow, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+tract+mucin+genes+and+mucin+glycoproteins+in+health+and+disease.">Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease.</a> Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).</li><li>Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis:+An+inherited+disease+affecting+mucin-producing+organs.">Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 52, 136-145 (2014).</li><li>Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus,+mucins,+and+cystic+fibrosis.">Mucus, mucins, and cystic fibrosis.</a> Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).</li><li>Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+Pathophysiology+of+Human+Airway+Mucus.">Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus.</a> Physiological Reviews. , (2022).</li><li>Lin, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+mucus+viscosity+and+airway+dehydration+impact+COPD+airway+clearance.">Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance.</a> European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li><li>Tomaiuolo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+to+improve+the+clinical+evaluation+of+cystic+fibrosis+patients+by+mucus+viscoelastic+properties.">A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties.</a> PloS One. 9 (1), 82297 (2014).</li><li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum.">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).</li><li>Zahm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+in+vitro+effect+of+recombinant+human+DNase+on+rheological+and+transport+properties+of+cystic+fibrosis+respiratory+mucus.">Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus.</a> The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).</li><li>Fuchs, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aerosolized+recombinant+human+DNase+on+exacerbations+of+respiratory+symptoms+and+on+pulmonary+function+in+patients+with+cystic+fibrosis.+The+Pulmozyme+Study+Group.">Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group.</a> The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).</li><li>Hubbard, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preliminary+study+of+aerosolized+recombinant+human+deoxyribonuclease+I+in+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis.</a> The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).</li><li>Shak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosolized+recombinant+human+DNase+I+for+the+treatment+of+cystic+fibrosis.">Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis.</a> Chest. 107, 65-70 (1995).</li><li>Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+sputum+rheology+correlates+with+both+acute+and+longitudinal+changes+in+lung+function.">Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function.</a> Chest. 154 (2), 370-377 (2018).</li><li>Donaldson, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+and+lung+function+in+cystic+fibrosis+with+hypertonic+saline.">Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline.</a> The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).</li><li>Patarin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+analysis+of+sputum+from+patients+with+chronic+bronchial+diseases.">Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).</li><li>Markovetz, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endotracheal+tube+mucus+as+a+source+of+airway+mucus+for+rheological+study.">Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).</li><li>Ramsey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+hyperconcentration+in+non-cystic+fibrosis+bronchiectasis.">Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).</li><li>Dunican, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+plugs+in+patients+with+asthma+linked+to+eosinophilia+and+airflow+obstruction.">Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+inhaled+mucolytic+to+treat+airway+muco-obstructive+diseases.">An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).</li><li>Morrison, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+cystic+fibrosis+airway+cells+with+CFTR+modulators+reverses+aberrant+mucus+properties+via+hydration.">Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration.</a> The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).</li><li>Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+transport+properties+of+airway+secretions+in+cystic+fibrosis-relationships+with+the+degree+of+infection+and+severity+of+the+disease.">Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease.</a> European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+properties+controlling+mucociliary+frequency+and+respiratory+mucus+transport.">Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport.</a> Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).</li><li>Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+errors+due+to+overfilling+for+Newtonian+fluids+in+rotational+rheometry.">Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry.</a> Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).</li><li>Hancock, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muc5b+overexpression+causes+mucociliary+dysfunction+and+enhances+lung+fibrosis+in+mice.">Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice.</a> Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).</li><li>Adewale, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+therapy+of+bicarbonate,+glutathione,+and+ascorbic+acid+improves+cystic+fibrosis+mucus+transport.">Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).</li><li>Fernandez-Petty, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glycopolymer+improves+vascoelasticity+and+mucociliary+transport+of+abnormal+cystic+fibrosis+mucus.">A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus.</a> JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).</li></ol>

Mukusun eşsiz viskoelastik özellikleri, sağlıklı hava yollarının korunmasında esastır. İç ve dış faktörler hava yolu mukusunun biyofiziksel özelliklerini değiştirerek muko-obstrüktif hastalıkların karakteristik klinik komplikasyonlarına neden olabilir. Bu nedenle, mukus viskoelastisitesindeki değişikliklerin izlenmesi, hastalık durumunun değerlendirilmesi ve mukus viskoelastisitesini azaltan tedavilerin araştırılması sırasında düşünülebilir. 1980'lerden itibaren yapılan ampirik çalı?...

Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kistik fibroz (KF) ve viral ve bakteriyel pnömoni gibi diğer solunum yolu rahatsızlıkları dahil olmak üzere muko-obstrüktif hava yolu hastalıkları dünya çapında yaygın sağlık sorunlarıdır. Patofizyoloji her durum arasında büyük farklılıklar gösterse de, ortak bir anahtar özellik anormal mukosiliyer klirenstir. Sağlıklı akciğerlerde mukus, solunan parçacıkları yakalamak ve patojenlere karşı fiziksel bir bariyer sağlamak için hava yolu epitelini hizalar. Salgılandıktan sonra, ~% 97.5 su,% 0.9 tuz, ~% 1.1 küresel proteinler ve ~% 0.5 müsinlerden oluşan hava yolu mukusları, kirpiklerin koordineli bir şekilde atılmasıyla kademeli olarak glottise doğru taşınır 1,2. Müsinler, verimli taşıma için gerekli olan mukusun farklı viskoelastik özelliklerini sağlamak için kovalent olmayan ve kovalent bağlar yoluyla etkileşime giren büyük O'ya bağlı glikoproteinlerdir3. Değişmiş iyon taşınması, müsin açılması, elektrostatik etkileşimler, çapraz bağlanma veya bileşimdeki değişikliklerin neden olduğu müsin ağının ultrayapısındaki değişiklikler, mukus viskoelastisitesini önemli ölçüde etkileyebilir ve mukosiliyer klirensi bozabilir 4,5. Bu nedenle, hava yolu mukusunun biyofiziksel özelliklerindeki değişikliklerin belirlenmesi, hastalık patogenezini anlamak ve yeni mukoaktif bileşiklerin test edilmesi için gereklidir6.
Çeşitli faktörler akciğerlerde anormal mukus üretimine yol açabilir. KOAH'ta sigara dumanının kronik olarak solunması, kadeh hücresi metaplazisinin bir sonucu olarak mukus hipersekresyonunu ve ayrıca kistik fibroz transmembran iletkenlik düzenleyicisi (CFTR) kanalının downregülasyonu yoluyla hava yolu dehidrasyonunu tetikleyerek mukus hiperkonsantrasyonuna ve küçük hava yolu tıkanıklığına neden olur 7,8. Benzer şekilde, CFTR genindeki mutasyonlarla ilişkili genetik bir bozukluk olan CF, taşımaiçin yetersiz olan viskoz, yapışkan mukus üretimi ile karakterizedir 8,9. Kısacası, CFTR disfonksiyonu, hava yolu yüzey sıvısının tükenmesine, polimerik müsin dolaşıklığına ve artmış biyokimyasal etkileşimlere neden olarak kronik inflamasyon ve bakteriyel enfeksiyonlara neden olur. Ek olarak, statik mukusta sıkışmış enflamatuar hücreler, jel matrisine başka bir büyük molekül olan DNA'yı ekleyerek mukusun viskoelastisitesini daha da kötüleştirir ve hava yolu tıkanıklığını kötüleştirir5. Mukus reolojisinin akciğerlerin genel sağlığı üzerindeki öneminin en iyi örneklerinden biri, kistik fibrozis hastalarının tedavisinde rekombinant insan DNFaz (rhDNaz) örneği ile sağlanmaktadır. RhDNaz'ın etkileri ilk olarak10,11 dakika içinde viskoz mukustan akan bir sıvıya geçiş gösteren balgam söktürücü balgam üzerinde ex vivo olarak gösterilmiştir. KF hastalarında yapılan klinik çalışmalar, rhDNaz inhalasyonu ile hava yolu mukus viskoelastisitesinin azaltılmasının pulmoner alevlenme oranını azalttığını ve akciğer fonksiyonunu ve genel hasta refahını iyileştirdiğini göstermiştir12,13,14. Sonuç olarak, klirensi kolaylaştırmayı amaçlayan rhDNaz inhalasyonu, yirmi yıldan fazla bir süredir KF hastaları için standart bakım haline gelmiştir. Benzer klinik faydalar, KF'de mukus hidrasyonu için inhale hipertonik salin kullanımı ile gözlenmiştir, bu da reolojik özelliklerdeki değişikliklerle korelasyon göstermiş ve mukosiliyer klirens ivmesi ve akciğer fonksiyonunun iyileşmesi ile sonuçlanmıştır15,16. Bu nedenle, klinik ortamlarda mukus viskoelastik özelliklerini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir protokol, terapötik yaklaşımları optimize etmek için önemlidir.
Burada test edilen tezgah üstü reometre, mukus/balgam numunelerinin kapsamlı viskoelastik ölçümlerini gerçekleştirmek için hızlı ve kullanışlı bir alternatif sunmaktadır. Kontrollü açısal yer değiştirmeli dinamik salınımlar kullanan cihaz, torku ve yer değiştirmeyi 15 nN çözünürlüklerle ölçmek için bir çift ayarlanabilir paralel plaka (örneğin, kaba veya pürüzsüz geometriler) aracılığıyla deformasyon sağlar. m ve 150 nm, sırasıyla17. Reoloji uzmanı olmayanlar için uyarlanmış kullanıcı kılavuzlarıyla birlikte varsayılan standartlaştırılmış kalibrasyon, basit ölçümlere olanak tanır ve operatör hataları riskini azaltır. Cihaz, gerçek zamanlı olarak (~ 5 dakika içinde) işlenen ve analiz edilen bir gerinim süpürme eğrisi üretir ve otomatik olarak hem doğrusal viskoelastik (G', G", G * ve ten rengi δ) hem de jel noktası (γ c ve σc) özelliklerini sağlar (bkz. Tablo 1). Elastik veya depolama modülü (G'), bir numunenin strese nasıl tepki verdiğini (yani, orijinal şekline geri dönme yeteneğini) tanımlarken, viskoz veya kayıp modülü (G), sinüzoidal deformasyon döngüsü başına dağılan enerjiyi (yani, moleküllerin sürtünmesi nedeniyle kaybedilen enerjiyi) tanımlar. Karmaşık veya dinamik modül (G *), bir kesme yer değiştirmesine (yani, genel viskoelastik özelliklere) yanıt olarak iç kuvvet birikimi miktarını tanımlayan gerilmenin gerinimlere oranıdır. Sönümleme faktörü (bronz δ), viskoz modülün elastik modüle oranıdır, bu da bir numunenin enerjiyi dağıtma yeteneğini gösterir (yani, düşük bir bronzluk δ elastik-baskın / katı benzeri bir davranışı gösterirken, yüksek bir bronzluk δ viskoz-baskın / sıvı benzeri bir davranışı gösterir). Jel noktası özellikleri için, çapraz gerinim (γc), sapma yolunun kesme boşluğu yüksekliğine oranı ile hesaplanan, numunenin katı benzeri bir davranıştan sıvı benzeri bir davranışa geçtiği ve tanım gereği, G' = G" veya bronzluk δ = 1 olduğu salınım geriniminde meydana geldiği kesme geriniminin ölçüsüdür. Çapraz akma gerilimi (σc), elastik ve viskoz modülün kesiştiği cihaz tarafından uygulanan gerilim miktarının bir ölçüsüdür. Sağlıklı balgamda, elastikiyet, gerinime karşı mekanik tepkiye hükmeder (G' > G"). Muko-obstrüktif hastalıklarda, patolojik mukus değişiklikleri sonucu hem G' hem de G" artışı17,18,19. Cihazın operasyonel basitliği, yerinde ölçümleri kolaylaştırır ve analiz için numune depolama/nakliye/tesis dışındaki bir tesise sevkiyat ihtiyacını ortadan kaldırır, böylece bu biyolojik numunelerin özellikleri üzerindeki zaman ve donma-çözülme etkilerini önler.
Bu çalışmada, ticari bir tezgah üstü reometrenin (Malzeme Tablosu) ölçüm aralığını doğrulamak için farklı konsantrasyonlarda (% 1-3) 8 MDa polietilen oksit (PEO) çözeltisi kullanılmış ve elde edilen konsantrasyona bağlı eğri, geleneksel bir dökme reometre (Malzeme Tablosu) ile elde edilen ölçümlerle doğrudan karşılaştırılmıştır. ). Reolojik ölçümlerin tekrarlanabilirliği daha sonra, çevresel veya enfeksiyöz bir ajana yanıt olarak bronkospazm, eozinofilik inflamasyon ve mukus hiperüretimi ile karakterize aşırı bir astım alevlenmesi formu olan status asthmaticus'tan (SA) muzdarip entübe edilmiş bir hastadan bronkoskopik olarak toplanan mukus kullanılarak değerlendirildi 8,20 . Bu olguda SA hastası ağır solunum yetmezliği nedeniyle entübe edilmiş ve agresif standart astım tedavilerine rağmen tek başına mekanik ventilasyon ile etkin ve güvenli bir şekilde desteklenememesi nedeniyle ECMO (ekstrakorporeal membran oksijenasyonu) gerekmiştir. Lober kollaps için klinik olarak endike olan bronkoskopi sırasında, kalın, berrak, inatçı sekresyonların lober bronşları tıkadığı kaydedildi ve salin yıkamaları kullanılarak aspire edildi. Toplandıktan hemen sonra, aspirattan fazla salin çıkarıldı ve kalan SA örneğinin viskoelastik özellikleri tezgah üstü cihaz kullanılarak analiz edildi. Ek örnek alikotlar, bu protokolün terapötik bileşik etkinliğini ex vivo olarak karakterize etmek için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için bir indirgeyici ajan olan tris (2-karboksiletil) fosfin hidroklorür (TCEP) ile muamele edildi.
Sonuçlar, bu protokolün ve tezgah üstü cihazın klinik ortamda etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermiştir. PEO konsantrasyonuna bağımlı eğrilerden (Şekil 1A) belirlenen reolojik özellikler, test edilen tezgah üstü cihaz ile geleneksel paralel plaka reometresi (Şekil 1B) arasında ayırt edilemezdi. SA mukusunun üçlü ölçümleri, G *, G' ve G" sonlanım noktaları için% 10'luk bir varyasyon katsayısı ile tekrarlanabilir ve bu hastanın olgusunda klinik olarak belirgin olan mukus viskoelastisitesindeki önemli anormallikleri yansıtıyordu (Şekil 1D). Son olarak, TCEP ile ex vivo tedavi, G' ve G" de önemli bir azalma ve bronzluk δ bir artış ile sonuçlandı ve müsin ağındaki değişikliklerle tedaviye yanıt verdiğini gösterdi (Şekil 2). Sonuç olarak, tezgah üstü reometre kullanan bu protokol, klinikten elde edilen mukus örneklerinin viskoelastik özelliklerini değerlendirmek için basit ve etkili bir yaklaşım sunmaktadır. Bu yetenek, klinisyenler onaylanmış mukoaktif ilaçların etkinliğini yerinde test edebildiğinden, bakıma hassas tıp yaklaşımlarını kolaylaştırmak için kullanılabilir ve bu da alternatif tedavi seçeneklerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, bu yaklaşım araştırma ilaçlarının etkilerini incelemek için klinik çalışmalarda kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Capillary Pistons Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>CP1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Hybrid Rheometer-3</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>DHR-3 Bulk Rheometer manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing Software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td>GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peltier plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Temperature control system manufactured 
			by TA Instruments in New Castle, DE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>372838</td>
			<td>8 MDa polymer used as mucus simulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Displacement Pipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Pipette used for handling viscous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rheomuco</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td></td>
			<td>Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Lower Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>D-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rough Upper Geometries</td>
			<td>Rheonova</td>
			<td>U-1811-007</td>
			<td>25mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smooth Upper Parallel Plate</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td></td>
			<td>20mm Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(2-carboxyethyl)phosphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547-10X1ML</td>
			<td>TCEP: Potent reducing agent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid viscoelastic characterization of airway mucus using a benchtop rheometer

Muko-obstrüktif akciğer hastalıklarında (örneğin, astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kistik fibroz) ve diğer solunum koşullarında (örneğin, viral / bakteriyel enfeksiyonlar), mukus biyofiziksel özellikleri kadeh hücresi hipersekresyonu, hava yolu dehidrasyonu, oksidatif stres ve hücre dışı DNA varlığı ile değişir. Önceki çalışmalar, balgam viskoelastisitesinin solunum fonksiyonu ile ilişkili olduğunu ve balgam reolojisini etkileyen tedavilerin (örneğin, mukolitikler) dikkate değer klinik faydalarla sonuçlanabileceğini göstermiştir. Genel olarak, Newton olmayan sıvıların reolojik ölçümleri, tahlili gerçekleştirmek ve verileri yorumlamak için kapsamlı eğitim gerektiren ayrıntılı, zaman alıcı yaklaşımlar (örneğin, paralel / koni plakası reometreleri ve / veya mikroboncuk parçacık izleme) kullanır. Bu çalışma, 5 dakika içinde klinik numuneler için doğrusal viskoelastik modül (G', G", G * ve bronzluk δ) ve jel noktası özellikleri (γ c ve σc) sağlamak için kesme gerinimi süpürme ile dinamik salınım kullanarak hızlı ölçümler yapmak üzere tasarlanmış kullanıcı dostu bir tezgah üstü cihaz olan Rheomuco'nun güvenilirliğini, tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini test etmiştir. Cihaz performansı, mukus simulantının farklı konsantrasyonları, 8 MDa polietilen oksit (PEO) kullanılarak ve geleneksel toplu reoloji ölçümlerine karşı doğrulandı. Daha sonra status asthmaticus (SA) olan entübe edilmiş bir hastadan alınan klinik izolat, üçlü ölçümlerde değerlendirildi ve ölçümler arasındaki varyasyon katsayısı %<10'dur. SA mukus üzerinde güçlü bir mukus indirgeyici ajan olan TCEP'in ex-vivo kullanımı, elastik modülde beş kat azalmaya ve genel olarak daha "sıvı benzeri" bir davranışa doğru bir değişikliğe neden olmuştur (örneğin, daha yüksek bronzluk δ). Birlikte, bu sonuçlar test edilen tezgah üstü reometrenin klinik ve araştırma ortamlarında mukus viskoelastisitesinin güvenilir ölçümlerini yapabileceğini göstermektedir. Özetle, tarif edilen protokol, mukoaktif ilaçların (örneğin, rhDNaz, N-asetil sistein) vaka bazında tedaviyi uyarlamak için yerinde veya yeni bileşiklerin klinik öncesi çalışmalarında etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Şekil 1 , viskoelastik kontrolün konsantrasyona bağlı eğrilerini, yani polietilen oksit (PEO) çözeltisini ve status asthmaticus (SA) mukusunu kullanarak reolojik ölçümlerin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini göstermektedir. 8 MDa PEO'nun viskoelastik özelliklerinin beş farklı konsantrasyonda (%1, %1,5, %2,5 ve %3) ölçümleri, değerlendirilen tezgah üstü reometre ile geleneksel dökme reometre (Malzeme Tablosu) arasında doğrudan karşılaştırılmı...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer at JoVE.com

Rapid Viscoelastic Characterization of Airway Mucus Using a Benchtop Rheometer

Mukusun viskoelastik özellikleri mukosiliyer klirenste kritik bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, geleneksel mukus reolojik teknikleri karmaşık ve zaman alıcı yaklaşımlar gerektirir. Bu çalışma, viskoelastik ölçümleri hızlı ve güvenilir bir şekilde gerçekleştirebilen bir tezgah üstü reometrenin kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.

Masaüstü Reometre Kullanarak Hava Yolu Mukusunun Hızlı Viskoelastik Karakterizasyonu

In muco-obstructive lung diseases (e.g., asthma, chronic obstructive pulmonary disease, cystic fibrosis) and other respiratory conditions (e.g., ...

Muko-obstrüktif hastalıklar, hava yolu mukusunun anormal viskozitesi ile karakterizedir. Protokol, mukus viskozitesini ölçmek ve mukus hedefleme tedavilerini test etmek için verileri analiz etmek için reolojinin nasıl kullanılacağını gösterir. Mukus reolojisi spesifik kantitatif biyobelirteçler sağlar.Masaüstü bir cihaz kullanmak, insan balgam örnekleri gibi klinik örneklerde bu biyobelirteçlerin ölçülmesinin lojistiğini büyük ölçüde basitleştirir. Mukus reolojisini obstrüktif hastalıklar için bir tanı aracı olarak kullanmak hala zordur. Artan sayıda kanıt, reoloji özellikleri, inflamasyon ve bakteriyel enfeksiyon arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermektedir.Mukus her zaman yağladığı ve koruyucu bir rol oynadığı vücut arayüzünde bulunur. Mukus reolojisi, gastrointestinal ve genital izler gibi diğer sistemlere uygulanabilir. Doğru ölçümler elde etmek için, numunenin doğru şekilde kullanılması ve yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir.Görsel bir gösterim, bu tahlilin hassasiyetini artırabilir. Bu prosedürü gösteren, hava laboratuvarından bir araştırma teknisyeni olan Kendall Shaffer olacak. Toplanan hava yolu balgamını veya mukusunu steril numune kaplarında sıralayarak başlayın.Balgam durumunda, toplandıktan hemen sonra numuneden fazla tükürüğü çıkarın. Örnekleri taşımak için buzun üzerine yerleştirin. Taşıma süresini dört saatten az bir süreyle sınırlayın.Toplama sırasındaki örnekleri analiz edin. Pozitif yer değiştirmeli pipetle üç ila beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, mukusun homojenize edilmesini sağlayın. Veya pipeti doğrudan mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin.Numuneleri işlenene kadar 80 santigrat derecede saklayın. Deneyler için yeterli hacmi sağlamak için numuneleri 500 mikrolitreden büyük veya eşit hacimlerde depolamak için alıkoylayın. Alıntılamadan önce, pipet taze ve dondurulmuş balgam veya mukus doğrudan veya homojenize numuneler.Tekrarlanan ölçümler ve tedaviler için gerekli alikotları onarın. Ölçümden önce en az beş dakika boyunca 37 santigrat derecede test edilecek alikotları inkübe edin. Farmakolojik ajanları test etmek için, numune seyreltmesini önlemek için yüksek konsantrasyonlarda stok çözeltileri kullanın.İstenilen reaktifin% 1 ila% 10 hacimlerini doğrudan numuneye ekleyin. Bileşiğin hiçbir damlasının tüpün yanında kalmadığından emin olun. Kimyasal bir reaksiyona izin vermek için numuneleri gerekli süre boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Mukus örneğini ve reaktifi, her iki dakikada bir mikrosantrifüj tüpünün dibine hafifçe vurarak karıştırın, böylece reaktifin müsin ağından ödün vermeden mukus numunesine ilerleyici penetrasyonu sağlayın. Birden fazla ilaç reaktifini karşılaştırırken, inkübasyon süresinin benzer olduğundan emin olun. Makineyi açın ve yazılımı başlatın.Yeni ölçüm'ü seçin. Devam etmek için Ölçüm Kimliği altına örnek kimlik numarasını ve İşleç altında operatörün adını girin. Yorumlar altına ek bilgiler veya yorumlar girin.Bir geometri seti seçin ve plakaların temiz ve mükemmel durumda olduğundan emin olmak için büyük ve küçük plakaları dikkatlice inceleyin. Büyük plakayı alt minbere sıkıca yerleştirin. Küçük plakayı yavaşça üst minbere yerleştirin ve plakanın düzgün bir şekilde kelepçelendiğini gösteren bir tıklama duyana kadar hafifçe döndürerek plakayı kilitleyin.Üst plakanın serbest salınımının normal olduğunu unutmayın. Sıcaklık 37 santigrat derece hedef değerine ulaşana kadar bekleyin. Ardından, yazılım tarafından istendiği gibi otomatik kalibrasyonu başlatın.Pozitif deplasmanlı pipet kullanarak, büyük alt plakanın ortasındaki numunenin 250 ila 500 mikrolitresi arasında yavaşça pipet yapın. Plaka üzerinde biriktikten sonra, viskoz numuneler bir kubbe şeklini alacaktır, oysa yüksek elastik numuneler fiziksel olarak ayrılmayı gerektirebilir. Küçük plakayı taşıyan ölçüm kafasını yazılım aracılığıyla indirin ve numuneyi gözlemleyin.Alt plakaya düzgün bir şekilde yüklenirse, numune temas edecek ve iki plaka arasında ortalanacaktır. Numunenin boşluğu doldurduğundan emin olmak için, numune artık iki konkavük şeklinde olmayana veya plakanın kenarıyla aynı hizada olmayana kadar azaltılmış boşluk işlevini kullanın. Azaltılmış boşluk işlevi, ölçüm kenarını 0,1 milimetrelik artışlarla düşürür ve 7 artışla sınırlıdır.7 artıştan sonra bir boşluk kalırsa, başlangıç konumuna dönmek ve numunenin konumunu ve hacmini ayarlamak için Kurulumu Yeniden Yap'a tıklayın. Boşluk aşırı derecede azalırsa, fazla numuneyi üst plakanın kenarı boyunca dairesel bir hareketle bir spatula ile çıkarın. Kayma gerilmesini önlemek için fazla numuneyi nazikçe kesin.Salınım sırasında kontamine olmuş sıvıların kazara yansıtılmasını önlemek için koruyucu kapağı indirin. Ölçümü başlatmak için Analizi Başlat'a tıklayın. Bütün bir döngü dört ila yedi dakika sürecektir.Döngünün tüm uzunluğu boyunca yüksek sesle konuşmaktan ve cihaza veya tezgaha dokunmaktan kaçının. İlk iki dakika için sessiz bir ortam çok önemlidir. Döngü tamamlandıktan sonra, ölçüm kafasını kaldırmak ve numune analiz raporunu oluşturmak için ileri düğmesine tıklayın.Ölçüm kafası tamamen geri çekildikten sonra, koruyucu kapağı kaldırın. Numuneyi atın ve plakaları dikkatlice çıkarın. Plakaları ılık su ve sabun kullanarak temizleyin ve dezenfekte edin.Sekiz megadalton PEO'nun viskoelastik özellikleri beş konsantrasyonda ölçüldü ve değerlendirilen tezgah üstü reometre ile geleneksel bir dökme reometre arasında doğrudan karşılaştırıldı. PEO çözeltilerinin aksine, status asthmaticus mukus, düşük gerilmede katı benzeri elastik baskın bir davranışı temsil eder ve yüksek gerilmede bir geçişe sahiptir. Ek olarak,% 1.5 PEO çözeltisi ve klinik tahlil mukus örneğinde yapılan üçlü ölçümler, doğrusal viskoelastik özelliklerin biyolojik numuneden elde edilen değerler için oldukça tekrarlanabilir olduğunu doğrulamıştır.Mukolitik bir ajanla tedaviyi takiben mukusun viskoelastik özelliklerinde değişiklikler ölçüldü. Tahlil mukus viskoelastisitesi üzerindeki TCEP etkileri, tezgah üstü reometre kullanılarak klinik bir ortamda test edilmiştir. Mukolitik işlem, kompleks modülde 4.6 kat, elastik modülde 5.1 kat, viskoz modülde 1.9 kat, çapraz gerinimde 3.3 kat ve çapraz akma gerilmesinde 5.7 kat azalma ve sönümleme oranında 2.8 kat artış ile daha akışkan benzeri bir numune ile sonuçlandı.Hava yolu mukus viskoelastisitesini hızlı tempolu bir klinik ortamda ölçmek, hastaların tedavisini vaka bazında uyarlamaya yardımcı olabilir ve yeni farmakolojik bileşiklerin test edilmesi için standartlaştırılmış bir protokol sağlayabilir. Bu teknik şu anda yüksek etkili CFTR modülatörlerinin kistik fibroz balgam üzerindeki etkilerini incelemek ve mukus özelliklerini değiştirmeyi amaçlayan çeşitli ilaçların gücünü test etmek için kullanılmaktadır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

Tüm Kan enoksaparin Antikoagülan Etkinliğinin Rapid Point-of-Care Assay

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

The ÃƒÅ½Ã‚Â±-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Α-testi: Tüm Tükürük Kullanarak Hızlı Hücre içermeyen CD4 sayımı

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Sigara Duman maruz kalan Fare Akciğer Amfizem ve Küçük Havayolu Yaptırma otomatik ölçüm

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topikal Havayolu Anestezi Kullanımı Awake-endoskopik entübasyon için yüksek oksijen Flow ile Tekniği Sprey-as-you-go

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

Sıçan Dilinin Mekanik ve Viskoelastik Özelliklerinin In Vivo Değerlendirilmesi

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Characterization of Sickling During Controlled Automated Deoxygenation with Oxygen Gradient Ektacytometry

Oksijen Gradyan Ektasittometri ile Kontrollü Otomatik Deoksijenasyon Sırasında Hastalık Karakterizasyonu

In sickle cell disease (SCD), a single point mutation in the gene coding for beta-globin causes the production of abnormal hemoglobin S (HbS). When ...

The Rigid Tube as an Alternative in Controlling the Problematic Airway

Sorunlu Hava YolunuN Kontrolünde Alternatif Olarak Rijit Tüp

The unexpected problematic airway represents a large proportion of anesthesia-related morbidity and mortality. The retromolar or paraglossal approach is ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Ek Oksijenin Kistik Fibrozis Hava Yolu Mikrobiyomu Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Modelin Tasarımı ve Geliştirilmesi

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...