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June 2nd, 2022
DOI :
June 2nd, 2022
•0:05
Introduction
0:58
Preparing Materials for Triphosphorylation
2:44
Assembling and Using the Triphosphorylation Apparatus
6:15
On-Column Triphosphorylation of Synthetic 52 -Hydroxyl Oligonucleotide
9:25
Cross-Chiral Copying of L-RNA
11:02
Results: Synthesis and Purification of Oligonucleotide 52 -Triphosphates
12:33
Conclusion
Transcript
ट्राइफॉस्फोराइलेशन जीव विज्ञान में आरएनए का एक सर्वव्यापी 5'संशोधन है और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में तेजी से उपयोग किया जाता है। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल मानक स्वचालित संश्लेषण द्वारा तैयार किसी भी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के 5'ट्राइफॉस्फोराइलेशन को सक्षम बनाता है। रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन आरएनए, डीएनए या गैर-प्राकृतिक न्यूक्लिक एसिड युक्त ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स पर काम करता है।
यहां, ट्राइफॉस्फोराइलेटेड बाएं हाथ के एल-आरएनए, जैविक डी-आरएनए के एनेंटिओमर को शुद्ध किया जाता है और राइबोसोम प्रतिक्रिया में उपयोग किया जाता है। ट्राइफॉस्फोराइलेशन स्वचालित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड संश्लेषण के बाद और डीप्रोटेक्शन से पहले किया जाता है। ये चरण यहां नहीं दिखाए गए हैं, लेकिन शोधकर्ताओं को दोनों के लिए मानक तरीकों से परिचित होना चाहिए।
शुरू करने के लिए, सुनिश्चित करें कि फॉस्फोराइलेशन के लिए कार्यक्षेत्र में कम से कम दो लाइनों के साथ एक गैस कई गुना है और बबलर समायोज्य दबाव के साथ सूखे आर्गन स्रोत से जुड़ा हुआ है क्योंकि ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया आर्गन के तहत की जानी चाहिए। फिर प्रतिक्रिया तंत्र से कनेक्शन की सुविधा के लिए लाइनों में एक मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज संलग्न करें। इसके बाद, एक मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज, एक तीन-तरफ़ा पॉलीप्रोपाइलीन स्टॉपकॉक, नॉनकोरिंग सुई, 1.5 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब, एक छोटी धातु स्पैटुला सहित उपकरण एकत्र करें, और उपयोग करने से पहले कम से कम एक दिन के लिए कमरे के तापमान पर एक डेसिकेंट के साथ एक सील कंटेनर या डिसिकेटर में स्टोर करें।
आर्गन दबाव में, एक सीलबंद बोतल से निर्जल 1, 4-डाइऑक्सेन के 30 मिलीलीटर वापस लें। एक सूखे 30 मिलीलीटर कांच की बोतल में स्थानांतरित करें और एक सुखाने जाल जोड़ें। रबर सेप्टा के साथ सील करें और डेसिकेंट के साथ एक डेसिकेटर में स्टोर करें।
इसी तरह, एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड, एसिटोनिट्राइल के 30 मिलीलीटर और मात्रा के अनुसार तीन भागों डाइऑक्सेन और एक भाग पाइरिडीन का मिश्रण तैयार करें। पांडुलिपि में वर्णित 30 मिलीलीटर कांच की बोतल में डिमिथाइलफॉर्मामाइड और ट्रिब्यूटाइलमाइन के साथ ठोस ट्रिब्यूटिलामोनियम पाइरोफॉस्फेट को मिलाकर टीबीएपी समाधान तैयार करें। तीन ड्राइंग जाल जोड़ें।
आर्गन के नीचे एक रबर सेप्टम के साथ बोतल सील करें और 30 मिनट के लिए आर्गन के साथ बुलबुला। आरएनए सिंथेसाइज़र का उपयोग करके एक संश्लेषण कॉलम पर एक मुक्त 5'हाइड्रॉक्सिल के साथ एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तैयार करने के बाद। एक सूखी एक मिलीलीटर सिरिंज से सवार को हटाकर कक्ष तैयार करें।
कैंची या रेजर ब्लेड का उपयोग करके सिरिंज के शीर्ष को काटें और सिरिंज को संश्लेषण स्तंभ में संलग्न करें। सिरिंज के शीर्ष पर, तीन-तरफा स्टॉपकॉक संलग्न करें और स्टॉपकॉक के साइड इनलेट को बबलर के साथ सूखे आर्गन स्रोत से संलग्न करें ताकि स्टॉपकॉक का शीर्ष इनलेट अभिकर्मक इंजेक्शन पोर्ट के रूप में कार्य करे। क्लैंप के साथ एक स्टैंड के लिए इस ऑपरेटरों को सुरक्षित करें और मोम सीलिंग फिल्म के साथ सभी अपस्ट्रीम जोड़ों को सील करें।
फिर स्टॉपकॉक को समायोजित करें ताकि इंजेक्शन पोर्ट बंद हो जाए और उपकरण आर्गन स्रोत के लिए खुला हो। बबलर को बंद करें और कम दबाव पर आर्गन को पांच मिनट के लिए एक्शन चैंबर के माध्यम से स्ट्रीम करने की अनुमति दें। बबलर को फिर से खोलने के बाद, संश्लेषण स्तंभ के नीचे एक सिरिंज संलग्न करें, जो अपशिष्ट सिरिंज होगा।
अगला, अपशिष्ट सिरिंज का उपयोग करके बार-बार कॉलम के माध्यम से आर्गन खींचें और फिर सवार को पूरी तरह से धक्का देने के साथ सिरिंज को फिर से संलग्न करें। एक अभिकर्मक या विलायक जोड़ने के लिए, सूखे आर्गन स्रोत के लिए एक सुई संलग्न करें और इसे अभिकर्मक या विलायक बोतल सेप्टम में डालें, ध्यान रखें कि बोतल सामग्री में सुई विसर्जित न हो। फिर एक सुई के साथ एक सूखी सिरिंज इकट्ठा करें और इसे बोतल सामग्री में विसर्जित किए बिना अभिकर्मक या विलायक बोतल सेप्टम में डालें।
बाद में, आर्गन के साथ सिरिंज भरें, सेप्टम से सुई निकालें और आर्गन को निष्कासित करें। आर्गन के साथ सिरिंज भरने और एक और बार निष्कासित करने के बाद, आर्गन दबाव के तहत विलायक या अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा के साथ सिरिंज भरें। स्टॉपकॉक को समायोजित करें ताकि आर्गन स्रोत बंद हो जाए और इंजेक्शन पोर्ट खुला हो।
एक बार जब उपकरण पर स्टॉप जल्दी से समायोजित हो जाता है, तो स्रोत की बोतल से भरी हुई सिरिंज और सुई को हटा दें, सुई के किनारे या टिप पर फंसे किसी भी विलायक को मिटा दें और फिर सुई को इंजेक्शन पोर्ट में डालें। ऑपरेटरों के एंटी-चैंबर में एक अभिकर्मक को निष्कासित करने के बाद, सुई को हटा दें और उपकरण को आर्गन स्रोत पर फिर से खोलते हुए इंजेक्शन पोर्ट को बंद करें। धीरे-धीरे अपशिष्ट सिरिंज का उपयोग करके संश्लेषण कॉलम के माध्यम से एंटी-चैंबर से तरल खींचें ताकि सभी तरल अब अपशिष्ट सिरिंज में आयोजित किए जाएं।
अब धीरे-धीरे समाधान को संश्लेषण कॉलम में वापस धक्का दें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कॉलम में कोई गैस बुलबुले नहीं हैं। मिश्रण या आंदोलन करने के लिए, धीरे-धीरे अपशिष्ट सिरिंज के साथ स्तंभ पर समाधान को ऊपर और नीचे खींचें। स्तंभ से एक अभिकर्मक या विलायक को हटाने के लिए, धीरे-धीरे समाधान को अपशिष्ट सिरिंज में खींचें।
समाधान का बड़ा हिस्सा अपशिष्ट सिरिंज में पारित होने के बाद, कॉलम से शेष विलायक को फ्लश करने के लिए आर्गन खींचें। अगला, अपशिष्ट सिरिंज संयुक्त के चारों ओर मोम सीलिंग फिल्म को हटा दें। फिर सिरिंज को हटा दें और अपशिष्ट समाधान को त्याग दें।
बाद में, अपशिष्ट सिरिंज को एक नई सूखी सिरिंज के साथ बदलें और संयुक्त को रीसील करें। ट्राइफॉस्फोराइलेशन तंत्र को इकट्ठा करने के बाद, एंटी-चैंबर में पाइरिडीन डाइऑक्सेन के 200 माइक्रोलीटर जोड़कर ट्राइफॉस्फोराइलेशन प्रतिक्रिया शुरू करें जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था। लेकिन अभी तक संश्लेषण स्तंभ पर नमूना न खींचें।
पांडुलिपि में वर्णित डाइऑक्सेन में एसएएलपीसीएल को भंग करने के बाद, इसे एंटी-चैंबर में जोड़ें और सूखी सिरिंज का उपयोग करके संश्लेषण स्तंभ पर लोड करें। फिर इसे 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया दें और फिर अपशिष्ट सिरिंज का उपयोग करके एसएएलपीसीएल समाधान को हटा दें और त्यागें जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था। एसएएलपीसीएल समाधान को हटाने के तुरंत बाद, एंटी-चैंबर में टीबीएपी समाधान के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और संश्लेषण कॉलम पर लोड करें।
इसे आंदोलन के साथ 20 मिनट प्रतिक्रिया दें और पहले वर्णित के रूप में त्याग दें। बाद में, स्तंभ को 0.5 मिलीलीटर एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड, फिर 0.5 मिलीलीटर एसिटोनाइट्राइल के साथ धोया, प्रत्येक जोड़ के बाद विलायक को हटा दिया। ऑक्सीडाइज़र समाधान जोड़ने के बाद, इसे हटा दें और दिखाए गए उसी प्रक्रिया का उपयोग करके फिर से एसिटोनाइट्राइल के साथ कॉलम धोएं, तंत्र को अलग करें और कॉलम को पांच मिलीलीटर एसिटोनाइट्राइल के साथ धो लें।
इसके बाद, कॉलम को सुखाएं। ठोस समर्थन से ट्राइफॉस्फोराइलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को क्लीव करें और पांडुलिपि में वर्णित मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके डिप्रोटेक्ट करें। इसके बाद, यूरिया लोडिंग बफर में सूखे असुरक्षित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को भंग कर दिया, 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया, फिर पॉलीक्रिलामाइड जेल पर लोड करें और 25 से 35 वाट पर एक से दो घंटे तक चलाएं।
जेल वैद्युतकणसंचलन के अंत में, जेल प्लेट को हटाने के बाद, इसे अलग करें और जेल को पॉलीविनाइलक्लोराइड फिल्म में लपेटें। अगला, 254 नैनोमीटर यूवी प्रकाश के साथ बैक शैडोइंग द्वारा उत्पाद बैंड की पहचान करें और रेजर ब्लेड का उपयोग करके प्रमुख उत्पाद बैंड को उत्पादित करें। प्लास्टिक सिरिंज के माध्यम से या यांत्रिक रूप से इसे बाहर निकालकर एक्साइज्ड जेल को क्रश करें।
15 न्यूक्लियोटाइड से कम ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए, आंदोलन या झटकों के साथ कम से कम 12 घंटे के लिए न्यूक्लियस मुक्त पानी की जेल मात्रा के तीन गुना में एल्यूट करें। फिर 0.2 माइक्रोमीटर फिल्टर के साथ लगे सिरिंज के माध्यम से समाधान पारित करके ठोस जेल के टुकड़ों को हटा दें और लियोफिलाइजेशन द्वारा ध्यान केंद्रित करें। एकाग्रता के बाद, डिस्पोजेबल आकार बहिष्करण स्तंभ का उपयोग करके अवशिष्ट लवण और सलाम को हटा दें और पहले दिखाए गए अनुसार लियोफिलाइजेशन द्वारा ध्यान केंद्रित करें।
पांडुलिपि में वर्णित पोलीमरेज़ राइबोजाइम और एल-आरएनए प्राइमर टेम्पलेट और ट्राइफॉस्फेट ट्राइन्यूक्लियोटाइड्स युक्त आरएनए समाधान के 10 माइक्रोलीटर तैयार करने के बाद, इसे एक मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके और पीसीआर थर्मोसाइक्लर में 0.2 डिग्री सेल्सियस प्रति सेकंड पर 23 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करके एनील करें। 17 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए समाधान को इनक्यूबेट करने के बाद, प्रतिक्रिया के रूप में स्टार्ट बफर की एकाग्रता के दो बार 10 माइक्रोलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें, 10 माइक्रोलीटर विभाज्य लें और पीएच 8 पर 0.5 दाढ़ ईडीटीए के पांच माइक्रोलीटर के साथ बुझें और पांडुलिपि में वर्णित आरएनए को अलग करने के लिए प्रत्येक नमूने को संसाधित करें। औपचारिक जेल लोडिंग बफर के 10 माइक्रोलीटर में अवक्षेपित आरएनए को भंग करें और पाठ में वर्णित के रूप में अनियंत्रित अंत लेबल प्राइमर तैयार करें।
एक बार नमूने तैयार हो जाने के बाद, 80 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी। प्रत्येक कुएं में नमूने के पांच माइक्रोलीटर लोड करें और लगभग 40 मिनट के लिए जेल को 40 वाट पर चलाएं। स्टैंड से जेल प्लेट को हटाने के बाद, क्रॉस चिरल एल-आरएनए एक्सटेंशन उत्पादों की कल्पना करने के लिए फ्लोरोसेंट या फॉस्फोरसेंट जेल स्कैनर का उपयोग करके स्कैन करें।
जेल शुद्धिकरण के बाद, यूवी बैक शैडोइंग एएए और सीसीसी डीएनए ट्रिमर और जीएए एल-आरएनए ट्रिमर के लिए दिखाए गए एक प्रमुख उत्पाद के रूप में 5'ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति का खुलासा करता है। 5'हाइड्रॉक्सिल साइड उत्पाद अक्सर धीमी गति से माइग्रेटिंग बैंड के रूप में दिखाई देता है, जिसे डीएनए ट्रिमर के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अलग और पहचाना गया था। जेल शुद्धिकरण के दौरान अतिरिक्त बैंड अशुद्ध प्रतिक्रिया उत्पादों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री में 5'डिफॉस्फेट, मोनोफॉस्फेट और एच-फॉस्फोनेट साइड उत्पादों के साथ सहसंबंधित हैं।
5'ट्राइफॉस्फेट उत्पाद 5'डि और मोनोफॉस्फेट द्रव्यमान के साथ 5'ट्राइफॉस्फेट के अनुरूप एक प्राथमिक द्रव्यमान शिखर दिखाते हैं। रासायनिक रूप से ट्राइफॉस्फेट से संबंधित एल-आरएनए ट्राइन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग पेज द्वारा विश्लेषण किए गए आरएनए पोलीमराइजेशन प्रतिक्रिया में एल-आरएनए प्राइमर और एल-आरएनए टेम्पलेट के साथ किया गया था और फ्लोरोसेंट जेल स्कैनर का उपयोग करके इमेज किया गया था। काले हलकों द्वारा चिह्नित विस्तारित उत्पाद ने टेम्पलेट द्वारा एन्कोडेड हैमरहेड राइबोजाइम के एल-आरएनए संस्करण के संश्लेषण का प्रदर्शन किया।
ट्राइफॉस्फोराइलेशन के दौरान पानी के संपर्क में आने से उपज कम हो जाएगी। शुष्क अभिकर्मकों को तैयार करने और प्रतिक्रिया तंत्र को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करने के लिए चरणों का पालन करें। जवानों में तोड़ने से बचने के लिए धीरे-धीरे उपकरण के माध्यम से तरल पदार्थ ले जाएं।
बाएं हाथ के आरएनए सहित गैर-जैविक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट तैयार करने के लिए रासायनिक ट्राइफॉस्फोराइलेशन आवश्यक है। इसने जीव विज्ञान में पाए जाने वाले आरएनए अणुओं के दर्पण छवि संस्करणों के क्रॉस चिरल राइबोजाइम संश्लेषण को सक्षम किया है।
ओलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट आवश्यक जैविक मार्गों में सर्वव्यापी घटक हैं और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में बढ़ते उपयोग को देखा है। यहां, हम मानक स्वचालित संश्लेषण तकनीकों द्वारा तैयार ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड 5'-ट्राइफॉस्फेट के नियमित संश्लेषण और शुद्धिकरण के लिए तकनीकों का वर्णन करते हैं।
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