Generering av luftvägsepitelcell luft-vätskegränssnittskulturer från mänskliga pluripotenta stamceller

Detta protokoll är användbart eftersom det ger lätt att följa steg som möjliggör generering av funktionella luftvägsepitelceller, som sedan kan användas för att studera olika aspekter av luftvägsbiologi. Den största fördelen med detta protokoll är förmågan att generera många funktionella luftvägsepitelcellkulturer samtidigt som man undviker svårigheterna att erhålla och odla primära luftvägsceller. Taylor Matte, doktorand från vårt laboratorium, demonstrerar proceduren.

Börja med att tina en tillräcklig volym 3D-matris på is. Håll den på is tills den är klar att användas. Tina en injektionsflaska med tidigare kryokonserverade encellssuspensioner av iBC genom att inkubera den i ett 37 grader Celsius vatten- eller pärlbad tills det inte finns några synliga frysta medier.

Använd en fem milliliter serologisk pipett, överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör. Tillsätt sex till 10 ml DMEM/F12 droppvis till cellsuspensionen. Blanda försiktigt och centrifugera vid 300 RCF i fem minuter för att pelletera cellerna.

Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i en milliliter basalcellmedium med en P1000-mikropipett. Förbered en alikvot på 10 mikroliter och utför ett cellantal. Centrifugera cellerna vid 300 RCF i fem minuter.

Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna med en densitet av 4 000 celler per mikroliter i den tidigare tinade vid 3D-matrisen med en P1000-mikropipett. Med en P200-mikropipett, tillsätt en droppe av matrislösningen motsvarande cirka 25 till 50 mikroliter till basen av varje brunn på en 12-brunns vävnadsodlingsbehandlad platta. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i cirka 15 minuter.

Tillsätt sedan tillräckligt med basalcellmedium till varje brunn för att helt sänka droppen med en fem milliliter serologisk pipett. Sätt tillbaka plattan till en fuktad inkubator. Foderceller varannan dag med färskt basalcellmedium.

Tillsätt färskt medium på sidan av brunnen med en fem milliliter serologisk pipett, var försiktig så att du inte stör celldroppen. Tina en tillräcklig volym av 3D-matrisen på is. Håll den på is tills den är klar att användas.

Efter ungefär fem till sju dagars inkubation av odlingsplattor, aspirera mediet från varje brunn, sedan med hjälp av en P1000-mikropipett, tillsätt en milliliter dispas II direkt på sfäroiderna för att dissociera från matrisens droppe. Placera plattan i 37 grader Celsius inkubator i 10 till 15 minuter. Använd en P1000-mikropipett och blanda dispasen genom att pipettera upp och ner två gånger och bryta upp stora klumpar i 3D-matrisen.

Sätt tillbaka plattan till 37 grader Celsius i ytterligare 30 till 40 minuter, så att matrisen kan lösas upp helt. När droppen i 3D-matrisen inte längre är synlig under ljusmikroskopet, tillsätt de fritt flytande sfäroiderna till ett 15 ml koniskt rör med en fem milliliter serologisk pipettspets. Tillsätt DMEM/F12 för en slutlig volym på 10 ml per koniskt rör och centrifugera vid 200 RCF i tre minuter för att pelletera sfäroiderna.

Aspirera supernatanten och tillsätt en milliliter 0,05% trypsin för varje initial droppe som dissocieras. Inkubera vid 37 grader Celsius, triturera det varannan till var tredje minut. Utvärdera lösningen med ljusmikroskopet med några minuters mellanrum.

När mer än 90% av sfäroiderna har dissocierats till enstaka celler, tillsätt 10% fetalt bovint serum till trypsinet. Filtrera cellerna genom en 40 mikrometer cellsil och centrifugera vid 300 RCF i fem minuter. Utför ett cellantal och återställ cellerna jämnt med en densitet på 400 celler per mikroliter av tinad 3D-matris.

Undvik att införa luftbubblor. Resuspendera så många droppar som behövs för nedströms applicering. Upprepa denna process för varje brunn.

Efter 10 till 14 dagar efter den senaste passagen, dissociera sfäroiderna till en enda cellsuspension som visats tidigare och utför ett cellantal. Resuspendera cellerna i sorteringsbuffert. Detta kommer att vara huvudpopulationen.

Överför en liten alikvot på 25 till 50 mikroliter till ett separat rör. Detta kommer att vara den mindre befolkningen. Lägg till konjugerad anti-NGFR-antikropp till huvudcellpopulationen.

Lägg till isotypkontrollantikropp till den mindre cellpopulationen. Skydda cellerna från ljus och håll dem på is i 30 minuter triturera cellerna intermittent för att förhindra pelletering. Efter 30 minuter lägger du till sorteringsbufferten till varje cellrör.

Centrifugera celler vid 300 RCF i fem minuter. Aspirera supernatanten, återsuspendera de pelleterade cellerna i sorteringsbufferten och tillsätt levande eller död cellfläck. Använd en lämplig NGFR-positiv gating-strategi, sortera tillräckligt med NGFR-positiva celler för nödvändiga nedströmsapplikationer.

Förbered 6,5 millimeter porösa membraninsatser genom att tillsätta en 200 mikrolitermatris till den apikala kammaren enligt tillverkarens instruktion. Placera den vid 37 grader Celsius i minst två timmar innan det behövs. Aspirera beläggningsmatrisen från insatsens apikala kammare.

Tillsätt 500 mikroliter av basalcellsmediet till basolateralkammaren. Resuspendera minst 30 000 sorterade NGFR-positiva celler i 100 till 200 mikroliter Basal Cell Medium och överför till apikalkammaren med hjälp av en P200-mikropipett. Upprepa för de återstående brunnarna.

Placera plattan i en fuktad 37 grader Celsius inkubator. På två till tre dagar, aspirera apikala och basolaterala kamrar och mata med färskt basalcellmedium. Övervaka den apikala kammaren dagligen med ljusmikroskopi.

När celler når mer än 80% sammanflöde, ersätt basalcellsmedium med ALI-differentieringsmedium i både apikala och basolaterala kamrar. Skydda ALI-differentieringsmediet från ljus genom att hålla mediebehållare inslagna i folie och genom att stänga av taklampor när det är möjligt. Nästa dag, aspirera mediet från den apikala kammaren och utsätt därmed den apikala ytan för luft.

Byt ut ALI-differentieringsmediet i basolateralkammaren varannan till var tredje dag. Övervaka kulturens utseende varannan till varannan dag. Aspirera försiktigt all ackumulerad vätska från apikalkammaren utan att störa cellskiktet.

Tillsätt försiktigt 100 mikroliter PBS utan kalcium eller magnesium till apikalkammaren för att ta bort skräp eller slem. Inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter och aspirera sedan försiktigt PBS. Utvärdera TEER för epitelial integritet.

Efter sju till 10 dagars luftexponering, observera för utseendet av multicilia med hjälp av ljusmikroskopi. Beroende på det planerade experimentet och avläsningen kan celler analyseras efter 14 till 28 dagars luftexponering. Efter 10 till 14 dagar efter den senaste 3D-odlingspassagen, dissociera sfäroiderna till encellssuspension som visats tidigare.

Utför ett cellantal, återställ cellsuspensionen i kryokonserveringsmedium i en kryomedialt. Placera kryomedialer i en behållare för att säkerställa ett stadigt temperaturfall. Och överför till minus 80 grader Celsius i 24 till 48 timmar följt av överföring till minus 150 grader Celsius för långvarig lagring.

Med denna grindteknik var 28% av levande enskilda celler NGFR-positiva. Efter två dagar var enskilda celler initialt lätt identifierbara och hade ett långsträckt spindelformat utseende. Efter ytterligare två dagar bildade cellerna ett sammanflytande och löst packat monolager.

Under de följande dagarna till veckorna bildade cellerna ett tätt packat, mycket cellulärt epitelskikt. Och efter sju till 10 dagar var det en tydlig uppkomst av att slå cilia och slemproduktion. TEER för prover mättes och resultaten liknade mätningar av primära luftvägsepitelcellkontrollprover.

Efterföljande fixering med paraform aldehyd och immunmärkning för kanoniska luftvägsepitelcellmarkörer utfördes för bland annat MUC5AC och acetylerat alfa-tubulin. Efter detta protokoll kan forskare generera ett stort antal patient-härledda luftvägsepitelcellkulturer för att bedöma olika avläsningar, inklusive de som testar funktionerna hos basala, sekretoriska och multicilierade celler i både sjukdom och hälsa.