Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

ونحن ممتنون ل B. Ladoux و R.-M. مختبر Mège لاستخدام معدات التنظيف بالأشعة فوق البنفسجية الخاصة بهم ، و J. Heuvingh و 0. دو روور للتدريب الأولي الذي تلقيناه على إعداد القوالب على رقائق السيليكون وتقديم نصائح حول الموائع الدقيقة. نحن نقر بالتمويل المقدم من منحة مجلس البحوث الأوروبي StG-679116 (إلى A.J.) والوكالة الوطنية للبحث العلمي Muscactin و Conformin (إلى G.R.-L).

1. إعداد غرفة الموائع الدقيقة
<ol><li>حدد قالب رئيسي SU-8 مع العديد من أنماط الغرفة. الغرف النموذجية متقاطعة الشكل مع ثلاثة مداخل ومنفذ واحد ، بارتفاع 20 ميكرومتر وعرض 800 ميكرومتر (الشكل 1). يمكن شراء هذه القوالب الرئيسية من شركات خارجية أو صنعها في مختبرات أكاديمية (على س...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

بالمقارنة مع الطرق القياسية أحادية الخيط حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين على السطح بواسطة نقاط متعددة على طولها أو الحفاظ عليها بالقرب منه بواسطة عامل ازدحام مثل ميثيل السليلوز ، توفر الموائع الدقيقة عددا من المزايا. نظرا لأن التفاعلات مع السطح ضئيلة ، فإن التوقفات الاصطناعية التي يمكن أن تحد...

يتم التحكم في تجميع وتفكيك خيوط الأكتين وشبكات خيوط الأكتين بواسطة العديد من التفاعلات الكيميائية الحيوية وتعتمد على السياق الميكانيكي. من أجل اكتساب نظرة ثاقبة على هذه الآليات المعقدة ، من غير القيم أن تكون قادرا على مراقبة ردود الفعل الفردية على الخيوط الفردية (بأعداد كبيرة بما فيه الكفاية). على مدى العقود الماضية ، ظهرت مراقبة خيوط الأكتين الديناميكية في الوقت الفعلي ، ومعظمها باستخدام الفحص المجهري الكلي للتألق الداخلي للانعكاس (TIRF) ، كتقنية رئيسية وقدمت قائمة رائعة من النتائج التي لم يكن من الممكن الحصول عليها باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية للمحلول السائب1.
لتحقيق ذلك ، يحتاج المرء إلى الحفاظ على خيوط الأكتين المصنفة بالفلورسنت بالقرب من سطح غطاء المجهر مع تعريضها لمحاليل البروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs) ، والتي يمكن أيضا تصنيفها بالفلورسنت. ويوفر القيام بذلك وسيلة لرصد الأحداث التي تحدث على خيوط فردية في ظروف كيميائية حيوية جيدة التحكم، وبالتالي تحديد معدلات التفاعل كميا. ومع ذلك، ينبغي النظر في عدد من القيود المحددة. يمكن أن يؤدي الحفاظ على خيوط قريبة من السطح بشكل مصطنع ، غالبا بفضل نقاط تثبيت متعددة أو باستخدام عامل ازدحام مثل ميثيل سليلوز ، إلى تغيير سلوكها (على سبيل المثال ، التسبب في توقف مؤقت في البلمرة وإزالة البلمرة2). يمكن أن يكون تتبع محيط كل خيط أمرا صعبا ، خاصة إذا تراكمت خيوط أو شظايا خيوط جديدة في مجال الرؤية بمرور الوقت. تحدث التفاعلات في حجم محدود حيث يمكن أن يختلف تركيز مونومرات الأكتين و ABPs بمرور الوقت ، مما قد يجعل من الصعب اشتقاق ثوابت معدل دقيقة. وأخيرا، من الصعب تجديد أو تغيير محلول ABPs في أقل من 30 ثانية وغالبا ما يؤدي إلى محتوى بروتين غير متجانس في العينة.
منذ ما يزيد قليلا عن 10 سنوات ، مستوحاة مما تم القيام به بالفعل لدراسة خيوط حمض ديوكسي ريبونوكلييك (DNA) الفردية3 ، قدمنا تقنية جديدة تعتمد على الموائع الدقيقة لمراقبة خيوط الأكتين الفردية ومعالجتها4. يسمح للمرء بالتحايل على القيود المذكورة أعلاه لتقنيات الخيوط المفردة الكلاسيكية. في مقايسات الموائع الدقيقة هذه ، تزرع خيوط الأكتين من بذور الطيف الأكتين الممتصة على الغطاء. وبالتالي يتم تثبيت الخيوط من طرف واحد فقط في الجزء السفلي من غرفة الموائع الدقيقة وتتقلب فوق السطح دون الالتصاق. تتماشى الخيوط مع تدفق المحاليل الواردة ، وبالتالي تسهيل مراقبة طول محيطها والحفاظ عليها في منطقة ضحلة فوق الغطاء حيث يمكن استخدام TIRF. يتم تدفق حلول مختلفة في وقت واحد إلى الغرفة دون خلط ، ويمكن أن تتعرض الخيوط لها بالتتابع والسرعة.
هنا ، نقترح سلسلة من البروتوكولات الأساسية لإعداد اختبارات الموائع الدقيقة أحادية الأكتين في المختبر. يمكن تحضير غرف الأغطية والموائع الدقيقة مقدما (في نصف يوم) ، ويتم إجراء التجربة نفسها ، حيث يمكن اختبار العديد من الظروف الكيميائية الحيوية ، في أقل من يوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

من أجل فك رموز الآليات الجزيئية المعقدة التي تنظم تجميع وتفكيك خيوط الأكتين ، يعد من الأصول العظيمة مراقبة التفاعلات الفردية التي تعيش في ظروف يتم التحكم فيها بشكل جيد. للقيام بذلك ، ظهرت تجارب حية أحادية الخيط على مدى السنوات ال 20 الماضية ، معظمها باستخدام المجهر الفلوري الداخلي الكلي للانعكاس (TIRF) ، وقدمت مجموعة من النتائج الرئيسية. في عام 2011 ، من أجل توسيع إمكانيات هذه التجارب وتجنب القطع الأثرية الإشكالية المتكررة ، أدخلنا الموائع الدقيقة البسيطة في هذه المقاييس. تفصل هذه الدراسة بروتوكولنا الأساسي ، حيث يتم تثبيت خيوط الأكتين الفردية بواسطة طرف واحد على سطح الغطاء المخمل ، وتتماشى مع التدفق ، ويمكن أن تتعرض على التوالي لمحاليل البروتين المختلفة. كما نقدم بروتوكولات لتطبيقات محددة ونشرح كيف يمكن تطبيق القوى الميكانيكية التي يتم التحكم فيها ، وذلك بفضل السحب اللزج للمحلول المتدفق. نسلط الضوء على المحاذير التقنية لهذه التجارب ونقدم بإيجاز التطورات المحتملة بناء على هذه التقنية. هذه البروتوكولات والتفسيرات، جنبا إلى جنب مع توافر اليوم من معدات الموائع الدقيقة سهلة الاستخدام، ينبغي أن تسمح لغير المتخصصين بتنفيذ هذا الفحص في مختبراتهم.

بالنسبة لجميع التجارب الموصوفة أعلاه ، يجب أن تكون خيوط الأكتين المصنفة بالفلورسنت مرئية بوضوح ، مع تباين جيد ، مما يدل على التألق المنخفض للخلفية من السطح (الشكل 4 ، انظر الملف التكميلي 1 لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الشائعة). يجب ألا تلتصق خيوط الأكتين أيض?...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

نحن نقدم بروتوكولات لفحوصات الموائع الدقيقة البسيطة لخيوط الأكتين ، بالاشتراك مع الفحص المجهري الفلوري ، والتي تسمح للمرء بمراقبة خيوط الأكتين الفردية بدقة في الوقت الفعلي مع تعريضها بالتتابع لحلول البروتين المختلفة.

استخدام الموائع الدقيقة والمجهر الفلوري لدراسة ديناميكيات تجميع خيوط وحزم الأكتين المفردة

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

نحن نجمع بين الفحص المجهري الفلوري والموائع الدقيقة لدراسة كيفية تنظيم البروتينات المرتبطة بالأكتين لتجميع خيوط الأكتين وتفكيكها. باستخدام الموائع الدقيقة ، نحن قادرون على تحديد التفاعلات التي تحدث على عشرات خيوط الأكتين الفردية في وقت واحد ، مع التحكم بدقة في الظروف الكيميائية الحيوية والميكانيكية. تذكر أن المحاليل يتم حقنها أولا بالتوازي حتى تصل إلى الغرفة ، وبعد ذلك ، يتم تعريض الخيوط بالتتابع لكل محلول عن طريق تغيير إعداد الضغط.لبدء إعداد polydimethylsiloxane ، أو PDMS ، تجميع الغرفة ، قم بتسخين الصفيحة الساخنة إلى 100 درجة مئوية. قم بتعريض غرفة PDMS نظيفة وغطاء زجاجي واحد ينزلق في طبق بتري نظيف للأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في منظف عميق للأشعة فوق البنفسجية. عند الانتهاء ، ضع غرفة PDMS فوق الغطاء بحيث يتم وضع السطحين المعرضين مباشرة للأشعة فوق البنفسجية على اتصال.لإزالة فقاعات الهواء المحاصرة في واجهة انزلاق غطاء PDMS ، اضغط برفق على سطح الغرفة بإصبع. اضغط بقوة على الزوايا والجوانب ، مما يضمن عدم ملامسة سقف الغرفة للسطح الزجاجي. ضع الغرفة مع الجزء السفلي الزجاجي المواجه للصفيحة الساخنة عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.ثم استخدم الغرفة على الفور ، أو قم بتخزينها في طبق بتري نظيف لمدة أسبوع. لشطف أنبوب المدخل والمخرج ، املأ أنبوب خزان واحد سعة 2 ملليلتر ب 300 ميكرولتر من F-buffer ، وقم بتثبيته على حامل الموائع الدقيقة ، واضبط الضغط على 300 ملليبار. دع خمس إلى ثماني قطرات من F-buffer تضيع هباء، ثم اضبط الضغط على الصفر وكرر الإجراء لكل قناة.بعد ذلك ، اضبط الضغط على المخرج على أنبوب الخزان من أربعة إلى 50 مللي بار ، بمجرد خروج قطرة من طرف الأنابيب ، قم بتوصيل الأنبوب بمخرج غرفة PDMS. عندما يملأ السائل الغرفة ويخرج من جميع المداخل ، اضبط ضغط المخرج على 20 ملليبار. في وقت لاحق ، اضبط الضغط على أنبوب الخزان إلى 1 إلى 50 ملليبار.لتجنب إدخال فقاعات الهواء ، تأكد من خروج قطرة من الأنبوب ومدخل PDMS قبل توصيل الأنبوب بمدخل واحد. اضبط ضغط المدخل على 30 مللي بار. بعد توصيل المدخلين اثنين وثلاثة كما هو موضح ، اضبط ضغط جميع المداخل على 20 ملليبار ، وضغط المخرج على صفر ملليبار.تأكد من أن معدلات التدفق في المداخل متساوية تقريبا. عند تغيير الخزان ، اضبط جميع ضغوط المدخل على 12 مللي بار وضغط المخرج على 5 ملليبار. لحقن محلول بسرعة ، اضبط ضغط المدخل المقابل على 150 مللي بار ، واضبط الضغط في المداخل الأخرى على حوالي 100 مللي بار ، بحيث يكون معدل التدفق الناتج في المداخل 500 نانولتر في الدقيقة.لتغيير المحلول ، املأ 200 إلى 300 ميكرولتر من المحلول في أنبوب خزان جديد واضبط الضغط على إعداد التغيير. ثم ، قم بفك أنبوب خزان المدخل. بمجرد تشكيل قطرة صغيرة عند طرف الأنابيب ، قم بالمسمار في الأنبوب الجديد باستخدام المحلول الطازج ، وقم بتغيير إعداد الضغط إلى تدفق عال.اعتمادا على تكوين الموائع الدقيقة وهندسة الغرفة ، انتظر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى يملأ المحلول الأنابيب ويصل إلى الغرفة. يمكن اتباع العملية عن طريق قياس الزيادة في التألق بمرور الوقت. من أجل تشغيل السطح ، قم بتغيير المحلول من ثلاثة إلى 200 ميكرولتر من 50 بذرة بيكومولار الطيفية الأكتين في F-buffer ، وحقن المحلول لمدة دقيقتين مع تدفق عالي ثلاثة.بالنسبة للتخميل السطحي ، قم بتغيير الأنبوب الثالث مع 300 ميكرولتر من 5٪ BSA في F-buffer ، ثم حقن لمدة خمس دقائق عند تدفق عال ثلاثة ، تليها خمس دقائق في منتصف التدفق ثلاثة ، مع انخفاض الضغط من سبعة إلى ثمانية ملليبار في القناتين الأولى والثانية للحصول على تدفق مضاد من 100 نانولتر في الدقيقة. سيتم تخميل سطح الغرفة بالكامل BSA. قم بتغيير الأنبوب الثالث إلى F-buffer لشطف القناة لمدة خمس دقائق عند التدفق العالي ثلاثة.في وقت لاحق ، قم بتغيير الأنابيب من واحد إلى ثلاثة باستخدام بروفيلين أكتين ميكرومولار واحد ، و 0.15 ميكرومولار أكتين ، و F buffer ، على التوالي ، كما هو موضح في المخطوطة ، وحقن المحاليل المعدة حديثا باستخدام التدفق العالي وكلها محددة مسبقا لمدة ثلاث إلى أربع دقائق. قم بتشغيل المجهر واضبط وقت التعرض للكاميرا على 100 إلى 200 مللي ثانية ، وليزر الإثارة إلى 10 إلى 20٪ من الطاقة ، وإجمالي تألق الانعكاس الداخلي ، أو عمق TIRF ، عند 200 إلى 300 نانومتر لالتقاط الصور بهدف 60X. بعد ذلك ، اضبط إعداد الضغط على متوسط التدفق لمدة 10 دقائق لتسجيل بلمرة الخيوط بمعدل إطار واحد كل 20 ثانية ، يليه منتصف التدفق اثنان لمدة 15 دقيقة لشيخوخة الخيوط.التقط إزالة البلمرة في وضع التألق عند إطار واحد كل خمس ثوان ، بعد إطار واحد إلى إطارين ، وانتقل إلى منتصف التدفق ثلاثة لتسجيل خيوط إزالة البلمرة عند حوالي 10 وحدات فرعية في الثانية. لإعادة ضبط التجربة ، قم بكسر جميع الخيوط المصنفة بالفلورسنت عن طريق تعريضها باستمرار لليزر بأقصى طاقة لمدة دقيقتين. اختبر ظروفا مختلفة عن طريق تغيير المحاليل واحد أو اثنين أو ثلاثة وحقنها بتدفق عال لمدة ثلاث إلى أربع دقائق.يتم عرض نتائج تجربة البلمرة / إزالة البلمرة الأساسية هنا. تم استخدام الكيموجراف الناتج لتحديد معدلات البلمرة وإزالة البلمرة كميا. عندما تعرضت خيوط الأكتين المزروعة لمحلول cofilin المسمى بالفلورسنت ، تم نوى مجموعات cofilin ونمت نحو النهايات المدببة والشائكة.عندما تتعرض خيوط مفردة للفشن فإنها تشكل حزم تبدو أكثر إشراقا ولا تتماشى تماما مع التدفق. من المهم جدا تجنب إدخال فقاعات الهواء في النظام عند تغيير الأنابيب والانتباه إلى عدم إفراغ أنابيب الخزان. كانت هذه التقنية حاسمة لتطبيق قوى السحب على عشرات الخيوط المفردة ، والنظر في الحساسية الميكانيكية للفورمين والكوفيلين ، وإزالة التفرع ARP2/3.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

عاليه الانتاجيه الكلي الداخلية انعكاس الفلورية والتوجيه العشوائي البصرية أعاده البناء المجهري باستخدام رقاقه فوتوسونيك

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

تصوير البروتينات بودوسيتيك نيفرين، أكتين، وبودوسين مع المجهر التوسع

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...