Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Vi er taknemmelige for B. Ladoux og R.-M. Mège lab for brugen af deres UV-renere udstyr, og J. Heuvingh og 0. du Roure for den indledende træning, vi modtog om forberedelse af forme på siliciumskiver og give tip til mikrofluidik. Vi anerkender finansiering fra European Research Council Grant StG-679116 (til AJ) og Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin og Conformin (til G.R.-L.).

1. Forberedelse af mikrofluidkammer
<ol><li>Vælg en SU-8 masterform med flere kammermønstre. Typiske kamre er krydsformede med tre indløb og et udløb, 20 μm højt og 800 μm bredt (figur 1). Sådanne masterforme kan købes hos eksterne virksomheder eller fremstilles i akademiske laboratorier (f.eks. Gicquel, Y. et al.5).</li>
	<li>Placer tape rundt om kanten af formen.<ol>
<li>Sæt ~ 50 cm lang, 19 mm bred, standard gennemsigtig kontortape (se ...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

Sammenlignet med standard enkeltfilamentmetoder, hvor actinfilamenter forankres til overfladen med flere punkter langs deres længde eller opretholdes tæt på den af et trængselsmiddel såsom methylcellulose, giver mikrofluidik en række fordele. Da interaktioner med overfladen er minimale, undgås de kunstige pauser, som disse interaktioner kan fremkalde under både forlængelse og depolymerisering. Filamenterne er justeret af strømmen parallelt med hinanden, hvilket letter deres overvågning og måling af deres læn...

Samlingen og demonteringen af actinfilamenter og actinfilamentnetværk styres af flere biokemiske reaktioner og afhænger af den mekaniske kontekst. For at få indsigt i disse komplekse mekanismer er det uvurderligt at kunne observere individuelle reaktioner på individuelle filamenter (i tilstrækkeligt stort antal). I løbet af de sidste årtier har observation af dynamiske actinfilamenter i realtid, hovedsagelig ved hjælp af tirf-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence), vist sig som en nøgleteknik og har givet en imponerende liste over resultater, der ikke kunne have været opnået med biokemiske analyser i bulkopløsning1.
For at opnå dette skal man opretholde fluorescerende mærkede actinfilamenter tæt på overfladen af mikroskopdækslet, mens man udsætter dem for opløsninger af actinbindende proteiner (ABP'er), som også kan mærkes fluorescerende. Dette giver et middel til at overvåge begivenheder, der finder sted på individuelle filamenter under velkontrollerede biokemiske forhold, og dermed kvantificere reaktionshastigheder. Der bør dog overvejes en række specifikke begrænsninger. Kunstig vedligeholdelse af filamenter tæt på overfladen, ofte takket være flere forankringspunkter eller ved hjælp af et trængselsmiddel såsom methylcellulose, kan ændre deres adfærd (f.eks. Forårsage pauser i deres polymerisation og depolymerisering2). Sporing af konturen af hvert filament kan være udfordrende, især hvis nye filamenter eller filamentfragmenter akkumuleres i synsfeltet over tid. Reaktionerne finder sted i et endeligt volumen, hvor koncentrationen af actinmonomerer og ABP'er kan variere over tid, hvilket potentielt gør det vanskeligt at udlede nøjagtige hastighedskonstanter. Endelig er det vanskeligt at forny eller ændre opløsningen af ABP'er på mindre end 30 s og vil ofte føre til inhomogent proteinindhold i prøven.
For lidt over 10 år siden, inspireret af hvad der allerede blev gjort for at studere individuelle Deoxyribonukleinsyre (DNA) tråde3, introducerede vi en ny teknik baseret på mikrofluidik til at observere og manipulere individuelle actinfilamenter4. Det giver en mulighed for at omgå de førnævnte begrænsninger af klassiske enkeltfilamentteknikker. I disse mikrofluidiske assays dyrkes actinfilamenter fra spectrin-actinfrø adsorberet på dækslippen. Filamenter er således forankret i den ene ende kun til bunden af det mikrofluidiske kammer og svinger over overfladen uden at klæbe. Filamenter flugter med strømmen af indgående opløsninger, hvorved overvågningen af deres konturlængde lettes, og de opretholdes i et lavt område over dækslen, hvor TIRF kan anvendes. Forskellige opløsninger strømmer samtidig ind i kammeret uden blanding, og filamenterne kan udsættes for dem sekventielt og hurtigt.
Her foreslår vi en række grundlæggende protokoller til opsætning af enkelt-actin-filament mikrofluidik-assays i laboratoriet. Dækslips og mikrofluidikkamre kan fremstilles på forhånd (om en halv dag), og selve eksperimentet, hvor flere biokemiske forhold kan testes, udføres på mindre end en dag.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

For at dechiffrere de komplekse molekylære mekanismer, der regulerer samlingen og demonteringen af actinfilamenter, er det et stort aktiv at overvåge individuelle reaktioner lever under velkontrollerede forhold. For at gøre dette er der opstået levende enkeltfilamenteksperimenter i løbet af de sidste 20 år, hovedsagelig ved hjælp af TIRF-mikroskopi (total internal reflection fluorescens), og har givet en række nøgleresultater. I 2011 introducerede vi enkle mikrofluidik i disse assays for yderligere at udvide mulighederne for disse eksperimenter og for at undgå tilbagevendende problematiske artefakter. Denne undersøgelse beskriver vores grundlæggende protokol, hvor individuelle actinfilamenter er forankret i den ene ende til den passiverede dækslipoverflade, justeres med strømmen og successivt kan udsættes for forskellige proteinopløsninger. Vi præsenterer også protokollerne til specifikke applikationer og forklarer, hvordan kontrollerede mekaniske kræfter kan påføres takket være den viskøse træk i den flydende opløsning. Vi fremhæver de tekniske forbehold i disse eksperimenter og præsenterer kort mulige udviklinger baseret på denne teknik. Disse protokoller og forklaringer sammen med nutidens tilgængelighed af brugervenligt mikrofluidikudstyr bør give ikke-specialister mulighed for at implementere dette assay i deres laboratorier.

For alle de ovenfor beskrevne eksperimenter skal fluorescerende mærkede actinfilamenter være tydeligt synlige med god kontrast, hvilket indikerer lav baggrundsfluorescens fra overfladen (figur 4, se Supplerende fil 1 for fejlfinding af almindelige problemer). Actinfilamenter bør heller ikke klæbe til overfladen: Når den dominerende strømningshastighed er lav, skal actinfilamenternes laterale udsving være mærkbare, når man observerer dem levende og give en mulighed f...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Vi præsenterer protokoller for enkle actinfilamentmikrofluidiske assays i kombination med fluorescensmikroskopi, der gør det muligt for en nøjagtigt at overvåge individuelle actinfilamenter i realtid, mens de sekventielt udsættes for forskellige proteinopløsninger.

Brug af mikrofluidik og fluorescensmikroskopi til at studere samlingsdynamikken i enkeltaktinfilamenter og bundter

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Vi kombinerer fluorescensmikroskopi med mikrofluidik for at studere, hvordan actinbindende proteiner regulerer samlingen og demonteringen af actinfilamenter. Med mikrofluidik er vi i stand til at kvantificere reaktioner, der sker på snesevis af individuelle actinfilamenter samtidigt, samtidig med at biokemiske og mekaniske forhold kontrolleres præcist. Husk, at opløsninger først injiceres parallelt, indtil de når kammeret, og derefter udsættes filamenter sekventielt for hver opløsning ved at ændre trykindstillingen.For at starte forberedelsen af polydimethylsiloxan eller PDMS, kammersamling, forvarm kogepladen til 100 grader Celsius. Udsæt et renset PDMS-kammer og et glasdæksel i en ren petriskål for ultraviolet lys i tre til fem minutter i en dyb UV-renser. Når du er færdig, skal du placere PDMS-kammeret over dækslippet, så de to overflader, der er direkte udsat for UV, sættes i kontakt.For at fjerne luftbobler, der er fanget ved PDMS-dækslipgrænsefladen, skal du forsigtigt trykke på overfladen af kammeret med en finger. Tryk kraftigt over hjørner og sider, og sørg for, at kammerets loft ikke kommer i kontakt med glasoverfladen. Placer kammeret med glasbunden vendt mod kogepladen ved 100 grader Celsius i fem minutter.Brug derefter kammeret med det samme, eller opbevar det i en ren petriskål i en uge. For at skylle indløbs- og udløbsrøret skal du fylde et 2 milliliter reservoirrør med 300 mikroliter F-buffer, skrue det på den mikrofluidiske holder og indstille trykket til 300 millibar. Lad fem til otte dråber F-buffer gå til spilde, indstil derefter trykket til nul og gentag proceduren for hver kanal.Indstil derefter trykket for udløbet på reservoirrøret fire til 50 millibar, når en dråbe kommer ud fra slangespidsen, skal du forbinde slangen til udløbet i PDMS-kammeret. Når væsken fylder kammeret og kommer ud af alle indløb, indstilles udløbstrykket til 20 millibar. Senere indstilles trykket for reservoirrøret til 1 til 50 millibar.For at undgå at indføre luftbobler skal du sikre dig, at der kommer en dråbe ud af slangen og PDMS-indløbet, før du tilslutter slangen til indløbet. Indstil indløbets tryk til 30 millibar. Efter tilslutning af indløbene to og tre som vist indstilles trykket på alle indløb til 20 millibar og udløbstrykket til nul millibar.Sørg for, at strømningshastighederne i indløbene er nogenlunde ens. Når du skifter reservoir, skal du indstille alle indløbstryk til 12 millibar og udløbstrykket til 5 millibar. For hurtigt at injicere en opløsning indstilles trykket for det tilsvarende indløb til 150 millibar og justeres trykket i de andre indløb til omkring 100 millibar, således at den resulterende strømningshastighed i indløbene er 500 nanoliter pr. Minut.For at ændre opløsningen skal du fylde 200 til 300 mikroliter af opløsningen i et nyt reservoirrør og indstille trykket til ændringsindstillingen. Skru derefter reservoirrøret af indløbet. Når der er dannet en lille dråbe ved slangespidsen, skrues det nye rør i med den friske opløsning, ændres trykindstillingen til højt flow.Afhængigt af den mikrofluidiske konfiguration og en kammergeometri skal du vente i tre til fem minutter på, at opløsningen udfylder slangen og når kammeret. Processen kan følges ved at måle stigningen i fluorescens over tid. Til overfladefunktionalisering skal du ændre opløsning tre til 200 mikroliter af 50 picomolære spectrin-actinfrø i F-buffer og injicere opløsningen i to minutter med høj strømning tre.Til overflade passivering skal du skifte rør tre med 300 mikroliter 5% BSA i F-buffer og derefter injicere i fem minutter ved høj flow tre efterfulgt af fem minutter ved midtstrøm tre med reduceret tryk på syv til otte millibar i kanal et og to for at få en modstrøm på 100 nanoliter pr. Minut. Hele kammeroverfladen vil blive BSA-passiveret. Skift rør tre til F-buffer for at skylle kanalen i fem minutter ved høj flow tre.Senere skal du skifte rør en til tre med en mikromolar actinprofilin, henholdsvis 0,15 mikromolar actin og F-buffer, som forklaret i manuskriptet, og injicere frisklavede opløsninger ved hjælp af høj flow alle forudindstillede i tre til fire minutter. Tænd for mikroskopet, og juster kameraets eksponeringstid til 100 til 200 millisekunder, excitationslaser til 10 til 20% effekt og total intern refleksionsfluorescens eller TIRF-dybde ved 200 til 300 nanometer for at tage billederne med et 60X mål. Indstil derefter trykindstillingen til midtstrøm en i 10 minutter for at registrere filamentpolymerisationen med en ramme hvert 20. sekund efterfulgt af midtstrøm to i 15 minutter for filamentældning.Optag depolymerisering i epifluorescens-tilstand ved en ramme hvert femte sekund, efter et til to billeder, skift til midtstrøm tre for at registrere filamenter, der depolymeriserer med omkring 10 underenheder pr. Sekund. For at nulstille eksperimentet skal du bryde alle fluorescerende mærkede filamenter ved kontinuerligt at udsætte dem for laseren ved maksimal effekt i to minutter. Test forskellige forhold ved at skifte opløsning et, to eller tre og injicere dem ved højt flow i tre til fire minutter.Resultatet af det grundlæggende polymerisations-/depolymerisationseksperiment præsenteres her. De resulterende kymografer blev brugt til at kvantificere polymerisations- og depolymerisationshastighederne. Når de dyrkede actinfilamenter blev udsat for en fluorescerende mærket cofilinopløsning, blev cofilinklynger nukleeret og voksede mod de spidse og piggede ender.Når enkelte filamenter udsættes for fascin, danner de bundter, der ser lysere ud og ikke er perfekt justeret med strømmen. Det er meget vigtigt at undgå at indføre luftbobler i systemet, når du skifter rør og være opmærksom på ikke at få reservoirrør tomme. Denne teknik var afgørende for at anvende trækkraft over snesevis af enkeltfilamenter, se på formin og cofilin mekanisk følsomhed og ARP2/3 debranching.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Høj gennemløb total intern refleksion fluorescens og direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi ved hjælp af en fotonisk chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisering af Diffusional Dynamics of Gold Nanorods på cellemembran ved hjælp af Single Nanoparticle Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Billeddannelse af podocytiske proteiner Nephrin, Actin og Podocin med udvidelsesmikroskopi

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...