Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à B. Ladoux et R.-M. Laboratoire Mège pour l’utilisation de leur équipement de nettoyage UV, et J. Heuvingh et 0. du Roure pour la formation initiale que nous avons reçue sur la préparation de moules sur plaquettes de silicium et fournissant des conseils sur la microfluidique. Nous reconnaissons le financement de la subvention StG-679116 du Conseil européen de la recherche (à A.J.) et des subventions de l’Agence nationale de la recherche Muscactin et Conformin (à G.R.-L.).

1. Préparation de la chambre microfluidique
<ol><li>Sélectionnez un moule maître SU-8 avec plusieurs motifs de chambre. Les chambres typiques sont en forme de croix avec trois entrées et une sortie, de 20 μm de haut et 800 μm de large (Figure 1). Ces moules maîtres peuvent être achetés auprès d’entreprises externes ou fabriqués dans des laboratoires universitaires (par exemple, Gicquel, Y. et al.5).</li>
	<li>Placez du ruban adhésif au...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

Par rapport aux méthodes standard à filament unique où les filaments d’actine sont ancrés à la surface par plusieurs points le long de leur longueur ou maintenus à proximité de celle-ci par un agent d’encombrement tel que la méthylcellulose, la microfluidique offre un certain nombre d’avantages. Comme les interactions avec la surface sont minimes, les pauses artificielles que ces interactions peuvent induire pendant l’allongement et la dépolymérisation sont évitées. Les filaments sont alignés par l?...

L’assemblage et le démontage des filaments d’actine et des réseaux de filaments d’actine sont contrôlés par plusieurs réactions biochimiques et dépendent du contexte mécanique. Afin de mieux comprendre ces mécanismes complexes, il est inestimable de pouvoir observer des réactions individuelles sur des filaments individuels (en nombre suffisant). Au cours des dernières décennies, l’observation des filaments d’actine dynamiques en temps réel, principalement à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), est devenue une technique clé et a fourni une liste impressionnante de résultats qui n’auraient pas pu être obtenus avec des tests biochimiques en solution en vrac1.
Pour ce faire, il faut maintenir des filaments d’actine marqués par fluorescence près de la surface du couvercle du microscope tout en les exposant à des solutions de protéines de liaison à l’actine (ABP), qui peuvent également être marquées par fluorescence. Cela permet de surveiller les événements qui se produisent sur des filaments individuels dans des conditions biochimiques bien contrôlées et de quantifier ainsi les taux de réaction. Cependant, un certain nombre de limitations spécifiques devraient être prises en compte. Maintenir artificiellement les filaments près de la surface, souvent grâce à plusieurs points d’ancrage ou en utilisant un agent d’encombrement tel que la méthylcellulose, peut modifier leur comportement (par exemple, provoquer des pauses dans leur polymérisation et leur dépolymérisation2). Le suivi du contour de chaque filament peut être difficile, en particulier si de nouveaux filaments ou fragments de filament s’accumulent dans le champ de vision au fil du temps. Les réactions ont lieu dans un volume fini où la concentration de monomères d’actine et d’ABP peut varier au fil du temps, ce qui peut rendre difficile la détermination de constantes de vitesse précises. Enfin, le renouvellement ou la modification de la solution d’ABP est difficile à réaliser en moins de 30 s et conduira souvent à une teneur en protéines inhomogène dans l’échantillon.
Il y a un peu plus de 10 ans, inspirés par ce qui a déjà été fait pour étudier les brins individuels d’acide désoxyribonucléique (ADN)3, nous avons introduit une nouvelle technique basée sur la microfluidique pour observer et manipuler des filaments d’actine individuels4. Il permet de contourner les limitations susmentionnées des techniques classiques à filament unique. Dans ces essais microfluidiques, les filaments d’actine sont cultivés à partir de graines de spectrine-actine adsorbées sur le couvercle. Les filaments sont ainsi ancrés par une extrémité uniquement au fond de la chambre microfluidique et fluctuent au-dessus de la surface sans coller. Les filaments s’alignent sur le flux des solutions entrantes, ce qui facilite la surveillance de leur longueur de contour et les maintient dans une région peu profonde au-dessus de la glissière de couverture où le TIRF peut être utilisé. Différentes solutions sont simultanément acheminées dans la chambre sans mélange, et les filaments peuvent y être exposés séquentiellement et rapidement.
Ici, nous proposons une série de protocoles de base pour mettre en place des tests microfluidiques à filament d’actine unique en laboratoire. Les couvercles et les chambres microfluidiques peuvent être préparés à l’avance (en une demi-journée), et l’expérience elle-même, où plusieurs conditions biochimiques peuvent être testées, est réalisée en moins d’une journée.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

Afin de déchiffrer les mécanismes moléculaires complexes qui régulent l’assemblage et le désassemblage des filaments d’actine, il est un grand atout de surveiller les réactions individuelles en direct dans des conditions bien contrôlées. Pour ce faire, des expériences en direct à filament unique ont émergé au cours des 20 dernières années, principalement en utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF), et ont fourni une mine de résultats clés. En 2011, afin d’élargir davantage les possibilités de ces expériences et d’éviter des artefacts problématiques récurrents, nous avons introduit une microfluidique simple dans ces essais. Cette étude détaille notre protocole de base, où les filaments d’actine individuels sont ancrés par une extrémité à la surface de la couverture passivée, s’alignent sur l’écoulement et peuvent être exposés successivement à différentes solutions protéiques. Nous présentons également les protocoles pour des applications spécifiques et expliquons comment des forces mécaniques contrôlées peuvent être appliquées, grâce à la traînée visqueuse de la solution fluide. Nous soulignons les mises en garde techniques de ces expériences et présentons brièvement les développements possibles basés sur cette technique. Ces protocoles et explications, ainsi que la disponibilité actuelle d’équipements microfluidiques faciles à utiliser, devraient permettre aux non-spécialistes de mettre en œuvre ce test dans leurs laboratoires.

Pour toutes les expériences décrites ci-dessus, les filaments d’actine marqués par fluorescence doivent être clairement visibles, avec un bon contraste, indiquant une faible fluorescence de fond de la surface (Figure 4, voir le fichier supplémentaire 1 pour le dépannage des problèmes courants). Les filaments d’actine ne doivent pas non plus coller à la surface : lorsque le débit dominant est faible, les fluctuations latérales des filaments d’actine doivent ê...

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Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Nous présentons des protocoles pour des tests microfluidiques de filaments d’actine simples, en combinaison avec la microscopie à fluorescence, qui permettent de surveiller avec précision les filaments d’actine individuels en temps réel tout en les exposant séquentiellement à différentes solutions protéiques.

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Nous combinons la microscopie à fluorescence avec la microfluidique pour étudier comment les protéines de liaison à l’actine régulent l’assemblage et le désassemblage des filaments d’actine. Avec la microfluidique, nous sommes en mesure de quantifier les réactions qui se produisent simultanément sur des dizaines de filaments d’actine individuels, tout en contrôlant avec précision les conditions biochimiques et mécaniques. Rappelez-vous que les solutions sont d’abord injectées en parallèle jusqu’à ce qu’elles atteignent la chambre, puis que les filaments sont exposés séquentiellement à chaque solution en modifiant le réglage de la pression.Pour commencer la préparation du polydiméthylsiloxane, ou PDMS, assemblage de la chambre, préchauffer la plaque chauffante à 100 degrés Celsius. Exposez une chambre PDMS nettoyée et un couvercle en verre glissés dans une boîte de Petri propre à la lumière ultraviolette pendant trois à cinq minutes dans un nettoyant UV profond. Lorsque vous avez terminé, placez la chambre PDMS sur le couvercle de manière à ce que les deux surfaces directement exposées aux UV soient mises en contact.Pour éliminer les bulles d’air piégées à l’interface de glissement du couvercle PDMS, appuyez doucement sur la surface de la chambre avec un doigt. Appuyez fortement sur les coins et les côtés, en veillant à ce que le plafond de la chambre n’entre pas en contact avec la surface vitrée. Placez la chambre avec le fond en verre face à la plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ensuite, utilisez la chambre immédiatement ou conservez-la dans une boîte de Pétri propre pendant une semaine. Pour rincer le tube d’entrée et de sortie, remplissez un tube de réservoir de 2 millilitres avec 300 microlitres de tampon F, vissez-le sur le support microfluidique et réglez la pression à 300 millibars. Laissez cinq à huit gouttes de tampon F se perdre, puis mettez la pression à zéro et répétez la procédure pour chaque canal.Ensuite, réglez la pression pour la sortie sur le tube de réservoir de quatre à 50 millibars, une fois qu’une gouttelette sort de la pointe du tube, connectez le tube à la sortie de la chambre PDMS. Lorsque le liquide remplit la chambre et sort de toutes les entrées, réglez la pression de sortie à 20 millibars. Plus tard, réglez la pression du tube du réservoir à 1 à 50 millibars.Pour éviter d’introduire des bulles d’air, assurez-vous qu’une gouttelette sort du tube et de l’entrée PDMS avant de connecter le tube à l’entrée. Réglez la pression de l’entrée à 30 millibars. Après avoir connecté les entrées deux et trois comme démontré, réglez la pression de toutes les entrées à 20 millibars et la pression de sortie à zéro millibars.Assurez-vous que les débits dans les entrées sont à peu près égaux. Lorsque vous changez le réservoir, réglez toutes les pressions d’entrée à 12 millibars et la pression de sortie à 5 millibars. Pour injecter rapidement une solution, réglez la pression de l’entrée correspondante à 150 millibars et ajustez la pression dans les autres entrées à environ 100 millibars, de sorte que le débit résultant dans les entrées soit de 500 nanolitres par minute.Pour changer la solution, remplissez 200 à 300 microlitres de la solution dans un nouveau tube de réservoir et réglez la pression sur le réglage de changement. Ensuite, dévissez le tube de réservoir de l’entrée. Une fois qu’une petite gouttelette s’est formée à l’extrémité du tuyau, vissez le nouveau tube avec la solution fraîche, modifiez le réglage de la pression à haut débit.Selon la configuration microfluidique et la géométrie de la chambre, attendez trois à cinq minutes que la solution remplisse le tube et atteigne la chambre. Le processus peut être suivi en mesurant l’augmentation de la fluorescence au fil du temps. Pour la fonctionnalisation de surface, changer la solution trois à 200 microlitres de 50 graines de spectrine-actine picomolaire dans un tampon F, et injecter la solution pendant deux minutes avec un débit élevé de trois.Pour la passivation de surface, changez le tube trois avec 300 microlitres de 5% BSA dans le tampon F, puis injectez pendant cinq minutes à haut débit trois, suivi de cinq minutes à débit moyen trois, avec une pression réduite de sept à huit millibars dans les canaux un et deux pour obtenir un contre-courant de 100 nanolitres par minute. Toute la surface de la chambre sera passivée BSA. Remplacez le tube trois par un tampon F pour rincer le canal pendant cinq minutes à débit élevé trois.Plus tard, changez les tubes un à trois avec une profiline d’actine micromolaire, une actine micromolaire de 0,15 et un tampon F, respectivement, comme expliqué dans le manuscrit, et injectez des solutions fraîchement préparées en utilisant le préréglage à haut débit pendant trois à quatre minutes. Allumez le microscope et ajustez le temps d’exposition de l’appareil photo à 100 à 200 millisecondes, le laser d’excitation à 10 à 20% de puissance et la fluorescence totale de réflexion interne, ou profondeur TIRF, à 200 à 300 nanomètres pour capturer les images avec un objectif 60X. Ensuite, réglez le réglage de pression sur un débit moyen pendant 10 minutes pour enregistrer la polymérisation du filament au rythme d’une image toutes les 20 secondes, suivi de deux à débit moyen pendant 15 minutes pour le vieillissement du filament.Capturez la dépolymérisation en mode épifluorescence à une image toutes les cinq secondes, après une à deux images, passez à un flux moyen trois pour enregistrer les filaments dépolymérisés à environ 10 sous-unités par seconde. Pour réinitialiser l’expérience, cassez tous les filaments marqués par fluorescence en les exposant continuellement au laser à la puissance maximale pendant deux minutes. Testez différentes conditions en changeant les solutions une, deux ou trois et en les injectant à haut débit pendant trois à quatre minutes.Le résultat de l’expérience de polymérisation/dépolymérisation de base est présenté ici. Les kymographes résultants ont été utilisés pour quantifier les taux de polymérisation et de dépolymérisation. Lorsque les filaments d’actine cultivés ont été exposés à une solution de cofiline marquée par fluorescence, les amas de cofiline ont été nucléés et se sont développés vers les extrémités pointues et barbelées.Lorsque des filaments simples sont exposés à la fascine, ils forment des faisceaux qui semblent plus brillants et ne sont pas parfaitement alignés avec l’écoulement. Il est très important d’éviter d’introduire des bulles d’air dans le système lors du changement de tubes et de faire attention à ne pas vider les tubes du réservoir. Cette technique était essentielle pour appliquer des forces de traction sur des dizaines de filaments simples, examiner la sensibilité mécanique à la formine et à la cofiline et le débranchement ARP2/3.

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