Name: using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00
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Wir danken den B. Ladoux und R.-M. Mège Labor für die Verwendung ihrer UV-Reiniger Ausrüstung, und J. Heuvingh und 0. du Roure für die erste Schulung, die wir über die Vorbereitung von Formen auf Siliziumwafern und die Bereitstellung von Tipps zur Mikrofluidik erhalten haben. Wir danken für die Förderung durch den Europäischen Forschungsratszuschuss StG-679116 (an A.J.) und die Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin und Conformin (an G.R.-L.).

1. Mikrofluidische Kammervorbereitung
<ol><li>Wählen Sie eine SU-8 Masterform mit mehreren Kammermustern. Typische Kammern sind kreuzförmig mit drei Einlässen und einem Auslass, 20 μm hoch und 800 μm breit (Abbildung 1). Solche Master-Formen können von externen Unternehmen gekauft oder in akademischen Labors (z. B. Gicquel, Y. et al.5) hergestellt werden.</li>
	<li>Legen Sie Klebeband um den Rand der Form.<ol>
<li>Legen Sie ~50 cm langes, 19 m...

<ol>
	<li>Wioland, H., J&#233;gou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules.">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119 (2022).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li><li>J&#233;gou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin.">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161 (2011).</li><li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography.">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).</li><li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress.">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li><li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins.">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li><li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth.">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963 (2019).</li><li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+phosphate+release+from+Arp2/3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches.">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li><li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADF/Cofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends.">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li><li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores.">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li><li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin.">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li><li>J&#233;gou, A., Carlier, M. -. F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments.">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883 (2013).</li><li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging.">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li><li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin.">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li><li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers.">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li><li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro.">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li><li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia.">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments.">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).</li><li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsional+stress+generated+by+ADF/cofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing.">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li><li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics.">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548 (2021).</li><li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin.">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li><li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., J&#233;gou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly.">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li><li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms.">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li><li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane.">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li><li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments.">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li><li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres.">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li><li>Le Clainche, C., Carlier, M. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+motility+assay.">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 1-20 (2004).</li><li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network.">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability.">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470 (2016).</li><li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout.">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li><li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity.">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li><li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics.">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li></ol>

Im Vergleich zu Standard-Single-Filament-Verfahren, bei denen Aktinfilamente entlang ihrer Länge durch mehrere Punkte an der Oberfläche verankert oder durch ein Crowding-Mittel wie Methylcellulose nahe an der Oberfläche gehalten werden, bietet die Mikrofluidik eine Reihe von Vorteilen. Da die Wechselwirkungen mit der Oberfläche minimal sind, werden die künstlichen Pausen, die diese Wechselwirkungen sowohl während der Dehnung als auch der Depolymerisation auslösen können, vermieden. Die Filamente werden durch die ...

Der Auf- und Abbau von Aktinfilamenten und Aktinfilamentnetzwerken wird durch mehrere biochemische Reaktionen gesteuert und hängt vom mechanischen Kontext ab. Um Einblick in diese komplexen Mechanismen zu erhalten, ist es von unschätzbarem Wert, einzelne Reaktionen auf einzelne Filamente (in ausreichend großer Anzahl) beobachten zu können. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Beobachtung dynamischer Aktinfilamente in Echtzeit, meist unter Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence), zu einer Schlüsseltechnik entwickelt und eine beeindruckende Liste von Ergebnissen geliefert, die mit biochemischen Assays in Bulk-Lösung nicht hätten erzielt werden können1.
Um dies zu erreichen, muss man fluoreszierend markierte Aktinfilamente nahe an der Oberfläche des Mikroskop-Deckglases halten, während man sie Lösungen von aktinbindenden Proteinen (ABPs) aussetzt, die auch fluoreszierend markiert werden können. Auf diese Weise können Ereignisse an einzelnen Filamenten unter gut kontrollierten biochemischen Bedingungen überwacht und so die Reaktionsgeschwindigkeiten quantifiziert werden. Es sollten jedoch eine Reihe spezifischer Einschränkungen in Betracht gezogen werden. Die künstliche Aufrechterhaltung von Filamenten in der Nähe der Oberfläche, oft dank mehrerer Verankerungspunkte oder durch die Verwendung eines Überfüllungsmittels wie Methylcellulose, kann ihr Verhalten verändern (z. B. Pausen in ihrer Polymerisation und Depolymerisationverursachen 2). Die Verfolgung der Kontur jedes Filaments kann eine Herausforderung darstellen, insbesondere wenn sich im Laufe der Zeit neue Filamente oder Filamentfragmente im Sichtfeld ansammeln. Die Reaktionen finden in einem endlichen Volumen statt, in dem die Konzentration von Aktinmonomeren und ABPs im Laufe der Zeit variieren kann, was es möglicherweise schwierig macht, genaue Geschwindigkeitskonstanten abzuleiten. Schließlich ist die Erneuerung oder Änderung der Lösung von ABPs in weniger als 30 s schwierig zu erreichen und führt oft zu einem inhomogenen Proteingehalt in der Probe.
Vor etwas mehr als 10 Jahren, inspiriert von dem, was bereits getan wurde, um einzelne Desoxyribonukleinsäure (DNA) Stränge3 zu untersuchen, führten wir eine neue Technik ein, die auf Mikrofluidik basiert, um einzelne Aktinfilamente zu beobachten und zu manipulieren4. Es erlaubt einem, die oben genannten Einschränkungen klassischer Single-Filament-Techniken zu umgehen. In diesen Mikrofluidik-Assays werden Aktinfilamente aus Spektrin-Aktin-Samen gezüchtet, die auf dem Deckglas adsorbiert sind. Filamente werden somit von einem Ende nur am Boden der mikrofluidischen Kammer verankert und schwanken über der Oberfläche, ohne zu kleben. Filamente richten sich an den Fluss eingehender Lösungen aus, erleichtern so die Überwachung ihrer Konturlänge und halten sie in einem flachen Bereich über dem Deckglas, in dem TIRF verwendet werden kann. Verschiedene Lösungen fließen gleichzeitig in die Kammer, ohne zu mischen, und die Filamente können ihnen nacheinander und schnell ausgesetzt werden.
Hier schlagen wir eine Reihe grundlegender Protokolle vor, um Einzelaktin-Filament-Mikrofluidik-Assays im Labor einzurichten. Deckgläser und Mikrofluidikkammern können im Voraus (in einem halben Tag) vorbereitet werden, und das Experiment selbst, bei dem mehrere biochemische Bedingungen getestet werden können, ist in weniger als einem Tag abgeschlossen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Casein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6905</td>
			<td>Used at 8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch (with plunger)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15115-2</td>
			<td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8549</td>
			<td>Used at 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8022</td>
			<td>Used at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Mini-Rack 
			Teflon holder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C14784</td>
			<td>for 8 coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22x40mm 
			Thickness #1.5</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D27802</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0006-D</td>
			<td>component in f-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A20000</td>
			<td>Fluorophore for actin labeling on Lys328.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21338</td>
			<td>To biotinylate actin on Lys328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td>Glass cleaning detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td>811kn.18</td>
			<td>vacuum pump (ultimate vacuum: 240 mbar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic invisible tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>7100024666</td>
			<td>standard transparent office tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrewtube</td>
			<td>Simport</td>
			<td>T341-6T</td>
			<td>2 mL microfluidic reservoir tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 1: Flow Unit S</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>FLU-S-D-PCKB</td>
			<td>Flowmeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 2: Fluiwell-4C-2 mL</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>14002001PCK</td>
			<td>Reservoir holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic device Part 3: MFCS-EZ</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>EZ-11000001 
			EZ-00345001</td>
			<td>Pressure controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model 42 - UVO-Cleaner</td>
			<td>Jelight Inc.</td>
			<td>42-220</td>
			<td>Ultraviolet cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>NU-805-488</td>
			<td>ATP-ATTO used to label actin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutravidin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLL-PEG</td>
			<td>SuSoS</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td>
			<td>Use at 1 mg/mL in PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicon Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1673921</td>
			<td>Contains PDMS base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyetheretherketone (PEEK) tubing</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z226661</td>
			<td>&#8220;Blue&#8221; : I.D. = 0.25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety blow gun</td>
			<td>Coilhose Pneumatics</td>
			<td>700-S</td>
			<td>filtered air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-0701P</td>
			<td>connect PEEK to coupler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel catheter coupler</td>
			<td>Prime Bioscience</td>
			<td>SC22/15</td>
			<td>Inserted into PDMS inlets and outlet to connect to PEEK tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoplastic film</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PM996</td>
			<td>Standard &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaning bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>USC200TH</td>
			<td>To accomodate 1 L beakers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dessicator</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42022-0000</td>
			<td>to degas the PDMS or solutions</td>
		</tr>
	</tbody>
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using microfluidics and fluorescence microscopy to study the assembly dynamics of single actin filaments and bundles

Um die komplexen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die den Auf- und Abbau von Aktinfilamenten regulieren, ist es ein großer Vorteil, einzelne Reaktionen live unter gut kontrollierten Bedingungen zu überwachen. Zu diesem Zweck sind in den letzten 20 Jahren Live-Single-Filament-Experimente entstanden, die hauptsächlich die Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF) verwenden, und haben eine Fülle von Schlüsselergebnissen geliefert. Um die Möglichkeiten dieser Experimente weiter auszubauen und wiederkehrende problematische Artefakte zu vermeiden, haben wir 2011 einfache Mikrofluidik in diese Assays eingeführt. Diese Studie beschreibt unser grundlegendes Protokoll, bei dem einzelne Aktinfilamente an einem Ende an der passivierten Deckglasoberfläche verankert sind, sich an der Strömung ausrichten und nacheinander verschiedenen Proteinlösungen ausgesetzt werden können. Wir stellen auch die Protokolle für spezifische Anwendungen vor und erklären, wie kontrollierte mechanische Kräfte dank des viskosen Widerstands der fließenden Lösung angewendet werden können. Wir heben die technischen Vorbehalte dieser Experimente hervor und stellen kurz mögliche Entwicklungen vor, die auf dieser Technik basieren. Diese Protokolle und Erklärungen, zusammen mit der heutigen Verfügbarkeit von einfach zu bedienenden Mikrofluidikgeräten, sollten es Nicht-Spezialisten ermöglichen, diesen Assay in ihren Labors zu implementieren.

Für alle oben beschriebenen Experimente sollten fluoreszierend markierte Aktinfilamente deutlich sichtbar sein, mit gutem Kontrast, was auf eine geringe Hintergrundfluoreszenz von der Oberfläche hinweist (Abbildung 4, siehe Ergänzende Datei 1 zur Fehlerbehebung bei häufigen Problemen). Aktinfilamente sollten auch nicht an der Oberfläche haften: Wenn die dominante Durchflussrate niedrig ist, sollten die seitlichen Schwankungen der Aktinfilamente bei der Beobachtung bei l...

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Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

Wir präsentieren Protokolle für einfache mikrofluidische Aktinfilament-Assays in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie, die es ermöglichen, einzelne Aktinfilamente in Echtzeit genau zu überwachen und sie nacheinander verschiedenen Proteinlösungen auszusetzen.

Verwendung von Mikrofluidik und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der Montagedynamik von einzelnen Actin-Filamenten und -Bündeln

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

Wir kombinieren Fluoreszenzmikroskopie mit Mikrofluidik, um zu untersuchen, wie Aktin-bindende Proteine den Auf- und Abbau von Aktinfilamenten regulieren. Mit der Mikrofluidik sind wir in der Lage, Reaktionen an Dutzenden von einzelnen Aktinfilamenten gleichzeitig zu quantifizieren und gleichzeitig die biochemischen und mechanischen Bedingungen präzise zu kontrollieren. Denken Sie daran, dass Lösungen zuerst parallel injiziert werden, bis sie die Kammer erreichen, und dann Filamente nacheinander jeder Lösung ausgesetzt werden, indem die Druckeinstellung geändert wird.Um mit der Herstellung der Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Kammermontage zu beginnen, heizen Sie die Heizplatte auf 100 Grad Celsius vor. Setzen Sie eine gereinigte PDMS-Kammer und einen Glasdeckel in einer sauberen Petrischale drei bis fünf Minuten lang in einem tiefen UV-Reiniger ultraviolettem Licht aus. Wenn Sie fertig sind, positionieren Sie die PDMS-Kammer über dem Deckglas so, dass die beiden Oberflächen, die direkt UV ausgesetzt sind, in Kontakt gebracht werden.Um Luftblasen zu entfernen, die an der PDMS-Abdeckungsschlupfschnittstelle eingeschlossen sind, drücken Sie vorsichtig mit einem Finger auf die Oberfläche der Kammer. Drücken Sie stark über Ecken und Seiten, um sicherzustellen, dass die Decke der Kammer nicht mit der Glasoberfläche in Berührung kommt. Stellen Sie die Kammer mit dem Glasboden zur heißen Platte bei 100 Grad Celsius für fünf Minuten.Verwenden Sie die Kammer dann sofort oder bewahren Sie sie eine Woche lang in einer sauberen Petrischale auf. Um den Ein- und Auslassschlauch zu spülen, füllen Sie ein 2-Milliliter-Reservoirrohr mit 300 Mikrolitern F-Puffer, schrauben Sie es auf den Mikrofluidikhalter und stellen Sie den Druck auf 300 Millibar ein. Lassen Sie fünf bis acht Tropfen F-Puffer verschwenden, stellen Sie dann den Druck auf Null ein und wiederholen Sie den Vorgang für jeden Kanal.Als nächstes stellen Sie den Druck für den Auslass auf dem Reservoirrohr vier bis 50 Millibar ein, sobald ein Tröpfchen aus der Schlauchspitze austritt, schließen Sie den Schlauch an den Auslass der PDMS-Kammer an. Wenn die Flüssigkeit die Kammer füllt und aus allen Einlässen kommt, stellen Sie den Ausgangsdruck auf 20 Millibar ein. Stellen Sie später den Druck für das Reservoirrohr auf 1 bis 50 Millibar ein.Um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass ein Tröpfchen aus dem Schlauch und dem PDMS-Einlass kommt, bevor Sie den Schlauch an den Einlass anschließen. Stellen Sie den Druck des Einlasses auf 30 Millibar ein. Nachdem Sie die Einlässe zwei und drei wie gezeigt angeschlossen haben, stellen Sie den Druck aller Einlässe auf 20 Millibar und den Ausgangsdruck auf null Millibar ein.Stellen Sie sicher, dass die Durchflussraten in den Einlässen ungefähr gleich sind. Stellen Sie beim Wechsel des Behälters alle Eingangsdrücke auf 12 Millibar und den Ausgangsdruck auf 5 Millibar ein. Um eine Lösung schnell zu injizieren, stellen Sie den Druck des entsprechenden Einlasses auf 150 Millibar ein und stellen Sie den Druck in den anderen Einlässen auf etwa 100 Millibar ein, so dass die resultierende Durchflussrate in den Einlässen 500 Nanoliter pro Minute beträgt.Um die Lösung zu wechseln, füllen Sie 200 bis 300 Mikroliter der Lösung in ein neues Reservoirrohr und stellen Sie den Druck auf die Änderungseinstellung ein. Schrauben Sie dann das Reservoirrohr des Einlasses ab. Sobald sich an der Schlauchspitze ein kleiner Tröpfchen gebildet hat, schrauben Sie das neue Rohr mit der frischen Lösung ein und ändern Sie die Druckeinstellung auf hohen Durchfluss.Abhängig von der mikrofluidischen Konfiguration und einer Kammergeometrie warten Sie drei bis fünf Minuten, bis die Lösung den Schlauch gefüllt und die Kammer erreicht hat. Dem Prozess kann gefolgt werden, indem die Zunahme der Fluoreszenz im Laufe der Zeit gemessen wird. Für die Oberflächenfunktionalisierung wechseln Sie die Lösung drei auf 200 Mikroliter 50 picomolare Spektrin-Aktin-Samen in F-Puffer und injizieren Sie die Lösung für zwei Minuten mit hohem Durchfluss drei.Für die Oberflächenpassivierung wechseln Sie Rohr drei mit 300 Mikrolitern 5% BSA im F-Puffer, dann injizieren Sie für fünf Minuten bei hohem Durchfluss drei, gefolgt von fünf Minuten bei mittlerem Durchfluss drei, mit reduziertem Druck von sieben bis acht Millibar in den Kanälen eins und zwei, um einen Gegenstrom von 100 Nanolitern pro Minute zu erhalten. Die gesamte Kammerfläche wird BSA-passiviert. Wechseln Sie Rohr drei in F-Puffer, um den Kanal fünf Minuten lang bei hohem Durchfluss drei zu spülen.Später wechseln Sie die Röhrchen ein bis drei mit einem mikromolaren Aktinprofilin, 0,15 mikromolaren Aktin bzw. F-Puffer, wie im Manuskript erläutert, und injizieren Sie frisch zubereitete Lösungen mit dem hohen Durchfluss, der alle für drei bis vier Minuten voreingestellt ist. Schalten Sie das Mikroskop ein und stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 100 bis 200 Millisekunden, den Anregungslaser auf 10 bis 20% Leistung und die interne Totalreflexionsfluoreszenz oder TIRF-Tiefe auf 200 bis 300 Nanometer ein, um die Bilder mit einem 60-fachen Objektiv aufzunehmen. Stellen Sie als Nächstes die Druckeinstellung für 10 Minuten auf Mid Flow eins ein, um die Filamentpolymerisation mit einer Rate von einem Frame alle 20 Sekunden aufzuzeichnen, gefolgt von Mid Flow Two für 15 Minuten für die Filamentalterung.Erfassen Sie die Depolymerisation im Epifluoreszenzmodus bei einem Frame alle fünf Sekunden, nach ein bis zwei Frames, wechseln Sie zu Mid Flow drei, um Filamente aufzuzeichnen, die mit etwa 10 Untereinheiten pro Sekunde depolymerisiert werden. Um das Experiment zurückzusetzen, brechen Sie alle fluoreszierend markierten Filamente, indem Sie sie zwei Minuten lang kontinuierlich mit maximaler Leistung dem Laser aussetzen. Testen Sie verschiedene Bedingungen, indem Sie die Lösungen eins, zwei oder drei wechseln und sie drei bis vier Minuten lang bei hohem Durchfluss injizieren.Das Ergebnis des grundlegenden Polymerisations-/Depolymerisationsexperiments wird hier vorgestellt. Die resultierenden Kymographen wurden verwendet, um die Polymerisations- und Depolymerisationsraten zu quantifizieren. Wenn die gezüchteten Aktinfilamente einer fluoreszierend markierten Cofilinlösung ausgesetzt wurden, wurden Cofilin-Cluster gekeimt und wuchsen zu den spitzen und mit Widerhaken versehenen Enden.Wenn einzelne Filamente Faszin ausgesetzt werden, bilden sie Bündel, die heller erscheinen und nicht perfekt auf den Fluss ausgerichtet sind. Es ist sehr wichtig, beim Schlauchwechsel keine Luftblasen in das System einzubringen und darauf zu achten, dass die Behälterrohre nicht leer werden. Diese Technik war entscheidend, um Zugkräfte auf Dutzende von einzelnen Filamenten anzuwenden, die mechanische Empfindlichkeit von Formin und Cofilin sowie die ARP2/3-Abzweigung zu betrachten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Imaging of Podocytic Proteins Nephrin, Actin, and Podocin with Expansion Microscopy

Bildgebung der podozytischen Proteine Nephrin, Actin und Podocin mit Erweiterungsmikroskopie

Disruption of the glomerular filter composed of the glomerular endothelium, glomerular basement membrane and podocytes, results in albuminuria. Podocyte ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...